陳紅運(yùn)，宋全厚，2，*，尹建軍，2，侯玉柱，2，劉秀，2

（1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；2.國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100027）

有機(jī)干擾物對(duì)超氧化電位水殺菌效果影響研究

陳紅運(yùn)1，宋全厚1，2，*，尹建軍1，2，侯玉柱1，2，劉秀1，2

（1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；2.國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100027）

試驗(yàn)以牛血清白蛋白（BSA）為有機(jī)干擾物質(zhì)，大腸桿菌為滅菌對(duì)象，通過(guò)懸液定量殺菌試驗(yàn)和理化分析方法研究有機(jī)干擾物質(zhì)對(duì)超氧化電位水（NEOW）殺菌效果影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示：在不含有機(jī)干擾物時(shí)，NEOW作用30s，能夠?qū)⒕鋽?shù)對(duì)數(shù)值為7.76的大腸桿菌完全殺滅。用無(wú)菌水對(duì)NEOW稀釋后，pH和氧化還原電位（ORP）變化不明顯，有效氯濃度（ACC）隨著稀釋度的增加而降低，但稀釋至60%時(shí)同樣保持快速殺滅能力。在干擾物作用下，隨著B(niǎo)SA濃度增加，NEOW殺菌效果降低。但NEOW在低濃度BSA的干擾下，可以通過(guò)增加殺菌時(shí)間或者增加有效氯濃度達(dá)到殺菌效果；在高濃度BSA的干擾下，需要對(duì)消毒環(huán)境進(jìn)行預(yù)先清洗降低干擾物的量再進(jìn)行消毒。

有機(jī)干擾物；大腸桿菌；超氧化電位水；殺菌效果

氧化電位水具有快速、廣譜殺菌效果以及低殘留、無(wú)毒副作用等正越來(lái)越多在農(nóng)業(yè)、生活中得到應(yīng)用[1-7]。然而在實(shí)際消毒過(guò)程中，消毒對(duì)象表面往往含有較多油脂、蛋白質(zhì)以及產(chǎn)品碎片等有機(jī)物，有文獻(xiàn)表明這些物質(zhì)會(huì)降低氧化電位水的殺菌效果[8-10]。2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》[11]以及GB28234-2011《酸性氧化電位水生成器安全與衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[12]規(guī)定在研究消毒劑的殺菌效果時(shí)，使用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為有機(jī)干擾物，以其濃度的大小作為代表消毒對(duì)象的清潔狀況。因此實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌為滅菌對(duì)象，以牛血清白蛋白為有機(jī)干擾物質(zhì)，研究清潔條件（無(wú)干擾物）及不同濃度有機(jī)干擾物對(duì)發(fā)酵院自行研制的超氧化電位水生成裝置制備的電位水殺菌效果的影響，同時(shí)研究不同種類物質(zhì)對(duì)超氧化電位水理化特性的影響，為其實(shí)際應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)水乙醇，山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司；氯化鈉、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉、硫代硫酸鈉，北京化工廠；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨、吐溫80，北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白、聚醚砜濾膜（孔徑0.22 μm），北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)指示菌

大腸桿菌（CICC10389），購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 儀器與設(shè)備

超氧化電位水生成器：中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院自行研制；雙路pH/ORP控制器：杭州聯(lián)測(cè)自動(dòng)化技術(shù)有限公司；消毒液有效氯檢驗(yàn)試紙：廣州達(dá)元綠洲食品安全科技股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 NEOW的制備

NEOW生成器在電解電流40A、出水流量500L/h、無(wú)隔膜電解槽條件下電解質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的NaCl溶液，制備得到NEOW。用雙路pH/ORP控制器測(cè)定其pH值和氧化還原電位（oxidation reduction potential，ORP），用消毒液有效氯檢驗(yàn)試紙測(cè)定其有效氯濃度（available chlorine concentration，ACC）。

1.4.2 0.22 μm的聚醚砜濾膜過(guò)濾BSA

由于BSA是一種蛋白質(zhì)，其溶液不能高壓滅菌，實(shí)驗(yàn)采用0.22μm的聚醚砜濾膜對(duì)配制的BSA進(jìn)行過(guò)濾，用紫外分光光度法測(cè)定過(guò)濾后BSA濃度[13]，同時(shí)按GB 4789.2-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》方法觀察過(guò)濾后的樣液是否含有雜菌[14]。

