劉謝英，馮玉潔，冶曉童，姚新成，2，*

（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832000；2.石河子大學(xué)新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000）

新疆兩色金雞菊中原花青素含量測(cè)定體系考察

劉謝英1，馮玉潔1，冶曉童1，姚新成1，2，*

（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832000；2.石河子大學(xué)新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000）

為準(zhǔn)確測(cè)定新疆兩色金雞中原花青素含量，選擇合適的對(duì)照品和測(cè)定體系。通過(guò)比較香草醛-鹽酸、正丁醇-鹽酸、鐵鹽（Fe3+）催化法、pH示差法等多種測(cè)定體系下，兩色金雞菊提取物和對(duì)照品兒茶素或原花青素的連續(xù)波長(zhǎng)掃描圖譜，考察光譜吸收曲線(xiàn)的一致性和λmax峰位值，進(jìn)而選擇適合測(cè)定兩色金雞菊中原花青素含量的顯色反應(yīng)體系。結(jié)果表明，兩色金雞菊提取物與原花青素對(duì)照品在正丁醇-鹽酸、Fe3+催化法和pH示差法產(chǎn)生的光譜吸收曲線(xiàn)相似，λmax峰位值更接近。因此，可以用這3種體系快速測(cè)定兩色金雞菊中原花青素的含量。結(jié)果顯示，在特定的測(cè)定體系中，選擇合適的對(duì)照品能準(zhǔn)確測(cè)定新疆兩色金雞菊中原花青素的含量。

兩色金雞菊；原花青素；顯色反應(yīng)體系

兩色金雞菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）為菊科金雞菊屬、蛇目菊種一年生草本植物蛇目菊的全草。原產(chǎn)于美洲內(nèi)陸干旱地區(qū)，主要作為景觀植物栽培，后分布于世界各地。在我國(guó)，兩色金雞菊野生資源較為豐富。主要分布于新疆海拔1 500 m～3 000 m的昆侖山區(qū)，故又稱(chēng)“昆侖雪菊”、“雪菊”、“昆侖血菊”。當(dāng)?shù)鼐用癯２杉迈r頭狀花序浸泡當(dāng)花茶飲用，可治療燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振等病癥。新疆維吾爾醫(yī)院也將其作為一種維吾爾藥材使用，具有清熱解毒、活血化瘀和胃健脾之功效[1]。目前，新疆兩色金雞菊被人們廣泛用作茶飲品在使用。研究表明，兩色金雞菊富含黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、多糖、皂苷類(lèi)、氨基酸、揮發(fā)油、多種微量礦物質(zhì)元素等化學(xué)成分，具有較高的食用價(jià)值[2-3]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，新疆兩色金雞菊頭狀花序（Coreopsis tinctoria flowering tops，CTFT）中含大量的花色苷類(lèi)和原花青素成分[4]。而該類(lèi)物質(zhì)具有類(lèi)黃酮C6-C3-C6骨架結(jié)構(gòu)，因此在測(cè)定過(guò)程中易受到黃酮類(lèi)物質(zhì)成分干擾而使測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。目前，對(duì)原花青素的含量測(cè)定多采用比色法和HPLC法。HPLC法具有快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但由于無(wú)法獲得樣品中所有待測(cè)組份的對(duì)照品，只能測(cè)定其中的個(gè)別成分進(jìn)行定量，測(cè)定結(jié)果并不能代表整體原花青素的含量[5]。而比色法具有簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)。在選擇合適對(duì)照品做參照和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)體系下，比色法可以準(zhǔn)確測(cè)定某一類(lèi)物質(zhì)的含量。因此，選取合適的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物質(zhì)，建立適當(dāng)?shù)臏y(cè)定反應(yīng)體系，準(zhǔn)確測(cè)定新疆兩色金雞菊中原花青素的含量，對(duì)控制該天然植物質(zhì)量，開(kāi)發(fā)相關(guān)功能性食品和綜合利用該植物資源是很有意義的。

1 材料與方法

1.1 材料

兩色金雞菊購(gòu)于新疆和田地區(qū)策勒縣努爾鄉(xiāng)昆侖山區(qū)高海拔種植區(qū)（2013年11月），經(jīng)石河子大學(xué)藥學(xué)院李鵬副教授鑒定為菊科金雞菊屬一年生草本植物蛇目菊的干燥頭狀花序。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

