魏建宏 喬麗萍

(山西醫(yī)科大學汾陽學院，山西 汾陽 032200)

槲皮素抑制口腔鱗癌細胞增殖和遷移的機制

魏建宏 喬麗萍1

(山西醫(yī)科大學汾陽學院，山西 汾陽 032200)

目的 探討槲皮素對人類口腔鱗癌(SAS)細胞增殖和遷移的影響及其作用機制。方法 體外培養(yǎng)SAS細胞，分別加入不同濃度的槲皮素進行處理后用MTT實驗檢測細胞增殖抑制情況；采用涂有Matrigel膠的Transwell 小室模型對SAS細胞進行體外侵襲力檢測；劃痕實驗研究槲皮素對SAS細胞遷移的影響；明膠酶譜法測定SAS細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的活性；蛋白質(zhì)印跡法研究槲皮素與SAS細胞遷移和侵入相關的蛋白質(zhì)表達水平的關系。結果 槲皮素可以濃度、時間依賴性抑制SAS細胞的增殖；劃痕實驗、Transwell小室遷移實驗中，隨著槲皮素濃度提高，SAS細胞遷移數(shù)目呈遞減趨勢、細胞侵襲能力呈遞減趨勢；槲皮素可以顯著抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表達；槲皮素抑制SAS細胞中核轉錄因子(NF)-κB蛋白的表達。結論 槲皮素抑制SAS細胞生長能力，通過抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表達以及NF-κB蛋白的表達阻斷SAS細胞遷移、運動以及侵襲。

口腔鱗癌細胞；核轉錄因子；基質(zhì)金屬蛋白酶；槲皮素

口腔鱗癌(SAS)發(fā)生于口腔，是頭頸部常見的惡性腫瘤〔1〕。與SAS相關的因素有吸煙、飲酒、咀嚼檳榔、病毒感染、營養(yǎng)不良、飲食習慣和局部刺激等，其中吸煙、飲酒的危險性最大；在中國臺灣地區(qū)，咀嚼檳榔與口腔癌的發(fā)生率關系最為密切〔2〕。手術(放療或化療)是目前治療口腔癌的最主要手段，但是手術后的生存率與預后往往不能使口腔癌患者滿意，并且癌細胞還會轉移到其他器官或組織中。癌細胞轉移過程中涉及細胞的骨架蛋白，改變細胞的黏附能力，從而影響細胞的運動，包括腫瘤細胞的侵入和遷移。文獻〔3〕表明，癌細胞進行轉移時，與細胞侵襲和遷移相關的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)會過分表達，因此，使用藥物來抑制MMP和uPA(12-14)的表達或MMP酶活性(9-11)可預防癌癥的轉移。

槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤等生物學活性及很高的醫(yī)藥用途〔4〕。槲皮素可抑制多種腫瘤細胞的增殖和誘導凋亡。研究表明〔5〕，槲皮素能通過降低凋亡抑制基因β淋巴細胞瘤(Bcl)-2表達、增加促凋亡蛋白(Bax)的數(shù)量、上調(diào)腫瘤細胞抑癌基因PTEN表達及抑制環(huán)氧合酶(COX)-2的表達來發(fā)揮誘導凋亡作用；槲皮素亦能通過表皮生長因子受體(EGFR)介導抑制腫瘤細胞中MMP-9的分泌，從而抑制腫瘤細胞侵襲能力。本文旨在探討槲皮素如何抑制人SAS細胞遷移和侵襲。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 槲皮素、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、核糖核酸酶-A、考馬斯藍和Tris-HCl購自Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis，MO，USA)。Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、L-谷氨酰胺、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素和胰蛋白酶-乙二氨四乙酸(EDTA)購自Life Technologies(Carlsbad，CA，USA)。MMP-9(cat.AB19016)購自Merck Millipore(Billerica，MA，USA)，MMP-2、MMP-7、COX-2、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、活化B細胞的核因子κ輕鏈增強子(NF-κB)和二級抗體購自Cruz Biotechnology，Inc(Santa Cruz，CA，USA)，使用前在PBSTween-20中稀釋。

