張立華,李 妍,張 沛,陳 青,王 歡

(棗莊學院生命科學學院,山東棗莊 277160)

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干燥方式對核桃青皮胡桃醌含量與抑菌性能的影響

張立華,李 妍,張 沛,陳 青,王 歡

(棗莊學院生命科學學院,山東棗莊 277160)

為考察核桃青皮抑菌活性與干燥方式的關系,以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和石榴干腐病菌為供試菌,評價了自然干燥(P1)、烘干(P2)及真空冷凍干燥(P3)核桃青皮的抑菌活性。結果顯示,3種樣品對3種供試菌均有較強的抑制作用,并呈現(xiàn)劑量依賴效應,即M1>M2>M3(M1,M2,M3濃度分別為100、80和60 mg/mL的核桃青皮萃取液),3種干燥方式間比較均表現(xiàn)為P3>P2>P1;P1、P2和P3對大腸桿菌和石榴干腐病菌的最小抑菌濃度(MIC)結果一致,分別為20、15和10 mg/mL,對金黃色葡萄球菌的MIC分別是15、10 和5 mg/mL;P1、P2和P3樣品中胡桃醌的含量分別是8.04、9.46和11.84 mg/g,與其抑菌活性呈極顯著正相關(p<0.01)。表明干燥方式會影響核桃青皮中胡桃醌含量及抑菌活性,其中真空冷凍干燥是一種理想的干燥方式。

核桃青皮,干燥方式,胡桃醌,抑菌活性

核桃(JuglansregiaLinn.),又名核桃楸、胡桃,是一種傳統(tǒng)經(jīng)濟樹種,在我國栽培歷史悠久、分布廣泛,全國24個省(區(qū))都有栽培和分布,其面積和產(chǎn)量均居世界首位[1]。核桃的青果皮,中藥稱青龍衣,用于治療泄瀉、痢疾、白帶、目赤及胃炎等癥,外用于疥癬、疣等皮膚病[2-4],在農(nóng)業(yè)領域還可以用作環(huán)境友好型農(nóng)藥[5-6]。大量研究表明，核桃青皮含有酚酸、萘醌及其苷類、黃酮類、二芳基庚烷類、甾體等多種活性物質(zhì)[7-9],而其中的醌類物質(zhì)受到國內(nèi)外學者的更多關注。林君陽等[10]從山核桃外果皮分離鑒定出5-羥基-2-甲氧基-1,4-萘醌,該物質(zhì)對番茄灰霉病菌和小麥赤霉病的孢子萌發(fā)均有一定抑制作用,在供試濃度為0.5 g/L時,對2種供試菌孢子萌發(fā)抑制率均超過70%。許紹惠等[11]從核桃楸(Mandshuricamaxim)的新鮮根皮、枝皮和青果皮中分離出抑菌活性成分—3′3-雙胡桃醌和3,6′-雙胡桃醌。還有研究表明胡桃醌對紅蜘蛛及蚜蟲也有毒殺作用[12]。此外,胡桃醌還具有一定的抗腫瘤作用[13-14]。為便于提取核桃青皮中的胡桃醌,多將原料進行烘干處理,但這些醌類物質(zhì)穩(wěn)定性差,易受高溫、光照等因素影響而被降解[15],季宇彬等[16]發(fā)現(xiàn)核桃青皮中胡桃醌的含量60 ℃烘干處理顯著低于陰干或40 ℃烘干的樣品。因此,對核桃青皮的干燥處理方式可能會對其中的活性成分及抑菌活性產(chǎn)生影響,但目前鮮見相關報道。本文即探究不同干燥方式對核桃青皮中胡桃醌含量及抑菌活性的影響,為更高效利用核桃青皮資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃 為棗莊市山亭區(qū)店子鎮(zhèn)產(chǎn)青皮核桃,剝?nèi)『颂仪嗥溆?供試菌種 大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、石榴干腐病菌(ZythiaversonianaSacc.)Zy06,來源于棗莊學院生命科學學院微生物實驗室;無水乙醇、氫氧化鈉、無水硫酸銅、無水甲醇等 國產(chǎn)分析純,胡桃醌標準品(≥98%) 購自上海源葉生物科技有限公司。