1.4.3 中和劑鑒定試驗(yàn)

在評(píng)價(jià)NEOW的殺菌效果時(shí)，作用到規(guī)定時(shí)間后必須終止殘留NEOW的消毒作用，因此需要選擇適當(dāng)?shù)闹泻蛣?。試?yàn)選擇中和劑組成為0.8%的硫代硫酸鈉+0.5%的吐溫80的磷酸鹽緩沖液（pH7.2～7.4），鑒定程序按照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》中2.1.1.5.5步驟進(jìn)行，設(shè)計(jì)6組，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為第一組無(wú)菌生長(zhǎng)或少于第二組；第二組菌數(shù)遠(yuǎn)小于第三、四、五組；第三、四、五組間菌數(shù)誤差不超過(guò)15%；第六組無(wú)菌生長(zhǎng)。

1.4.4 懸液定量殺菌試驗(yàn)

將試管斜面保存的大腸桿菌接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，然后用10 mL胰蛋白胨生理鹽水（TPS）洗下菌苔，經(jīng)過(guò)10倍稀釋后得到濃度為1×107cfu/mL～9×107cfu/mL的菌懸液。將NEOW與無(wú)菌蒸餾水以體積比混合均勻，得到80%、60%、40%的稀釋液，然后參照2002版《消毒技術(shù)規(guī)范》2.1.1.7.4對(duì)大腸桿菌進(jìn)行懸液定量殺菌操作。BSA對(duì)NEOW影響試驗(yàn)，是將菌懸液與BSA對(duì)倍稀釋后代替原始菌懸液，然后按照上述步驟進(jìn)行。作用完成后以GB4789.2-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》法測(cè)定樣液殘留的細(xì)菌總數(shù)，然后計(jì)算滅菌對(duì)數(shù)值（對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值-試驗(yàn)組活菌濃度對(duì)數(shù)值）。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（a±SD）表示，采用組間t檢驗(yàn)，P< 0.05具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚醚砜濾膜對(duì)BSA過(guò)濾結(jié)果

孔徑為 0.22 μm聚醚砜濾膜對(duì) 3、5、10 mg/mL BSA過(guò)濾結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 孔徑為0.22 μm聚醚砜濾膜對(duì)3、5、10 mg/mL BSA過(guò)濾結(jié)果Table 1 Results of 3，5，10 mg/mL BSA filtration with a pore size of 0.22 μm PES membrane

由表1可見(jiàn)，孔徑為0.22 μm聚醚砜濾膜對(duì)BSA過(guò)濾后，其濃度分別從3、5、10 mg/mL，上升為3.27、5.30、11.00 mg/mL，變化不顯著（P＞0.05）且濾液不含雜菌，因此孔徑為0.22 μm聚醚砜濾膜適合對(duì)BSA進(jìn)行過(guò)濾。

2.2 中和劑鑒定試驗(yàn)

中和劑鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 中和劑鑒定結(jié)果Table 2 The result of verification test for neutralizer

由表2可見(jiàn)，第一組菌落數(shù)遠(yuǎn)少于第二組，第三、四、五組組間誤差率為9.25%<15%。因此0.8%的硫代硫酸鈉+0.5%的吐溫80的磷酸鹽緩沖液（pH7.2～7.4）能夠有效中和NEOW原液對(duì)大腸桿菌的滅菌作用，并且中和劑、中和產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響（P>0.05），符合2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》要求。

2.3 在清潔條件下，不同稀釋度NEOW對(duì)大腸桿菌殺滅效果

用無(wú)菌水將NEOW以體積比分別稀釋至80%、60%、40%，然后對(duì)不同稀釋度NEOW按照1.4.4懸液定量殺菌步驟進(jìn)行，理化指標(biāo)及殺菌效果見(jiàn)表3。

表3 NEOW不同稀釋度理化指標(biāo)變化及殺菌效果Table 3 Changes of physical and chemical indexes of different dilution degree and germicidal efficacy of NEOW

