楊洪金,孔 峰,王 嵐,*,高 強,陳洪章

(1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;2.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室,北京 100190)

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功能性紅曲的汽爆滅菌工藝初步研究

楊洪金1,2,孔 峰2,王 嵐2,*,高 強1,陳洪章2

(1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;2.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室,北京 100190)

目的:初步研究汽爆功能性紅曲的滅菌效果以及對其活性物質(zhì)莫納可林K(Monacolin K)的影響。方法:汽爆功能性紅曲以蒸汽為汽爆介質(zhì),研究115、125、135 ℃溫度下分別維壓0、1、3、5 min,功能性紅曲中Monacolin K含量、水分含量、菌落總數(shù)的變化,采用滅菌指示膠帶圖像處理法評價滅菌效果。結(jié)果:汽爆滅菌在達到滅菌要求的情況下(135 ℃汽爆3 min),相比較傳統(tǒng)高壓蒸汽滅菌條件121 ℃、20 min,汽爆后功能性紅曲含水量和Monacolin K的損失率分別為13.07%和3.92%,均低于傳統(tǒng)高壓蒸汽滅菌后的含水量(18.49%)和損失率(17.76%)，該汽爆條件下滅菌指示膠帶熱敏區(qū)域灰度平均值為62.77。結(jié)論:汽爆滅菌對于功能性紅曲是可行且高效的,該汽爆工藝節(jié)省紅曲產(chǎn)品后續(xù)干燥的能量,降低了生產(chǎn)成本,為功能性紅曲有效滅菌、保留活性成分以及減少滅菌后成品含水量的汽爆滅菌提供理論依據(jù)。

功能性紅曲,汽爆,滅菌,莫納可林K

功能性紅曲是將紅曲霉接種在大米培養(yǎng)基上經(jīng)長時間固態(tài)發(fā)酵而得到的產(chǎn)物,其含有的活性物質(zhì)莫納可林K(Monacolin K)[1],能有效抑制膽固醇生物合成中的關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基-戊二酰基-輔酶A還原酶的活性,具有調(diào)節(jié)人體內(nèi)異常血脂的作用[2-3]。近年來,市場上出現(xiàn)的降脂類藥有洛伐他汀、辛伐他汀、血脂康等,它們的降血脂機理都與Monacolin K有關(guān)[4-5]。然而在功能性紅曲的加工生產(chǎn)過程中很難控制霉菌等雜菌的數(shù)量,易導(dǎo)致微生物超過允許標(biāo)準(zhǔn)[6]。傳統(tǒng)高壓蒸汽滅菌,穿透力強,滅菌效果好[7-8],但是滅菌后功能性紅曲中的活性成分受其影響較大[9]，且傳統(tǒng)高壓蒸汽滅菌是一個耗時長、能耗高、滅菌后含水量多的過程,還需增加干燥紅曲米粉成品環(huán)節(jié),增加了生產(chǎn)成本。很有效的輻射滅菌方法[10-11]由于其高能輻射射線可能打斷Monacolin K中某些化學(xué)鍵而使Monacolin K含量下降10%以上[12],國內(nèi)外對輻射食品的要求和標(biāo)準(zhǔn)不一[13],遠不能滿足人們對于食品安全的要求。汽爆是一種典型的高溫短時過程,具體指通入飽和蒸汽至汽爆罐,達到一定壓力并維持特定時間,然后突然泄壓,蒸汽膨脹,物料隨蒸汽被瞬時噴出的過程[14-15]。趙志敏等利用汽爆作為一種新型滅菌方式,對固態(tài)培養(yǎng)基進行滅菌處理,在達到滅菌效果的前提下,汽爆滅菌減少了培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的損失[15]。本文初步研究了功能性紅曲的汽爆滅菌條件及其滅菌效果,旨為實現(xiàn)有效滅菌、保留活性成分以及減少滅菌后成品含水量的汽爆滅菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