UV-2041PC紫外分光光度儀：日本島津；BP211D十萬(wàn)分之一電子分析天平：北京Sartorius；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；TP300超聲波提取器：北京天鵬電子新技術(shù)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000：上海亞榮生化儀器廠；Quorum K750X冷凍干燥儀：英國(guó)；5-1000 μL手動(dòng)移液器：蘇州百得儀器有限公司；恒溫水浴鍋：北京光明醫(yī)療器械廠。

1.2.2 試劑

甲醇、正丁醇、濃鹽酸、香草醛、硫酸鐵銨等均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為去離子純凈水。

1.2.3 試藥

原花青素，化學(xué)對(duì)照品（含量＞98%）：廣州超粵生物科技有限公司；兒茶素，化學(xué)對(duì)照品（含量＞99%）：中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.3 方法

1.3.1 兩色金雞菊中原花青素的提取

兩色金雞菊研碎，過(guò)20目篩。采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取條件：液料比21∶1（mL/g），乙醇濃度為60%（含1%乙酸），提取30 min（250 W，40 kHZ）。提取物經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥即得。

1.3.2 原花青素的含量測(cè)定體系考察

1.3.2.1 樣品溶液、兒茶素和原花青素對(duì)照溶液UVVis吸收譜圖

分別移取兒茶素甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg/mL）、原花青素甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2 mg/mL）和CTFT提取物甲醇液（2.0 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL試管中，加入9.0 mL甲醇，搖勻。以甲醇為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)200 nm～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描。

1.3.2.2 香草醛-鹽酸顯色反應(yīng)體系[6]

國(guó)內(nèi)多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定原花青素含量采用此法。該法的原理是原花青素在鹽酸/硫酸反應(yīng)體系中，C6-C3-C6中A環(huán)有較高的化學(xué)活性，其結(jié)構(gòu)中的間苯三酚或間苯二酚與香草醛發(fā)生縮合，產(chǎn)物在濃酸作用下就會(huì)形成有色的正碳離子。原花青素是一大類(lèi)雙黃酮衍生物的多酚化合物的總稱(chēng)，是由多羥基黃烷-3-醇單元構(gòu)成的低聚體或多聚體，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成。香草醛-鹽酸主要與原花青素單體和低聚體反應(yīng)，故初步判斷可以用原花青素或兒茶素作為對(duì)照品，測(cè)定樣品中的原花青素含量。具體測(cè)定過(guò)程如下：

1）以?xún)翰杷貫閷?duì)照品香草醛-鹽酸顯色反應(yīng)體系

分別移取兒茶素甲醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1.0 mg/mL）和CTFT提取物甲醇液（0.4 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL試管中，加入6.0 mL香草醛甲醇溶液（4%）和3.0 mL濃鹽酸，搖勻。水浴30℃條件下避光反應(yīng)30 min。反應(yīng)產(chǎn)物以甲醇稀釋至合適濃度（吸光度A=0.2～0.8），以甲醇為空白，在波長(zhǎng)400 nm～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描。

2）以原花青素為對(duì)照品香草醛-鹽酸顯色反應(yīng)體系

分別移取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.2 mg/mL）和CTFT提取物甲醇液（0.4 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL試管中，加入1.25 mL香草醛甲醇溶液（1%）和1.75 mL鹽酸溶液（8%），搖勻。水浴30℃避光反應(yīng)20 min。反應(yīng)產(chǎn)物以甲醇稀釋至合適濃度（吸光度A=0.2～0.8），以甲醇為空白，在波長(zhǎng)400 nm～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描。

1.3.2.3 正丁醇-鹽酸顯色反應(yīng)體系[7]

該法的原理是原花青素聚合體在正丁醇-鹽酸反應(yīng)體系中，經(jīng)高溫加熱產(chǎn)生有色物質(zhì)，而生成有色物質(zhì)的量與原花青素的量成正比。在正丁醇-鹽酸反應(yīng)體系中，兒茶素或表兒茶素等單體不易發(fā)生反應(yīng)，故在該反應(yīng)體系中常選擇原花青素作對(duì)照品進(jìn)行含量測(cè)定。

