包軍，張名岳，李想，劉洪貴，李劍虹，高利，張曉卉，王博

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；4.哈爾濱工業(yè)大學(xué)校醫(yī)院，哈爾濱150001）

死亡時(shí)間對(duì)雌性仔豬腦海馬組織影響

包軍1，張名岳1，李想1，劉洪貴1，李劍虹2，高利3，張曉卉2，王博4

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；4.哈爾濱工業(yè)大學(xué)校醫(yī)院，哈爾濱150001）

為研究母豬腦海馬死亡后變化情況，試驗(yàn)以同一遺傳背景（杜×長×大）、體重及出生日齡相近的健康雌性仔豬作研究對(duì)象，采用核磁共振成像檢測(cè)及光鏡技術(shù)，檢測(cè)母豬麻醉狀態(tài)與死后10 min、1、2、3、6和10 h時(shí)段左側(cè)、右側(cè)海馬體積，觀察兩側(cè)海馬齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞形態(tài)，建立母豬死后海馬形態(tài)學(xué)變化模型，為長期處于應(yīng)激狀態(tài)下妊娠母豬心理疾病的核磁共振診斷提供理論依據(jù)。核磁檢測(cè)結(jié)果表明，仔豬死亡10 h內(nèi)，與活體對(duì)照組海馬體積比較，左側(cè)海馬體積無顯著變化（P=0.901）；右側(cè)及總海馬體積在死亡3 h內(nèi)無顯著性變化（右側(cè)P= 0.078；總P=0.104），但從死亡6 h開始顯著變小（右側(cè)P＜0.01；總P＜0.05）；光鏡觀察表明，仔豬死亡3 h內(nèi)，左側(cè)及右側(cè)海馬齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞形態(tài)與活體對(duì)照組相比，均未發(fā)生嚴(yán)重?fù)p害。死亡3 h內(nèi)，仔豬腦海馬組織無顯著生理變化。

核磁共振成像；雌性仔豬；海馬體積；顆粒細(xì)胞；死亡時(shí)間

集約化生產(chǎn)可提高畜禽生產(chǎn)力水平和經(jīng)濟(jì)效益。但過于注重簡化管理、降低成本和提高生產(chǎn)效率，會(huì)嚴(yán)重抑制動(dòng)物本能行為，造成慢性及急性應(yīng)激反應(yīng)，畜禽體質(zhì)下降，降低生產(chǎn)性能、畜禽福利及畜產(chǎn)品品質(zhì)，危害人類健康。在豬養(yǎng)殖方面，妊娠母豬限位飼養(yǎng)易形成慢性應(yīng)激[1]，長期限位飼養(yǎng)可導(dǎo)致妊娠母豬無法正常表達(dá)行為與動(dòng)機(jī)[2]，影響母豬行為、生理和心理[3-5]，嚴(yán)重危害母豬福利狀況[6-8]。

研究表明，應(yīng)激是引起人類心理疾?。ㄒ钟舭Y）主要病因[9-10]，造成腦部結(jié)構(gòu)改變[11-13]。其中腦海馬體是最易受應(yīng)激損害的腦部邊緣系統(tǒng)組織，應(yīng)激導(dǎo)致抑郁類心理疾病表現(xiàn)為海馬神經(jīng)元萎縮，海馬體積減小[8]。Lv等研究發(fā)現(xiàn)，長期限位飼養(yǎng)妊娠母豬腦海馬體等區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞呈明顯炎癥反應(yīng)[14]。Staay等研究結(jié)果表明，長期慢性應(yīng)激導(dǎo)致母豬產(chǎn)生類似人類抑郁癥狀[8]。核磁共振成像技術(shù)（MRI）是檢測(cè)因心理類疾?。ㄈ缫钟舭Y、焦慮癥、阿爾茲海默病等）導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)異常的重要手段[15]。長期限位飼養(yǎng)的妊娠期經(jīng)產(chǎn)母豬易出現(xiàn)類似抑郁的心理疾病，但因體積、體重過大，難以完成核磁共振成像檢測(cè)。因此，本文探討在短時(shí)間內(nèi)將母豬頭部取下作離體核磁共振檢測(cè)，替代活體狀態(tài)檢測(cè)的可行性[16]。