1.2 SAS細胞的培養(yǎng) SAS細胞系購自上海酶研生物科技有限公司，將細胞立即置于75 cm2組織培養(yǎng)瓶中，用含有10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基，然后37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，直到細胞生長至約50%～70%融合。接種于12孔板中24 h，每孔2×105個細胞，待細胞單層貼壁后，用濃度為25、50、100、150、200和400 μmol/L槲皮素處理24 h。然后收取細胞并用PI(4 μg/ml)染色，通過流式細胞術(FACS calibur流式細胞儀；BD Biosciences，San Jose，CA，USA)進行分析。

1.3 劃痕實驗 細胞在6孔板中以5×105個細胞/孔形成融合單層，然后采用Lai等〔6〕方法，用200 μl移液管尖端使細胞受傷，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，將培養(yǎng)皿中的所有細胞用濃度為0、25、50 μmol/L的槲皮素處理，然后在含有1% FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)基中溫育24 h。使用相差顯微鏡拍攝照片，于24 h觀察細胞遷移情況。通過倒置顯微鏡(OlympusIX71，Tokyo，Japan)觀察和測量每種處理的培養(yǎng)皿中空白區(qū)域，細胞遷移計算為剩余空白區(qū)域與初始傷口面積相比的百分比，每個測試進行3次。

1.4 Transwell體外遷移實驗 使用約30 μgⅠ型膠原(Merck Millipore)包被8 μm孔過濾器(Cat。PIEP12R48；Merck Millipore)1 h，將DMEM培養(yǎng)基中的細胞以2.5×104細胞/孔的密度置于Transwell上室中并加入0.5%DMSO(對照)和25、50 μmol/L槲皮素分別處理24、48 h。取出小室，取下濾膜，4℃下用5%戊二醛固定10 min，然后用2%結晶紫染液在水平搖床上染色30 min，PBS漂洗3次，棉簽擦除膜上層未穿過的細胞，將Transwell小室底面朝上置200倍顯微鏡下觀察細胞遷移情況并拍照計數(shù)。以上實驗獨立重復3次。

1.5 Transwell體外侵襲實驗 細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，3 000 r/min離心，去除培養(yǎng)液，PBS清洗2次，用含0.1% FBS的DMEM培養(yǎng)為懸浮細胞，濃度5×104細胞/孔，置于Transwell的上室中并用0.5%DMSO(作為對照)、槲皮素(25和50 μmol/L)處理。將含有10%FBS的培養(yǎng)基置于下室中，然后將細胞在37℃，5%CO2中孵育24 h，用棉簽擦除Matrigel以及上室內(nèi)細胞，室溫下多聚甲醛固定10 min，并用2%結晶紫染色10 min，清水漂洗4遍，將Transwell小室底面朝上置200倍顯微鏡下觀察細胞遷移情況并拍照計數(shù)。

1.6 MMP-2/-9活性測定 通過明膠酶譜法測定SAS細胞中MMP-2和MMP-9的活性。將細胞(2×106個細胞/孔)接種在6孔板中，并分別在濃度為10、15、20、25和50 μmol/L的槲皮素無血清DMEM培養(yǎng)基中溫育24 h，離心收集樣品，然后在含有0.1%明膠的10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上電泳分離，然后25℃下將凝膠在2.5%Triton X-100的dH2O中浸泡2次，共60 min，然后37℃下在底物緩沖液(50 μmol/L Tris HCl、5 mmol/L CaCl2、0.02%NaN3和1%Triton X-100、pH8.0)中孵育18 h。0.3%考馬斯藍在50%甲醇和10%乙酸中的陰性染色與MMP-2和-9的活性條帶進行對比。