顆粒度為80目的紅曲米粉 浙江三禾生物工程有限公司;滅菌指示膠帶 購于3M公司;胰蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂粉 均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;莫納克林K 購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;葡萄糖 購自西隴化工股份有限公司;氫氧化鈉(NaOH)、氯化鈉(NaCl) 購自北京化工廠;磷酸二氫鉀(KH2PO4) 購自北京市紅星化工廠;乙醇、乙腈、磷酸 購自北京市通廣精細化工公司。

汽爆裝置(2.0 L) 實驗室自制,見圖1;YXQ-LS-30S高壓蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司;Agilent 1200高效液相色譜儀及其色譜工作站 美國Agilent;DH4000A電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;TGL-16G臺式離心機 山海安享科學(xué)儀器廠;101-2電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海圣欣科學(xué)儀器有限公司;722-型可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司;DT-100電子天平 北京多斯利儀器系統(tǒng)有限公司;GT-1620QTS超聲波清洗機 蘇州江東精密儀器設(shè)置有限公司;SHB-III循環(huán)式水式多用真空泵 上海振捷實驗設(shè)備有限公司;SHA-B水浴恒全溫振蕩器 金壇市華龍實驗儀器廠;TSK-957CFM多功能粉碎機 上海燦坤實業(yè)有限公司;KD2-pro熱特性分析儀 北京力高泰科技有限公司。

圖1 汽爆滅菌的實驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the experimental apparatus for steam explosion sterilization

1.2 實驗方法

1.2.1 汽爆滅菌 汽爆裝置主要由反應(yīng)腔、接收腔和蒸汽發(fā)生器構(gòu)成。固態(tài)物料由反應(yīng)腔頂部進料后關(guān)閉進料閥,蒸汽由蒸汽發(fā)生器進入反應(yīng)腔與物料接觸,達到一定壓力后維持一定時間?？焖俅蜷_卸料球閥,使物料進入無菌接收腔。汽爆強度由以下公式計算[14,16]:

式(1)

式中,R0表示汽爆強度;t表示維壓時間,min;T表示維壓溫度, ℃。

取30 g紅曲米粉放在一個圓形培養(yǎng)平板(d=8.8 cm,h=1.6 cm)中,然后以紗布蓋上置于汽爆罐內(nèi)進行汽爆。汽爆滅菌條件:115 ℃、0 min,115 ℃、1 min,115 ℃、3 min,115 ℃、5 min,125 ℃、0 min,125 ℃、1 min,125 ℃、3 min,125 ℃、5 min,135 ℃、0 min,135 ℃、1 min,135 ℃、3 min,135 ℃、5 min和未處理。

常規(guī)蒸汽滅菌條件作為實驗對照組,設(shè)定滅菌條件為121 ℃維持20 min[17]。

1.2.2 菌落總數(shù)的測定 涂布法檢測滅菌效果，參照文獻[19],制備pH7.2含34.0 g/L KH2PO4的無菌磷酸鹽緩沖液,制備平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。

無菌條件下稱取25 g滅菌后紅曲米粉,置于裝有225 mL無菌磷酸鹽緩沖液的250 mL三角瓶,搖勻,為涂布原液。取涂布原液1 mL于9 mL無菌磷酸鹽緩沖液中進行稀釋,為涂布稀釋液。取稀釋前后的溶液各0.1 mL,涂布于平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。32 ℃靜置培養(yǎng)4～5 d后菌落計數(shù),記下菌落形成單位(Colony-forming units,CFU)。

1.2.3 Monacolin K含量測定[18]試樣處理:取0.5 g干燥后的樣品于50 mL容量瓶,加30 mL體積分數(shù)為75%的乙醇溶液,搖勻,超聲50 min,冷卻至室溫,加75%乙醇定容至50 mL,取適量于離心管以3500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾到液相進樣瓶中,用以進行HPLC分析。

定性用Monacolin K的制備:稱取Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品4 mg,以75%無水乙醇定容至100 mL,在50 ℃條件下超聲轉(zhuǎn)化1 h,放置到室溫后再放置1 h。