本試驗(yàn)以體型和體重較小雌性仔豬為研究對(duì)象，采用核磁共振檢測(cè)及光鏡技術(shù)，檢測(cè)母豬麻醉狀態(tài)與死后10 min、1、2、3、6和10 h時(shí)段左側(cè)、右側(cè)海馬組織體積，觀察海馬齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞形態(tài)，建立母豬死后海馬形態(tài)學(xué)變化模型，為長期處于應(yīng)激狀態(tài)下妊娠母豬心理疾病的核磁共振診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 仔豬選擇與麻醉

試驗(yàn)用雌性仔豬購自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧科技園區(qū)，遺傳背景相同（杜×長×大），體重（10 kg±2.5）及出生日齡（20 d±2）相近，相同福利型產(chǎn)圈中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)一致。

隨機(jī)選擇3頭健康試驗(yàn)仔豬，肌肉注射麻醉劑（由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院提供）在3～5 min內(nèi)將仔豬麻醉（劑量為0.01 mL·kg-1），無應(yīng)激狀態(tài)運(yùn)至哈爾濱工業(yè)大學(xué)醫(yī)院作核磁共振檢測(cè)。待深度麻醉后，將其平放在操作臺(tái)上，保證檢測(cè)對(duì)象頭部垂直于機(jī)器冠狀面[17]。

1.2 核磁共振檢測(cè)

核磁檢測(cè)使用飛利浦1.5T核磁共振儀（飛利浦醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，德國），采取腦部冠狀面T1W-IR CLEAR序列掃描，掃描層數(shù)24層，層厚3 mm；層間距0；掃描參數(shù)為：TR=1 838 ms，TE=15 ms，翻轉(zhuǎn)角90°，體素尺寸=0.83 mm×1.04 mm×3 mm，NSA=1，F(xiàn)OV（視野）=200 mm×187 mm×72 mm，矩陣體積=240 mm×175 mm×208 mm，圖像以DICOM格式傳至電腦作體積描繪與計(jì)算。于矢狀面T1WI定位相，選擇海馬體顯示最佳層面，掃描線垂直海馬體長軸，從顳極到海馬體尾后方范圍，垂直于海馬體長軸傾斜冠狀面液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列（FLAIR）T2WI成像，成像參數(shù)為TR=8 000 ms，TI=1 700 ms，TE=125 ms，NSA=3，層厚3 mm，無間隔，層數(shù)24。

每個(gè)離體檢測(cè)時(shí)段，隨機(jī)選取3頭仔豬，待麻醉后立即安樂處死，迅速取下頭部，血跡處理完畢后分別于死后10 min，1、2、3、6和10 h內(nèi)作離體腦部核磁共振檢測(cè)，檢測(cè)方法、參數(shù)選擇與活體檢測(cè)均保持一致。檢測(cè)等待期，豬頭部置于8℃恒溫冷藏間保存[18]。

1.3 體積計(jì)算

運(yùn)用Philips DICOM Viewer（R2.5版）中ROI體積分析功能。打開矢狀面、冠狀面、橫軸面及斜冠狀面4個(gè)視窗，調(diào)節(jié)窗寬、窗位至灰白質(zhì)對(duì)比明顯，用鼠標(biāo)按照上述標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合矢狀面、冠狀面、軸面三維圖像在斜冠狀面上逐層勾畫海馬體邊界[19-20]。由一名經(jīng)訓(xùn)練具備豬腦部解剖學(xué)知識(shí)的神經(jīng)影像學(xué)家統(tǒng)一評(píng)定。評(píng)定程序約30 min，兩次重復(fù)。獲得被試海馬組織體積原始數(shù)據(jù)后，為消除頭顱體積差異對(duì)上述結(jié)構(gòu)體積數(shù)據(jù)影響，需標(biāo)準(zhǔn)化校正海馬組織原始體積。顱腔內(nèi)體積是較好校正因素[21]。通過顱腔內(nèi)徑線可推算顱腔內(nèi)體積[22]，本研究通過前后徑（在T2WI軸面及矢狀面上經(jīng)大腦前后聯(lián)合線（AC-PC線）連接額極與枕極顱骨內(nèi)板間距離）、上下徑（在T2WI軸面及矢狀面上，以枕骨大孔前下緣為定點(diǎn)，經(jīng)AC-PC線中點(diǎn)至頂骨內(nèi)板間距離）和左右徑（在AC-PC線層面的水平面上，垂直于該線經(jīng)中點(diǎn)至左、右兩側(cè)顱骨內(nèi)板間距離）的乘積推算顱腔內(nèi)體積（見圖1）。