測(cè)定過(guò)程：分別移取原花青素甲醇對(duì)照品溶液（0.5 mg/mL）和CTFT提取物甲醇溶液（4 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL具塞試管中，再加入6.0 mL正丁醇-鹽酸溶液（95∶5），搖勻。沸水浴40 min后迅速冷卻至室溫。反應(yīng)產(chǎn)物以正丁醇-鹽酸溶液（95∶5）稀釋至合適濃度（吸光度A=0.2～0.8），以正丁醇-鹽酸溶液為空白，在400 nm～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描。

1.3.2.4 鐵鹽（Fe3+）催化比色法[8]

該法原理與鹽酸-正丁醇法相似，即以正丁醇和鹽酸為反應(yīng)介質(zhì)，原花青素在酸性條件下加熱轉(zhuǎn)化成為紅色的花青素。與正丁醇-鹽酸反應(yīng)體系不同之處是加入Fe3+離子為催化劑，使生成物顯色反應(yīng)更靈敏。

測(cè)定過(guò)程：分別移取原花青素甲醇對(duì)照品溶液（0.5 mg/mL）和CTFT提取物甲醇溶液（2.0 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL具塞試管中，加入0.20 mL硫酸鐵銨鹽酸溶液（2.0 mol/L），混勻。再加入6.0 mL正丁醇-鹽酸溶液（95∶5），搖勻。沸水浴40 min后迅速冷卻至室溫。反應(yīng)產(chǎn)物以正丁醇-鹽酸溶液（95∶5，體積比）稀釋至合適濃度（吸光度A=0.2～0.8），以正丁醇-鹽酸溶液為空白，在波長(zhǎng)400 nm～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描。

1.3.2.5 pH示差分光光度法[9-10]

該法的原理是原花青素或花青素在不同的pH值條件下，存在藍(lán)色的醌式（脫水）結(jié)構(gòu)、紅色的正離子結(jié)構(gòu)、無(wú)色的甲醇假堿和類(lèi)查爾酮等4種結(jié)構(gòu)。在低pH值時(shí)，溶液呈現(xiàn)最強(qiáng)的紅色，隨著pH值的增大，溶液逐漸褪至無(wú)色。可根據(jù)不同pH值條件下光譜的變化測(cè)定原花青素色素含量。

測(cè)定過(guò)程：移取1.0 mL CTFT提取物甲醇溶液（0.4 mg/mL）3份至10.0 mL具塞試管中。其中2份分別加入9.0 mL（pH=6、3）的緩沖溶液，30℃避光水浴80 min。以相應(yīng)的緩沖溶液為空白，在波長(zhǎng)200 nm～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTFT提取物與兒茶素和原花青素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液連續(xù)波長(zhǎng)掃描圖

按1.3.2.1項(xiàng)下內(nèi)容進(jìn)行操作，獲得兒茶素、原花青素和CTFT提取物連續(xù)波長(zhǎng)掃描圖。結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，樣品提取液、兒茶素和原花青素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液在紫外區(qū)200 nm～300 nm范圍內(nèi)吸收?qǐng)D譜相似，最大吸收波長(zhǎng)均在（280±1）nm，說(shuō)明樣品中含有花青素類(lèi)物質(zhì)；但樣品提取液本底吸收較高，顯示有明顯的干擾成分。同時(shí)，可見(jiàn)區(qū)有明顯的吸收峰，說(shuō)明樣品中有大量的有色物質(zhì)如花色苷等。因此，不能采用兒茶素或原花青素為對(duì)照品UV法直接測(cè)定兩色金雞菊中原花青素含量。

圖1 兩色金雞菊提取物與兒茶素和原花青素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液連續(xù)波長(zhǎng)掃描圖Fig.1 The spectrogram of CTFT extract，catechin and proanthocyanidin standards at 200 nm～600 nm

2.2 香草醛-鹽酸顯色反應(yīng)體系

按1.3.2.2項(xiàng)下內(nèi)容進(jìn)行操作，獲得兒茶素、原花青素和CTFT提取物連續(xù)波長(zhǎng)掃描圖。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 兩色金雞菊提取物與兒茶素和原花青素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照在香草醛-鹽酸顯色反應(yīng)體系連續(xù)波長(zhǎng)掃描圖Fig.2 The spectrogram of CTFT extract，catechin and proanthocyanidin standards in vanillin-hydrochloric acid reaction system