液相色譜條件:色譜柱:ZORBAX SB C-18,5 μm,250 mm×4.6 mm;柱溫:28 ℃;紫外檢測器:238 nm檢測波長;流動相:將650 mL乙腈溶液和350 mL 0.1 g/100 mL磷酸水溶液混合后,在循環(huán)水式多用真空泵上經(jīng)0.22 μm有機膜進行抽濾,然后在超聲波清洗機中以50 P的頻率超聲15 min;流速:1 mL/min;進樣量:20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:配制濃度為0.1、1、10、30、75、150、300 μg/mL Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)溶液,分析時,用洗脫液平衡分析柱,基線穩(wěn)定后將不同濃度的Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)液進行HPLC分析,測定峰面積,以峰面積對樣品濃度進行線性回歸,得Monacolin K回歸方程為Y=68.035X+59.403,R2=0.9995,線性關(guān)系良好,進行后續(xù)樣品測定。

色譜分析:將處理好的樣品提取液20 μL進樣,與標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時間對照定性,用樣品Monacolin K峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品Monacolin K的峰面積之比進行定量。Monacolin K含量、Monacolin K損失率計算見式2～3:

Monacolin K含量(mg/g)=樣品Monacolin K峰面積×標(biāo)準(zhǔn)Monacolin K溶液濃度×50÷(標(biāo)準(zhǔn)Monacolin K峰面積×樣品稱取量)

式(2)

Monacolin K損失率=(未處理樣品Monacolin K含量-汽爆滅菌后Monacolin K含量)/未處理樣品Monacolin K含量

式(3)

1.2.4 汽爆滅菌后產(chǎn)品中含水量的測定 將汽爆滅菌后的產(chǎn)品進行稱量,然后放到電熱鼓風(fēng)干燥箱60 ℃干燥至恒重,再次稱量,計算含水率。

表1 不同汽爆條件對滅菌效果的影響Table 1 Effects of different conditions of steam explosion on sterilization performance

1.2.5 滅菌指示膠帶圖像處理表征滅菌效果 首先使用UJIFILM FinePix Z20fd在相同焦距、恒定光照下對滅菌處理之前和之后滅菌指示帶進行拍照記錄,所獲得的圖像分辨率為3648×2736像素,滅菌指示膠帶受熱后熱敏區(qū)域明顯變色。然后,用商業(yè)化軟件ImageJ 1.44(國立衛(wèi)生研究院,美國)和MatLab 7.1(MathWorks Inc.,USA)對拍照圖像進行數(shù)字圖像處理。最后基于灰度值對紅綠藍(RGB)三基色圖片進行閾值分割[20-21],將熱敏區(qū)域像素保留,而背景設(shè)置為白色。將圖片灰度化,求出熱敏區(qū)域灰度平均值[22]。滅菌指示帶經(jīng)受壓力蒸汽滅菌,熱敏區(qū)的顏色會發(fā)生改變,顏色越深,灰度值越小。通過數(shù)字圖像處理分析滅菌指示膠帶顏色變化,以表征滅菌效果。

1.2.6 汽爆滅菌動力學(xué) 用一級化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)[23-24]表示:

式中,N為殘存的活菌數(shù);t為滅菌時間,s;k為滅菌速率常數(shù),1/s。

積分得:

式中,N0為滅菌前的菌落形成單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同汽爆條件對滅菌效果、Monacolink含量及含水量的影響

將汽爆產(chǎn)品在瓊脂平板基數(shù)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),4～5 d之后觀察長菌情況。表1為不同汽爆條件對滅菌效果的影響。

溫度是影響熱力滅菌效果的重要因素。由表1可知,在相同維壓時間內(nèi),滅菌效果隨著溫度的升高而改善,表明微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)隨著溫度升高更易變性或失活。由表1發(fā)現(xiàn),不同維壓時間,實現(xiàn)徹底滅菌汽爆條件有135 ℃、3 min,135 ℃、5 min。相比于常規(guī)蒸汽滅菌條件121 ℃、20 min,汽爆滅菌顯著縮短滅菌時間。