按Cendes等提出計(jì)算方法（下簡稱Cendes法）對(duì)原始數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)化處理V標(biāo)=V原×V均/Vn。其中，V標(biāo)為海馬體標(biāo)準(zhǔn)化后體積；V原為海馬體原始體積；V均為平均顱腔體積；Vn為被測(cè)顱腔體積。然后再比較標(biāo)準(zhǔn)化后海馬體積。

圖1 顱腔內(nèi)部徑線Fig.1Diameter parameters of cranial cavity

1.4 齒狀回區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)

核磁共振檢測(cè)完畢后立即解剖取腦，取0.5 g海馬齒狀回組織置于裝有4%多聚甲醛固定液EP管中，4°C冰箱過夜，腦組織包埋在石蠟中（BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)，常州中威儀器公司），切成5 um厚切片（石蠟切片機(jī)，Leica RM2125-RTS，徠卡生物醫(yī)用公司，德國），在二苯甲中脫蠟，浸入一系列等級(jí)乙醚中（100%，95%，85%和75%）水化，用中性膠封片，利用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

SPSS 23.0軟件作統(tǒng)計(jì)分析（IBM公司，Chicago，USA），所得左側(cè)、右側(cè)及總海馬體積數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)下的柯爾莫諾夫-斯米爾諾夫檢驗(yàn)過程作正態(tài)檢驗(yàn)，用均值比較下的單因素方差分析檢驗(yàn)死亡時(shí)間對(duì)海馬體積影響，采用Duncan's多重檢驗(yàn)法比較各死亡時(shí)段與活體麻醉狀態(tài)海馬體積，設(shè)定顯著水平P=0.05。

2 結(jié)果與分析

由圖2～4可知，與活體狀態(tài)相比，各死亡時(shí)段仔豬腦顱腔體積無顯著性變化（P=0.342）；隨著死亡時(shí)間增加（死亡10 h內(nèi)），母豬左側(cè)海馬體積呈先增后減趨勢(shì)，但與活體狀態(tài)相比，未發(fā)生顯著變化（P=0.108）；而右側(cè)及總海馬體積則顯著減?。ㄓ覀?cè)P＜0.05；總P＜0.05）。其中，與活體狀態(tài)相比，死亡6 h后，右側(cè)海馬體積極顯著減?。≒＜0.01），死亡10 h后，總海馬體積顯著減?。≒＜0.05）。采用Philips DICOM Viewer程序，根據(jù)豬腦部解剖學(xué)經(jīng)驗(yàn)及手工測(cè)量法，在每一層出現(xiàn)海馬體的腦斜冠狀位核磁共振成像圖像中勾畫海馬體輪廓（見圖5）。

圖2 死亡時(shí)間對(duì)左側(cè)海馬體積影響Fig.2Effect of postmortem interval on the left hippocampal volume

圖3 死亡時(shí)間對(duì)左側(cè)海馬體積影響Fig.3Effect of postmortem interval on the right hippocampal volume

圖4 死亡時(shí)間對(duì)總海馬體積影響Fig.4Effect of postmortem interval on the total hippocampal volume