由圖2可知，在香草醛-鹽酸顯色反應(yīng)體系中，兒茶素和原花青素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液在360 nm～600 nm范圍內(nèi)吸收?qǐng)D譜相似，最大吸收波長(zhǎng)均在（500±2）nm；但CTFT提取液吸收?qǐng)D譜與之差異較大，最大吸收波長(zhǎng)（522±2）nm。因此，該反應(yīng)體系也不適合測(cè)定兩色金雞菊中原花青素含量。

2.3 正丁醇-鹽酸顯色反應(yīng)體系

按1.3.2.3項(xiàng)下內(nèi)容進(jìn)行操作，獲得原花青素和CTFT樣品連續(xù)波長(zhǎng)掃描圖。結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在正丁醇-鹽酸顯色反應(yīng)體系中，樣品和原花青素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液在400 nm～700 nm范圍內(nèi)吸收?qǐng)D譜相似，最大吸收波長(zhǎng)均在（538±2）nm，而且樣品本底吸收很低，干擾較少。因此，該反應(yīng)體系可用于測(cè)定兩色金雞菊中原花青素的含量。

圖3 兩色金雞菊提取物與原花青素對(duì)照品在正丁醇-鹽酸顯色反應(yīng)體系連續(xù)波長(zhǎng)掃描圖Fig.3 The spectrogram of CTFT extract and proanthocyanidin standard in n-butanol-hydrochloric acid reaction system

2.4 鐵鹽（Fe3+）催化比色法

按1.3.2.4項(xiàng)下內(nèi)容進(jìn)行操作，獲得原花青素和樣品連續(xù)波長(zhǎng)掃描圖。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 兩色金雞菊提取物與原花青素對(duì)照品在Fe3+催化比色法反應(yīng)體系連續(xù)波長(zhǎng)掃描圖Fig.4 The spectrogram of CTFT extract and proanthocyanidin standard in Fe3+chromogenic method reaction system

由圖4可知，在Fe3+催化顯色反應(yīng)體系中，樣品和原花青素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液在400 nm～700 nm范圍內(nèi)吸收?qǐng)D譜相似，最大吸收波長(zhǎng)均在（546±2）nm，而且樣品本底干擾很小。因此，該反應(yīng)體系可用于測(cè)定兩色金雞菊中原花青素的含量。

2.5 pH示差分光光度法

按1.3.2.5下內(nèi)容進(jìn)行操作，獲得樣品在不同pH值條件下連續(xù)波長(zhǎng)掃描圖。結(jié)果如圖5。

由圖5可知，在pH=3和6的條件下，相同濃度的兩色金雞菊提取物溶液吸收?qǐng)D譜相似，最大吸收峰位也一致，但最大吸收度發(fā)生了改變。根據(jù)其改變的ΔA值，可以計(jì)算出樣品中原花青素的含量。因此，該法也適合用于樣品中原花青素的含量測(cè)定。

圖5 兩色金雞菊提取物在不同pH值條件下連續(xù)波長(zhǎng)掃描圖Fig.5 The spectrogram of CTFT extract in different pH values

3 討論

1）原花青素是存在于植物中的一大類(lèi)雙黃酮衍生物的天然多酚化合物的總稱(chēng)，是由多羥基黃烷-3-醇單元構(gòu)成的低聚體或多聚體，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成。在香草醛-鹽酸反應(yīng)體系下，原花青素單體和低聚體可與香草醛發(fā)生呈色反應(yīng)，故可選原花青素或兒茶素作為對(duì)照品進(jìn)行含量測(cè)定；在正丁醇-鹽酸反應(yīng)體系下，兒茶素或表兒茶素等單體不易發(fā)生呈色反應(yīng)，只有多聚體或單聚體才產(chǎn)生，故在該反應(yīng)體系中常選擇原花青素作對(duì)照品進(jìn)行含量測(cè)定；而鐵鹽催化體系與正丁醇-鹽酸反應(yīng)體系相同，兒茶素或表兒茶素等單體不易發(fā)生呈色反應(yīng)，故只能選原花青素作為對(duì)照品進(jìn)行含量測(cè)定。