汽爆條件135 ℃、3 min，135 ℃、5 min時功能性紅曲中Monacolin K含量分別為24.02 mg/g和21.66 mg/g，分別較傳統(tǒng)蒸汽滅菌121 ℃、20 min條件提高了16.8%、5.4%。在維壓時間為5 min時，Monacolin K含量隨著汽爆溫度的升高出現(xiàn)降低的趨勢。表明在一定條件范圍內(nèi)，隨著汽爆條件愈加劇烈，功能性紅曲中Monacolin K含量降低。在傳統(tǒng)蒸汽滅菌(121 ℃、20 min)與汽爆滅菌對比中發(fā)現(xiàn)，汽爆滅菌后的Monacolin K含量高于傳統(tǒng)蒸汽滅菌的20.56 mg/g，說明汽爆滅菌活性物質(zhì)含量的保留情況較好，其最高損失率為13.36%，均低于傳統(tǒng)蒸汽滅菌活性物質(zhì)的損失率17.76%。因此，高溫短時的汽爆滅菌更有利于保護功能性紅曲中的活性物質(zhì)。

由表1可知，汽爆條件與含水量是非線性的，表明汽爆對含水量的影響是多方面的。一方面，汽爆滅菌在汽爆時會使物料中的高溫液態(tài)水發(fā)生閃蒸，降低物料含水量；另一方面，由于汽爆滅菌介質(zhì)是蒸汽，也會對物料帶來水分，造成含水量增加。

考慮維壓時間的增大會引起能耗的增加,因此選定最終蒸汽汽爆滅菌條件為135 ℃、3 min,該條件下物料含水量為13.07%,低于傳統(tǒng)蒸汽滅菌(121 ℃ 20 min)的18.49%。輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2847-2007功能性紅曲米(粉)中規(guī)定產(chǎn)品水分應(yīng)小于10%[18]。汽爆滅菌的功能性紅曲還需進一步干燥,但相比于傳統(tǒng)蒸汽滅菌,汽爆滅菌降低了后續(xù)干燥工藝的能耗。

在滿足滅菌的條件下,綜合汽爆強度、活性物質(zhì)含量等方面,得出了最終蒸汽汽爆滅菌條件為135 ℃下3 min。在這個條件下,經(jīng)液相色譜分析得知Monacolin K含量保留可觀,損失率僅為3.92%。

2.2 基于滅菌指示帶對汽爆滅菌效果的研究

滅菌指示帶經(jīng)受蒸汽濕熱處理,熱敏區(qū)的顏色就會改變。在彩色圖上,白色的灰值是225而黑色的灰值是0。汽爆滅菌過程中,滅菌指示膠帶處于高壓濕熱環(huán)境,受熱強度越大,變色越明顯,即熱敏區(qū)域灰度值越小。因此,熱敏區(qū)域灰度值可以與滅菌條件相關(guān)。

圖2展示了不同條件滅菌處理后熱敏區(qū)域灰度值變化,發(fā)現(xiàn)不論汽爆滅菌還是常規(guī)蒸汽滅菌后,熱敏區(qū)域灰度平均值均較未滅菌降低。相同汽爆滅菌時間內(nèi),隨著溫度升高,灰度平均值整體呈現(xiàn)遞減趨勢。由表1可知,在汽爆條件135 ℃ 3 min,135 ℃ 5 min和常規(guī)蒸汽121 ℃ 20 min滅菌條件下,將汽爆產(chǎn)品在瓊脂平板基數(shù)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),4～5 d之后沒有發(fā)現(xiàn)菌落。因此該條件下,物料實現(xiàn)徹底滅菌,其相應(yīng)的灰度平均值分別為62.77,66.27和53.27?？傮w而言,汽爆維壓時間為3 min和5 min時,徹底滅菌灰度平均值臨界值為62.77和66.27。因此,基于滅菌指示帶對汽爆滅菌效果的研究,可以為汽爆滅菌工藝提供一種配套的快速反映滅菌效果的方法。

圖2 滅菌前后指示膠帶熱敏區(qū)域灰度平均值變化Fig.2 Average gray value of the sensitive area in sterilization indicator tape before and after sterilization

2.3 汽爆滅菌動力學(xué)