比較活體狀態(tài)冠狀面液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列（FLAIR）和T2加權(quán)像快速自旋回波序列掃描（T2WTSE）檢測(cè)結(jié)果表明，各死亡時(shí)段腦部未發(fā)現(xiàn)海馬體硬化跡象。由光鏡結(jié)果可知，死亡3 h內(nèi)，左側(cè)及右側(cè)海馬體齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量均無明顯變化（見圖6、7），但死亡6 h后，右側(cè)海馬體齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)大量空泡現(xiàn)象，死亡10 h時(shí)段最明顯（見圖7）。

圖5 海馬體冠狀面T1W-IR CLEAR掃描圖像變化Fig.5Coronal plane of hippocampals scaning by T1W-IR CLEAR

圖6 死亡時(shí)間對(duì)左側(cè)海馬體齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)的光鏡觀察（100倍）Fig.6Effect of postmortem interval on granule cells morphology structure in the left hippocampal DG region(×100)

圖7 死亡時(shí)間對(duì)右側(cè)海馬體齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)的光鏡觀察（100倍）Fig.7Effect of postmortem interval on granule cells morphology structure in the right hippocampal DG region(×100)

3 討論

仔豬死后腦海馬體積變化主要原因有內(nèi)在生理和外在環(huán)境兩方面。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著死亡時(shí)間延長，無論是仔豬左側(cè)、右側(cè)還是總海馬體積均逐漸減小，說明血液循環(huán)停止后，體內(nèi)缺乏氧氣，細(xì)菌滋生造成腦細(xì)胞逐漸死亡并發(fā)生系列復(fù)雜化學(xué)及生物反應(yīng)，符合死亡后尸體腐化規(guī)律。而仔豬死亡2 h，海馬體積突然變大，但變化不明顯，原因是隨著腦脊液流失，尸僵現(xiàn)象逐漸緩解。仔豬死亡3 h內(nèi)，左側(cè)、右側(cè)及總海馬體積與活體狀態(tài)相比，均未發(fā)生顯著性改變，且在該段時(shí)間內(nèi)，通過光鏡觀察海馬體齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量無顯著性改變。說明死亡3 h內(nèi)，外界環(huán)境未對(duì)海馬體積造成明顯生理損害，說明顱骨對(duì)顱腔內(nèi)腦組織有暫時(shí)保護(hù)作用，外界環(huán)境變化不會(huì)在短時(shí)間內(nèi)對(duì)腦組織造成顯著影響[16]。

另外，年齡增加及由應(yīng)激引起神經(jīng)疾病導(dǎo)致腦海馬體積減小[23]。其中，以海馬體硬化為基本癥狀的疾?。ㄈ绨d癇等）海馬體積顯著改變。因?yàn)楹ｑR體硬化主要病理特征是神經(jīng)元丟失[24]，海馬體積萎縮，核磁共振成像表現(xiàn)為海馬體積減小[25]。為排除內(nèi)在神經(jīng)類疾病對(duì)腦海馬體積變化影響，本試驗(yàn)在常規(guī)TSE、IR序列核磁共振檢測(cè)基礎(chǔ)上加入FLAIR序列檢測(cè)。結(jié)果表明，在所有海馬體MRI圖像中，與活體相比，無論是左側(cè)還是右側(cè)海馬體在各死亡時(shí)段均未發(fā)現(xiàn)硬化等疾病癥狀、海馬體內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)也無明顯變化。但在細(xì)胞層面上，從仔豬死亡6 h開始，右側(cè)海馬體齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量均發(fā)生明顯病理性改變。