1.7 Western印跡分析 將SAS細胞(1×106個細胞/孔)置于6孔板中，然后加入槲皮素(25和50 μmol/L)溫育(24 h、48 h)，當與培養(yǎng)物達到80%融合時收取細胞，重懸于PRO-PREP TM蛋白提取溶液(iNtRON Biotechnology，Seongnam-si，Gyeonggi-do，Korea)中。將每個樣品的勻漿于4℃下以3 000 r/min離心10 min除去細胞碎片并收集上清液，使用Bio-Rad蛋白測定試劑盒(Hercules，CA，USA)測量每個上清液樣品的總蛋白。提取總蛋白，測定蛋白濃度后每孔按40 μg蛋白上樣。將蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉移到Immobilon-P膜上(IPVH00010；Merck Millipore)。使用一抗雜交1 h，漂洗后二抗染色，使用Immobilon Western化學發(fā)光辣根過氧化物酶(HRP)底物(WBKLS0500；Merck Millipore)和X射線膠片(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)進行蛋白分析并拍照。

1.8 共聚焦激光掃描顯微鏡顯示SAS細胞中的蛋白質(zhì)易位 將細胞(5×104個細胞/孔)置于4孔板上，將濃度為25 μmol/L的槲皮素加入細胞中孵育24 h。孵育結束后，載玻片上的細胞用PBS中的4%甲醛固定15 min，然后使用2%BSA封閉非特異性結合位點，用PBS中的0.3%Triton-X 100透化1 h。

1.9 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 槲皮素對SAS細胞存活率的影響 與對照組〔(100.0±3.8)%〕相比，槲皮素處理過的SAS細胞存活明顯減少〔25、50、100、150、200、400 μmol/L組存活率分別為(82.5±6.4)%、(58.8±7.1)%、(42.5±6.6)%、(33.2±5.8)%、(31.2±7.3)%、(18.5±4.6)%,P<0.05〕，并且隨著槲皮素濃度的增加，凋亡細胞數(shù)量明顯增加，說明槲皮素與細胞凋亡數(shù)具有濃度依賴性。

2.2 槲皮素對SAS細胞遷移和侵襲的影響 見圖1。細胞遷

圖1 槲皮素對SAS細胞遷移和侵襲的影響(×200)

移實驗結果表明，與對照組(100%)相比，濃度為25、50 μmol/L槲皮素對細胞遷移具有顯著的抑制作用，并且當細胞分別用槲皮素處理24和48 h后，細胞遷移率分別為〔(56.4±4.2)%、(42.8±5.0)%〕和〔(51.9±4.4)%、(30.6±5.3)%〕，與對照組相比具有極顯著差異(P<0.001)。細胞侵襲實驗結果表明，與對照組相比，濃度為25、50 μmol/L槲皮素對細胞侵襲具有顯著的抑制作用，并且當細胞分別用槲皮素處理24、48 h后，細胞遷移率分別為〔(35.7±8.8)%、(24.5±2.8)%〕和〔(41.6±5.5)%、(35.1±4.8)%〕，與對照組相比具有極顯著差異(P<0.001)。且槲皮素對SAS細胞遷移和侵襲的抑制與濃度、作用時間有依賴性，濃度越大、作用時間越長槲皮素對SAS細胞遷移和侵襲的抑制能力越強。

2.3 槲皮素對SAS細胞劃痕的影響 見圖2。SAS細胞在0、25和50 μmol/L槲皮素中溫育0、12和24 h。與對照組相比，槲皮素處理組的SAS細胞劃痕面積較大，且不同濃度、不同作用時間槲皮素處理的SAS細胞劃痕具有顯著差異，濃度越大、作用時間越長槲皮素抑制SAS細胞劃痕的愈合能力越強。

圖2 槲皮素對SAS細胞劃痕的影響(×40)

2.4 槲皮素對SAS細胞中MMP-2和MMP-9活性的影響 槲皮素能夠抑制SAS細胞的MMP-9和MMP-2活性，并且濃度越大、作用時間越長抑制能力越強。見圖3。

2.5 槲皮素對與SAS細胞遷移和侵入相關的蛋白質(zhì)表達水平的影響 槲皮素能夠降低MMP-2、-7、-9、-10和VEGF的表達，降低NF-κB p65、iNOS、COX-2和uPA的表達。見圖4,圖5。