UV/VIS-2600型紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;SPX-300B型生化培養(yǎng)箱 廣州市海輝實驗儀器有限公司;YXQ-LS-100Sò型立式壓力蒸汽滅菌器 廣州東南科儀有限公司;AIR TECH型超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司制造;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;TOFFLON真空冷凍干燥機 上海東富龍科技股份有限公司;電熱鼓風干燥箱 精宏XMTD-8222;離心機 飛鴿ANKE TDL-40B。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品干燥處理 剝?nèi)〉男迈r核桃青皮采取不同方式干燥處理,自然干燥:放在室外晾曬3～5 d,令其自然干燥,含水率為2.87%,該處理標記為樣品P1;熱風干燥:在105 ℃下快速殺青5 min,然后在65 ℃下烘干,含水率為2.32%,該處理標記為樣品P2;冷凍干燥:冷凍室壓力10 Pa,溫度-45 ℃,含水率為2.58%,該處理樣品標記為P3。充分干燥后使用粉碎機將樣品粉碎并過40目篩,備用。

1.2.2 核桃青皮萃取液的制取 各稱取P1、P2和P3樣品粉末10.00 g加入150 mL 95%乙醇溶液,65 ℃下回流提取2 h[17],過濾,濾液減壓濃縮,最后用水定容至50 mL,相當生藥含量為200 mg/mL,作為實驗母液。各取母液10 mL,用蒸餾水稀釋至生藥含量為100、80和60 mg/mL,并依次標記為M1、M2和M3,用于抑菌實驗。

1.2.3 樣品中胡桃醌含量測定 采用分光光度法測定3種樣品中胡桃醌的含量[18],分別取1.2.2中制取的母液1.0 mL加入無水甲醇定容至25 mL萃取,經(jīng)4000 r·min-1離心10 min,取上清液在426 nm下測定其吸光值。以胡桃醌為標準品計算各樣品中胡桃醌的含量。

標準曲線的建立:稱取胡桃醌標準品溶解于甲醇中,配制成質(zhì)量濃度分別為0.6、1.2、2.4、4.8 mg/L的標準溶液。在426 nm下測定其吸光值,以吸光度值對樣品質(zhì)量濃度繪制標準曲線。

1.2.4 抑菌實驗

1.2.4.1 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌實驗 采用平皿打孔法[19]測定核桃青皮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性。分別將配制好并已滅菌的各固體培養(yǎng)基熔化倒入無菌培養(yǎng)皿(規(guī)格9 cm)中,每皿15 mL,冷卻凝固后,用移液槍取0.1 mL充分混合的107～109cfu/mL供試菌懸液于培養(yǎng)皿中,用涂布棒均勻涂開。用口徑5 mm的無菌打孔器在平板上等距離打孔,每皿5孔,并在不同孔中加入50 μL 3種處理樣品(P1、P2和P3)不同稀釋倍數(shù)的提取液(M1、M2和M3)和對照樣液,做好標記,放入培養(yǎng)箱中,37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。5 mg/mL的克林霉素作為陽性對照,無菌水作為空白對照。用十字交叉法測量抑菌圈直徑,結果取三次重復的平均值。抑菌能力的強弱用抑菌圈直徑或抑菌率表示。抑菌率的計算公式見式(1)。

抑菌率(%)=(實驗組抑菌圈直徑-空白對照抑菌圈直徑)/實驗組抑菌圈直徑×100

式(1)

1.2.4.2 石榴干腐病菌抑菌實驗 采用菌絲生長速率抑制法[20]測定核桃青皮對石榴干腐病菌的抑菌活性。將PDA培養(yǎng)基熔化冷卻至50 ℃倒入培養(yǎng)皿(規(guī)格為6 cm),每皿9 mL,冷卻凝固后,用移液槍取50 μL 3種處理樣品(P1、P2和P3)不同稀釋倍數(shù)的提取液(M1、M2和M3)和對照樣液于不同的培養(yǎng)皿中,用涂布棒均勻涂開。用滅菌打孔器取直徑5 mm的圓形菌片,移到涂有樣液的平板上,做好標記,每個處理重復3次,將各皿放入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h,測量其菌落直徑,抑菌率的計算公式見式(2)。

抑菌率(%)=(空白對照組菌落直徑-實驗組菌落直徑)/空白對照組菌落直徑

式(2)

1.2.4.3 最小抑菌濃度測定 將3種樣品的母液用10%吐溫-80稀釋至生藥含量25、50、75、100、125和150 mg/mL 6個梯度,然后吸取2 mL加入8 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中,充分振蕩混勻,倒平板,使培養(yǎng)基中核桃青皮最終生藥含量5、10、15、20、25和30 mg/mL。待培養(yǎng)基冷卻后,用預先培養(yǎng)好的菌懸液劃線接種,分別按前述條件培養(yǎng),每一濃度均做3組平行實驗。觀察結果,從無菌生長的培養(yǎng)皿中找出最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)的培養(yǎng)皿,即為提取液的最小抑菌濃度(MIC)。以10%吐溫-80作為對照[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均設3個以上重復,數(shù)據(jù)為多個重復的平均值,使用Excel軟件做各處理樣品(P1、P2、P3)、各稀釋倍數(shù)(M1、M2、M3)的差異顯著性及相關性分析，M1、M2、M3于表中標注，P1、P2、P3未標注。