2）香草醛-鹽酸顯色反應(yīng)體系中，可測(cè)定原花青素單體及低聚體的總含量。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該法測(cè)定原花青素含量時(shí)誤差較大，反應(yīng)體系透明度較差，測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定，推測(cè)原因可能與原花青素在該條件下易氧化分解有關(guān)。

3）鐵鹽催化比色法是在鹽酸-正丁醇法的基礎(chǔ)上增加了Fe3+做催化劑，增強(qiáng)了反應(yīng)的靈敏度，同時(shí)增加了顯色反應(yīng)的穩(wěn)定性。

4）pH差示分光光度法主要是根據(jù)不同pH值條件下，原花青素光譜的變化來(lái)測(cè)定原花青素的含量。但在該反應(yīng)條件下，對(duì)試驗(yàn)條件要求苛刻（溫度、pH值，反應(yīng)時(shí)間等），微小的pH值變化都會(huì)引起吸光度值的改變。因此，在該反應(yīng)體系下測(cè)定樣品中原花青素的含量需做隨行對(duì)照，并保持反應(yīng)條件一致性。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)比較分析香草醛-鹽酸、正丁醇-鹽酸、鐵鹽（Fe3+）催化法、pH示差法等多種測(cè)定體系下，兩色金雞菊提取物和對(duì)照品兒茶素或原花青素的連續(xù)波長(zhǎng)掃描圖譜一致性和λmax峰位值。結(jié)果顯示，在香草醛-鹽酸顯色反應(yīng)體系下，以?xún)翰杷鼗蛟ㄇ嗨貫閷?duì)照品均不適合測(cè)定新疆兩色金雞菊中原花青素的含量；而正丁醇-鹽酸顯色體系、鐵鹽（Fe3+）催化比色法和pH示差法均可以原花青素為對(duì)照品測(cè)定兩色金雞菊中原花青素的含量；其中Fe3+催化比色法反應(yīng)更靈敏和更穩(wěn)定。所以，新疆兩色金雞菊中原花青素含量測(cè)定可用原花青素為對(duì)照，使用Fe3+比色法和pH示差法進(jìn)行。

本含量測(cè)定體系方法簡(jiǎn)便易操作，且成本低，易于在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速分析樣品中的原花青素含量。

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The Determination of Proanthocyanidins Content in Coreopsis tinctoria Nutt.from Xinjiang in Different Chromogenic Reaction System

LIU Xie-ying1，F(xiàn)ENG Yu-jie1，YE Xiao-tong1，YAO Xin-cheng1，2，*
（1.School of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China；2.Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China）

To select the appropriate standards and chromogenic reaction system for determination the content of proanthocyanidins in Coreopsis tinctoria flowering tops（CTFT）from Xinjiang，the spectrum of CTFT extract，catechin and proanthocyanidins standards were compared in vanillin-hydrochloric acid，n-butanol-hydrochloric acid，F(xiàn)e3+catalytic chromogenic method and pH differential spectrophotometry reaction system.The spectral absorption curve and the wavelength λmaxpeak values were investigated for selecting a suitable reaction system to determine the content of proanthocyanidins of CTFT.The spectrum of CTFT extract and proanthocyanidins standard were similar in n-butanol-hydrochloric acid，F(xiàn)e3+chromogenic method and pH differential spectrophotometry reaction system，and the λmaxvalues were also closer to standard.Therefore，the content of proanthocyanidins in CTFT could be assayed by these three chromogenic reaction system.The content of proanthocyanidins in CTFT could be accurately determined in a particular reaction system and using an appropriate standard.

Coreopsis tinctoria Nutt.；proanthocyanidins content；chromogenic reaction system

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.026

2016-09-30

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（81660641）；新疆生產(chǎn)兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域科技攻關(guān)項(xiàng)目（2014BA031）；石河子大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（RCZX201328）

劉謝英（1993—），女（漢），碩士研究生，藥物分析專(zhuān)業(yè)。

*通信作者：姚新成（1973—），男（漢），副教授，博士，從事中藥與天然產(chǎn)物活性研究。