與活體狀態(tài)仔豬海馬體積相比，左側(cè)海馬體積在死亡10 h內(nèi)未發(fā)生明顯改變，而右側(cè)海馬體積在死亡3 h內(nèi)變化不明顯，死亡6 h后變化較大。說明個(gè)體死后血液輸送氧氣途徑中斷造成腦組織缺氧，大腦神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞死亡，腦組織發(fā)生軟化、液化，但本試驗(yàn)中左側(cè)與右側(cè)海馬體積變化趨勢(shì)不一致，原因是死亡缺氧時(shí)間不足，左側(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞未完全死亡。但與活體狀態(tài)MRI圖像相比，在每一層海馬體MRI圖像上均未發(fā)現(xiàn)明顯解剖學(xué)細(xì)節(jié)改變，推測(cè)與海馬體功能性MRI的T1和T2信號(hào)變化有關(guān)。功能性MRI檢測(cè)本試驗(yàn)尚未涉及。Gyorffy-Wagner等應(yīng)用質(zhì)子磁共振（MR）技術(shù)觀察豬離體腦組織隨時(shí)間延長其弛張時(shí)間T1規(guī)律性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，死亡96 h內(nèi)，豬腦組織T1信號(hào)未隨死亡時(shí)間增加而發(fā)生明顯改變[18]。而Jelsing等麻醉后仔豬腦部MRI檢測(cè)與死后不同時(shí)段腦部各組織物理切片顯微鏡觀察對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從死亡到觀察結(jié)束（30 min～1 h），包括全腦、大腦皮質(zhì)、腦白質(zhì)、腦灰質(zhì)及小腦，無論是MRI活體還是死后檢測(cè)，體積均無顯著性變化[26]，證明基于MRI技術(shù)的腦部體積計(jì)算與死亡后物理切片腦組織體積計(jì)算結(jié)果一致。

由于條件有限，本試驗(yàn)未作海馬體功能性核磁共振成像（fMRI）檢測(cè)。目前在體積分析MRI應(yīng)用中，運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件技術(shù)，基于體素的海馬體形態(tài)學(xué)分析以及圖譜自動(dòng)分割法測(cè)量海馬體積方法，在人類腦神經(jīng)影像學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。后續(xù)研究將在豬海馬體積分析中運(yùn)用計(jì)算機(jī)自動(dòng)分割技術(shù)，提高運(yùn)算速度、精度。

綜上所述，本試驗(yàn)在死亡時(shí)間3 h內(nèi)、尸體頭部處理得當(dāng)情況下，死亡并未對(duì)仔豬腦部海馬組織造成明顯生理性損害。

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Effect of postmortem interval on female piglet hippocampal change/

BAO Jun1,ZHANG Mingyue1,LI Xiang1,LIU Honggui1,LI Jianhong2,GAO Li3,ZHANG Xiaohui1, WANG Bo4(1.School of Animal Science and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.School of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 3.School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;4.Hospital, Harbin Institute of Technology,Harbin 150001,China)

In order to study the changes of hippocampus in female piglets during death,in this study,healthy female crossbred piglets(Duroc×Landrace×Large White)with similar age and weight were the experimental animals.The left,right-side and total hippocampal volumes were scanned with Philips 1.5-T MR scannerin vivoand at 10 min,1,2,3,6 and 10 h after death.After MRI detecting and observe the morphology of granulosa cells in dentate gyrus of hippocampus by using light microscope. The results showed that within 10 h after death,the size of the hippocampus on the left side of the piglet did not change significantly with the increase of the time of death(P=0.901)compared with that of the anesthesia piglets,and the volume of the right and the total hippocampus did not change significantly within 3 h after death(right:P=0.078;total:P=0.104),while the right and the total hippocampal volumesshowed a significant decrease after 6 h postmortem(P＜0.01;P＜0.05).At the same time,compared with the living control group,within 3 h after death,the granulocyte morphology of the left and right hippocampal dentate gyrus did not occur the phenomenon of serious damage with the increase of postmortem interval.In conclusion,within 3 h postmortem,the death did not cause significant physical damage to the hippocampus of the female piglet in the case of the head corpse treated properly.

magnetic resonance imaging(MRI);female piglet;hippocampal volume;granulosa cell;postmortem interval

S858.28

A

1005-9369（2017）05-0042-08

時(shí)間2017-5-23 12:29:10[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170523.1229.010.html

包軍,張名岳,李想,等.死亡時(shí)間對(duì)雌性仔豬腦海馬組織影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,48(5):42-49.

Bao Jun,Zhang Mingyue,Li Xiang,et al.Effect of postmortem interval on female piglet hippocampal change[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(5):42-49.(in Chinese with English abstract)

2017-03-15

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31472131/C170109）

包軍（1961-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物行為與福利。E-mail:jbao@neau.edu.cn