2 結果與分析

2.1 不同干燥方式的核桃青皮對大腸桿菌的抑制效果

各樣品對大腸桿菌的抑菌圈直徑和抑菌率見表1。不同干燥方式的核桃青皮對大腸桿菌的抑制作用有差別,P3的抑菌圈直徑和抑菌率大于相應體積分數(shù)的P2,P2又大于P1,且差異明顯(p<0.05),表明干燥方式對核桃青皮的抑菌活性有明顯影響。同一處理的核桃青皮隨用量的減少,其抑菌圈直徑和抑菌率減小,即M1>M2>M3,且差異顯著(p<0.05)。其中P1的抑菌活性M1略低于5 mg/mL的克林霉素,而P2和P3均高于陽性對照,表明核桃青皮有較強的抑制大腸桿菌作用,并呈現(xiàn)劑量依賴效應。醌類物質(zhì)由于不飽和鍵的存在穩(wěn)定性差,易受高溫、光照等因素影響而降解,P1為自然晾曬干燥,處理時間較長,核桃青皮中的有效成分被氧化分解較多,從而使其抑菌活性降低;P2為熱風干燥,加熱處理時間相對較短,有效成分的損失相對較少;而P3為真空低溫條件下冷凍干燥,有效成分的損失最少,因此抑菌活性最強。

表1 不同干燥方式的核桃青皮對大腸桿菌的抑制效果Table 1 Antibacterial effect of different drying on E. coli

表2 不同干燥的核桃青皮對金黃色葡萄球菌的抑制效果Table 2 Antibacterial effect of different drying on Staphylococcus aureus

表3 不同干燥方式的核桃青皮對石榴干腐病菌的抑制效果Table 3 Antibacterial effect of different drying on Zythia versoniana Sacc.

2.2 不同干燥方式的核桃青皮對金黃色葡萄球菌的抑制效果

各樣品對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑和抑菌率見表2。不同干燥方式的核桃青皮對金黃色葡萄球菌的抑制作用有差別,P3的抑菌圈直徑和抑菌率大于相應體積分數(shù)P2,P2又大于P1,且差異明顯(p<0.05),表明干燥方式對核桃青皮的抑菌活性有明顯影響。同一處理的核桃青皮隨用量的減少,其抑菌圈直徑和抑菌率減小,即M1>M2>M3,且差異顯著(p<0.05)。雖然各樣品對金黃色葡萄球菌的抑制效果均低于5 mg/mL的克林霉素,但抑菌率均在60%以上,表明核桃青皮對金黃色葡萄球菌有較強的抑菌活性,并呈現(xiàn)劑量依賴效應。

2.3 不同干燥方式的核桃青皮對石榴干腐病菌的抑制效果

石榴干腐病菌在含各樣品培養(yǎng)基上生長的菌落直徑和抑菌率見表3。3種干燥方式的核桃青皮對石榴干腐病菌的抑制效果存在差別,P3的菌落直徑小于P2的,P2又小于P1,且差異明顯(p<0.05),表明干燥方式對核桃青皮的抑菌活性有明顯影響。同一處理的核桃青皮隨用量的減少,其菌落直徑增大,即M1

2.4 最小抑菌濃度測定

3種不同處理樣品對3種供試菌的最小抑菌濃度(MIC)見圖1,P1、P2和P3對大腸桿菌和石榴干腐病菌的MIC一致,分別是20、15和10 mg/mL;對金黃色葡萄球菌的MIC分別是15、10和5 mg/mL,均低于另2種供試菌,說明金黃色葡萄球菌對核桃青皮更敏感。P1、P2和P3相比,不同的干燥處理方式對核桃青皮中胡桃醌的含量會有明顯影響,這一結果表明處理方式可能是影響了核桃青皮中的胡桃醌的含量從而影響了抑菌效果。

表4 胡桃醌含量與MIC的相關性分析Table 4 The correlation of MIC and juglone

注:**在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關,n=3。仍然是P3的MIC最低,其次P2,最高的是P1。