為深入考察滅菌過程,對汽爆滅菌動力學(xué)進行了系統(tǒng)研究。常規(guī)熱力滅菌中微生物受熱死亡,主要原因為高溫使微生物體內(nèi)的一些重要蛋白質(zhì)凝固或變性,導(dǎo)致微生物無法生存。在一定溫度下,微生物受熱死亡遵循分子反應(yīng)速度理論,即微生物的死亡速率與任一瞬時殘存的活菌數(shù)成正比[25]。

圖3功能性紅曲汽爆滅菌動力學(xué)曲線是非線性的，表明汽爆在滅菌中的作用可能是多方面的。一方面，汽爆的高溫高壓會產(chǎn)生熱力滅菌的效果；另一方面，汽爆的瞬時爆破會引起細胞結(jié)構(gòu)的變化，從而強化了滅菌效果。汽爆滅菌溫度為135 ℃時，維壓時間從0 min到3 min，微生物存活率逐漸降低。汽爆滅菌在135 ℃、3 min時,微生物存活率低于10-3的工程化滅菌要求[17]。Rajan等研究發(fā)現(xiàn)在常規(guī)蒸汽滅菌121 ℃、15 min條件下,微生物存活率為10-1.5[26]。對比發(fā)現(xiàn),汽爆滅菌快速有效。

圖3 功能性紅曲汽爆滅菌(135 ℃)動力學(xué)曲線Fig.3 Survival curve of microorganisms in functional Monascus red rice after steam explosion treatment at 135 ℃注:虛線代表微生物存活率為10-3,低于此認為滅菌有效。

3 結(jié)論

汽爆能有效地殺滅紅曲米粉中的微生物,隨著汽爆強度的增加,紅曲中的含菌量同步下降。且隨著汽爆滅菌時間變長,維持溫度的增加,活性物質(zhì)的含量會逐漸減少。通過實驗得出蒸汽滅菌的最優(yōu)條件是135 ℃維壓3 min,這個條件下滅菌徹底,活性物質(zhì)保留可觀,損失率為3.92%,含水量為13.07%,表明汽爆功能性紅曲滅菌的方法是可行的,值得推廣應(yīng)用。

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A pilot study on sterilization of functionalMonascusred rice by steam explosion

YANG Hong-jin1,2,KONG Feng2,WANG Lan2,*,GAO Qiang1,CHEN Hong-zhang2

(1.The Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education, College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China; 2.State Key Laboratory of Biochemical Engineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Science,Beijing 100190,China)

Objective:To study the effect of steam explosion sterilization on functionalMonascusred rice and its main active component Monacolin K. Methods:FunctionalMonascusred rice was sterilized by steam explosion. The effects of steam explosion residence time 0 min,1 min,3 min,5 min on sterilization efficiency were investigated under 115 ℃,125 ℃,135 ℃,respectively. The change of Monatinlin K content,water content and aerobic plate count was investigated,and sterilization indicator tape was used to characterize the sterilization effect. Results:The results showed that the heat(3.92%)of Monacolin K sterilized by steam explosion at 135 ℃ for 3 min was lower than the loss(17.76%)of traditional sterilization at 121 ℃ for 20 min. And the water content of functionalMonascusred rice sterilized by steam explosion was 13.07%,which was lower than the water content(18.49%)of traditional sterilization. Under this condition,the average gray value of the sensitive area in sterilization indicator tape was 62.77. Conclusion:Steam explosion was feasible and efficient for the sterilization of functionalMonascusred rice,which could greatly reduce the product cost and energy of subsequent dry step. Steam explosion sterilization of functionalMonascusred rice could provide the theoretical basis of retention of the active ingredient and reduction of the water content.

functionalMonascusred rice;steam explosion;sterilization;Monacolin K

2016-10-14

楊洪金(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail:hongjinY@126.com。

*通訊作者:王嵐(1981-)，女，博士，研究員，研究方向：生物化工，E-mail:wanglan@ipe.ac.cn。

生化工程國家重點實驗室開放課題基金(2013KF-01,2015KF-04和2015KF-05)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)10-0265-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.042