2.6 槲皮素對SAS細胞中NF-κB表達的影響 SAS細胞在含有25 μmol/L槲皮素條件下溫育24 h，然后用NF-κB p65標記的二抗(綠色熒光)染色，并且通過激光共聚焦顯微鏡(比例尺20 μm)檢測蛋白表達情況。結果顯示槲皮素抑制SAS細胞中NF-κB蛋白的表達。見圖6。

圖3 槲皮素對SAS細胞中MMP-2和MMP-9活性的影響

圖4 槲皮素對與SAS細胞遷移相關的蛋白質(zhì) 表達水平的影響

圖5 槲皮素對與SAS細胞侵入相關的蛋白質(zhì) 表達水平的影響

圖6 槲皮素對SAS細胞中NF-κB表達的影響(×400)

3 討 論

淋巴結擴散和遠處轉移相關的高發(fā)生率是導致SAS預后不良的根本原因。槲皮素是一種在自然界廣泛分布的黃酮類化合物，其抗腫瘤及抗氧化方面的作用受到國內(nèi)外學者的廣泛關注。近年來研究發(fā)現(xiàn)〔7〕，槲皮素能夠抑制多種腫瘤細胞的分裂和增殖，通過多種途徑促進其凋亡，抑制腫瘤細胞遷移及侵襲。但對SAS癌細胞遷移轉移能力的影響以及機制研究較少，因此，本研究探討了槲皮素對SAS口腔癌細胞遷移和侵襲的影響，測定SAS口腔癌細胞遷移潛力，為抑制腫瘤細胞增殖、促進其凋亡、抗腫瘤血管生成等提供科學依據(jù)。

有研究表明〔8〕，癌細胞的遷移和侵入涉及MMP的表達，MMP-2和MMP-9可以降解Ⅳ型膠原，破壞細胞外基質(zhì)的降解平衡，使癌細胞容易突破細胞外基質(zhì)以及基底膜，從而使癌細胞發(fā)生侵襲和轉移。因此，抑制MMP-2和MMP-9表達或酶活性可以用作預防癌癥轉移的早期靶標。本實驗發(fā)現(xiàn)，槲皮素對SAS細胞的抑制作用具有濃度和時間依賴性，濃度越高、時間越

長其抑制能力越強，并且槲皮素通過抑制MMP-2和MMP-9的活性和表達來抑制SAS細胞的遷移和侵襲，從而抑制了腫瘤的轉移。

NF-κB家族中p65的含量最豐富，p65/p50最早被發(fā)現(xiàn)而且也是存在最廣泛的二聚體形式，可以調(diào)控下游多種靶基因的轉錄活性，參與細胞多種重要的生命活動〔9〕。細胞在靜息狀態(tài)下處于無活性狀態(tài)，當細胞受到如寄生蟲、病毒等生物因素刺激時，p50/p65 釋放出來進入細胞核中，與基因上κB 結合位點特異性結合，成為活化的NF-κB信號通路，并且上調(diào)下游的靶基因環(huán)氧化酶(COX)-2，進而促進了腫瘤細胞的增殖和分化。本研究表明，槲皮素能夠減少NF-κB蛋白的表達水平，使NF-κB信號通路的活性降低，并且下調(diào)下游的靶基因COX-2的活性，阻斷信號通路，從而抑制了SAS口腔癌細胞的增殖和分化。

綜上所述，槲皮素以濃度、時間依賴性方式抑制MMP-2和-9的活性，從而抑制SAS細胞中遷移和侵入的可能信號途徑；槲皮素通過減少NF-κB蛋白的表達水平，阻斷COX-2的信號通路，從而抑制了SAS細胞的增殖和分化。

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〔2017-01-22修回〕

(編輯 袁左鳴)

魏建宏(1972-)，男，碩士生導師，副教授，主要從事神經(jīng)毒理研究。

R73

A

1005-9202(2017)11-2646-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.020

1 山西省汾陽醫(yī)院口腔科