圖1 不同干燥方式核桃青皮的最小抑菌濃度Fig.1 MIC of different drying methods of green walnut husk

2.5 樣品中胡桃醌含量及其與抑菌活性的關系

經(jīng)測定和計算知,P1、P2和P3樣品中胡桃醌的含量分別是8.04、9.46和11.84 mg/g。不同干燥方式使核桃青皮樣品中胡桃醌的含量是有較大差別的。核桃青皮中胡桃醌等成分由于結構中含有不飽和鍵不穩(wěn)定,易受外界因素的影響而發(fā)生降解[15]。P1為自然晾曬干燥,經(jīng)過3～5 d的風吹日曬,核桃青皮中的有效成分胡桃醌被氧化分解較多;P2為快速烘干,加熱處理時間相對較短,胡桃醌的損失相對較少;而P3為真空低溫條件下冷凍干燥,胡桃醌的損失最少。經(jīng)分析3種樣品中胡桃醌的含量,P1、P2和P3樣品中胡桃醌的含量分別是8.04、9.46和11.84 mg/g,也證實了這一點,說明干燥處理的方式會對胡桃醌的含量產(chǎn)生影響。因此,為更好地保持核桃青皮中有效成分的含量,要選擇適宜的加工方式。

供試的3種菌中大腸桿菌為革蘭氏陰性細菌,金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性細菌,石榴干腐病菌為真菌,3種類型的樣品對這3種供試菌的抑制作用雖然有一定的差別,但與陽性對照相比均表現(xiàn)較強的抑菌活性。喬永剛等[22]發(fā)現(xiàn)核桃青皮提取物對多種植物枯萎病菌也有抑制作用,表明核桃青皮具有廣譜的抑菌作用。普遍認為胡桃醌是核桃青皮中的主要有效成分[23-25],本文對樣品中胡桃醌含量與其MIC數(shù)據(jù)做了相關性分析,結果見表4。胡桃醌含量與對3種供試菌的抑菌活性之間的相關系數(shù)均為0.981,胡桃醌含量與抑菌活性之間呈極顯著正相關(p<0.01),也再一次印證胡桃醌是核桃青皮抑菌的主要有效成分,表明胡桃醌是核桃青皮抑菌的主要有效成分。

3 結論

自然干燥(P1)、65 ℃烘干(P2)及真空冷凍干燥(P3)核桃青皮的抑菌活性均表現(xiàn)為P3>P2>P1;P1、P2和P3對大腸桿菌和石榴干腐病菌的最小抑菌濃度(MIC)結果一致,分別為20、15和10 mg/mL,對金黃色葡萄球菌的MIC分別是15、10和5 mg/mL;P1、P2和P3樣品中胡桃醌的含量分別是8.04、9.46和11.84 mg/g,與其抑菌活性呈極顯著正相關(p<0.01)。因此,干燥方式對核桃青皮中胡桃醌含量有顯著影響,進而影響了核桃青皮的抑菌活性。低溫真空冷凍干燥能較好保持核桃青皮中胡桃醌含量,是一種理想的干燥方式。

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Effects of drying methods on the juglone content and antibacterial activity of green walnut husk

ZHANG Li-hua,LI Yan,ZHANG Pei,CHEN Qing,WANG Huan

(College of Life Science,Zaozhuang University,Zaozhuang 277160,China)

To explore the relationship between dry method and antibacterial activity of green walnut husk,the antibacterial activities of natural drying(P1),hot-air drying(P2)and vacuum freeze drying(P3)of green walnut husk were evaluated,usingEscherichiacoli,StaphylococcusaureusandZythiaversonianaSacc. as test microorganisms in this paper. Results showed that the three samples all had strong inhibition,and presented a dose-response relationship,namely M1>M2>M3(dose of walnut green husk extract were respectively 100(M1),80(M2),and 60(M3) mg/mL). The drying methods were characterized by P3>P2>P1. For P1,P2and P3,the minimum inhibition concentration(MIC)ofE.coliandZythiaversonianaSacc. were consistent. The doses were 20,15 and 10 mg/mL respectively. The MIC ofStaphylococcusaureuswere 15,10,and 5 mg/mL. The juglone content of samples were respectively 8.04(P1),9.46(P2),and 11.84(P3) mg/g,significant positive correlation with antibacterial activity(p<0.01). In conclusion,the drying methods could affect the juglone content and antibacterial activity of green walnut husk,vacuum freeze drying was an ideal way.

green walnut husk;drying method;juglone;antibacterial activity

2016-09-02

張立華(1968-)，男，博士，教授，研究方向：植物資源開發(fā)，E-mail：chinazhanglh@163.com。

山東省自然科學基金項目(ZR2013BL018)。

TS261.4

A

1002-0306(2017)10-0141-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.019