由表3可知：NEOW在40%稀釋范圍內(nèi)，ORP和pH變化不明顯，ACC隨著稀釋倍數(shù)的增加而降低。NEOW原液在60%稀釋度內(nèi)，作用30 s可將大腸桿菌完全殺滅。稀釋至40%時(shí)，盡管NEOW保持高ORP值，但滅菌對(duì)數(shù)值僅為1.95，遠(yuǎn)低于其他稀釋度殺菌效果；但將NEOW使用量提升至9 mL后，在30 s內(nèi)也能將大腸桿菌完全殺滅（結(jié)果沒(méi)有顯示）。由此可見(jiàn)，NEOW對(duì)大腸桿菌殺滅能力極強(qiáng)，但在低有效氯條件下，僅靠高ORP不能發(fā)揮快速殺菌作用，需要增加電位水的使用量或者提高有效氯濃度達(dá)到快速的殺菌效果。

2.4 BSA對(duì)NEOW殺菌效果影響

3 mg/mLBSA對(duì)不同稀釋度超氧化電位殺菌效果影響見(jiàn)表4。

表4 3 mg/mL BSA對(duì)不同稀釋度超氧化電位殺菌效果Table 4 Under 3 mg/mL BSA，germicidal efficacy of different dilution degree of NEOW

由表4可知，在3 mg/mLBSA干擾下，隨著稀釋倍數(shù)的增加，在相同時(shí)間內(nèi)滅菌效果逐漸降低，但在相同稀釋度時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，殺菌效果增強(qiáng)；NEOW原液作用3 min及80%稀釋范圍內(nèi)作用5 min即可達(dá)到殺菌效果。5 mg/mL和10mg/mLBSA對(duì)超氧化電位原液殺菌效果影響見(jiàn)表5。

表5 5 mg/mL和10 mg/mLBSA對(duì)超氧化電位原液殺菌效果Table 5 Under 5 mg/mL and 10 mg/mL BSA，germicidal efficacy of NEOW

由表5可知，隨著B(niǎo)SA濃度增加，NEOW殺菌效果顯著減低，在5 mg/mLBSA干擾下，NEOW原液作用時(shí)間需提高到20 min才能達(dá)到殺菌效果，而在10 mg/mL BSA干擾下殺菌效果較差。與表3中不含BSA殺菌效果比較，BSA能夠干擾NEOW的殺菌能力，但在低濃度BSA的干擾下，可以通過(guò)增加殺菌時(shí)間或者增加有效氯濃度達(dá)到殺菌效果。但在高濃度BSA的干擾下，需要對(duì)消毒環(huán)境進(jìn)行預(yù)先清洗降低干擾物的量從而達(dá)到殺菌效果。

2.5 BSA對(duì)NEOW理化指標(biāo)影響

為研究BSA降低NEOW消毒效果的機(jī)理，將無(wú)菌BSA和NEOW原液混合，攪拌混勻后測(cè)定其pH、ACC、ORP。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 BSA對(duì)NEOW理化指標(biāo)影響Table 6 Changes of physical and chemical indexes of NEOW of BSA

由表6可知：在不含菌懸液條件下，其ACC和ORP急劇下降，并且BSA濃度越高，下降越顯著；而pH基本無(wú)變化。3 mg/mL BSA時(shí)，ACC濃度由50 mg/L下降到20 mg/L，ORP由799 mV下降到472 mV。將BSA提升至10 mg/mL后，ACC僅為5 mg/L，ORP為307 mV。表明BSA能夠與NEOW的有效殺菌成分反應(yīng)，使ACC和ORP值大幅度下降，導(dǎo)致NEOW殺菌效果顯著降低。

2.6 其他物質(zhì)對(duì)NEOW理化指標(biāo)影響

消毒環(huán)境中往往含有多種雜質(zhì)，可能會(huì)改變NEOW的理化特性進(jìn)而影響消毒效果，因此研究不同物質(zhì)對(duì)NEOW的理化指標(biāo)影響，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 不同物質(zhì)對(duì)NEOW理化指標(biāo)影響Table 7 Changes of physical and chemical indexes of NEOW of different substances

由表7可知，蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素類能夠?qū)EOW的ORP和ACC大幅度降低，進(jìn)而降低殺菌效果；有機(jī)酸、碳水化合物、油脂對(duì)ORP和ACC的影響較??；礦物質(zhì)類中具有還原性的物質(zhì)如硫酸亞鐵能夠?qū)⒂行冗€原、強(qiáng)氧化物質(zhì)如重鉻酸鉀能夠?qū)⒂行妊趸筄RP、ACC、pH變化較大，而中性的硫酸鎂對(duì)理化特性影響較小。不同物質(zhì)對(duì)NEOW的理化特性影響不同，因此在實(shí)際消毒時(shí)，可根據(jù)消毒環(huán)境干擾物的種類及所占比例選擇適宜濃度和使用量的NEOW。

3 結(jié)論

曾新平[15]，Eun-JinPark[16]，VicenteM[17]等學(xué)者很早對(duì)BSA對(duì)氧化電位水的殺菌效果進(jìn)行研究，但其研究只是針對(duì)酸性氧化電位水，也沒(méi)有進(jìn)一步研究有機(jī)物及各種物質(zhì)對(duì)NEOW理化特性影響。本實(shí)驗(yàn)按照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》研究有機(jī)物對(duì)NEOW殺菌效果影響，試驗(yàn)結(jié)果表明在不含有機(jī)干擾物時(shí)，發(fā)酵院自行研制的NEOW具有快速滅菌能力。NEOW可以通過(guò)增加殺菌時(shí)間或者有效氯濃度抵抗低濃度的BSA干擾。但在高濃度BSA的干擾下，需要對(duì)消毒環(huán)境進(jìn)行預(yù)先清洗降低干擾物的量從而達(dá)到殺菌效果。不同種類物質(zhì)對(duì)NEOW的3個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)pH、ACC、ORP的影響不同，因此可根據(jù)消毒環(huán)境干擾物的種類及所占比例選擇適宜濃度和使用量的NEOW。本研究對(duì)超氧化電位水在實(shí)際應(yīng)用時(shí)具有指導(dǎo)意義。

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Study on the Influence of Organic Interfering Substance on Germicidal Efficacy of Neutral Electrolyzed Oxidizing Water

CHEN Hong-yun1，SONG Quan-hou1，2，*，YIN Jian-jun1，2，HOU Yu-zhu1，2，LIU Xiu1，2
（1.China National Research Institute of Food&Fermentation Industries，Beijing 100027，China；2.National Center for Food Quality Supervision and Testing，Beijing 100027，China）

Bovine serum albumin（BSA）was as organic interfering substances，Escherichia coli was for sterilization object in the laboratory.Suspension quantitative germicidal test and physicochemical analysis method were carried out to observe the influence of organic interfering substance on germicidal efficacy of neutral electrolyzed oxidizing water（NEOW）.The results showed that when without organic interfering substances，the killing logartithm of Escherichia coli exposed to the NEOW for 30 s was 7.76.pH and oxidation reduction potential（ORP）changesd were not obvious after dilution of NEOW.Available chlori-ne concentration（ACC）decreased as dilution，however，the 60%of dilution of NEOW maintained same germicidal efficacy.Germicidal efficacy of NEOW was significantly reduced as the BSA concentration increased.But germicidal efficacy of NEOW could be available by increasing time or ACC at low conce-ntrations of BSA，it need to be cleaned to reduce the amount of organic interfering substances and then disinfected at high concentrations of BSA.

organic interfering substance；Escherichia coli；neutral electrolyzed oxidizing water；germicidal efficacy

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.041

2016-12-01

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃生物安全重點(diǎn)專項(xiàng)（2016YFC1201504）作者簡(jiǎn)介：陳紅運(yùn)（1987—），男（漢），碩士研究生，研究方向：超氧化電位水消毒技術(shù)的研究與應(yīng)用。

*通信作者：宋全厚，教授級(jí)高級(jí)工程師，研究方向：長(zhǎng)期從事食品質(zhì)量安全技術(shù)研發(fā)管理工作。