于?；?宋淑梅,佟長青,李 偉

(大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023)

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雙齒圍沙蠶β-1,3-葡萄糖苷酶分離純化及其酶學性質

于?；?宋淑梅,佟長青*,李 偉*

(大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023)

從雙齒圍沙蠶中提取、分離純化β-1,3-葡萄糖苷酶,并研究其酶學性質。通過80%飽和度(NH4)2SO4沉淀從雙齒圍沙蠶中得到粗β-1,3-葡萄糖苷酶,粗酶依次經(jīng)DEAE-52離子交換層析、Sephadex G-100凝膠過濾層析進行分離純化。酶純化倍數(shù)為35.74,回收率為39.49%。SDS-PAGE檢測表明其分子量為28.7 kDa。該酶最適溫度為50 ℃,最適pH為7,Km為8.2×10-4mol/L,Vmax為3.2×10-4μmol/h。金屬離子K+、Mg2+、Fe2+、Ba2+、Ca2+對β-1,3-葡萄糖苷酶酶活力影響較小,Al3+、Cu2+、Zn2+、Ag+對β-1,3-葡萄糖苷酶酶活力抑制較大,其中Zn2+抑制作用最強。雙齒圍沙蠶可作為β-1,3-葡萄糖苷酶的潛在來源。

雙齒圍沙蠶,β-1,3-葡萄糖苷酶,分離純化,酶學性質,Km

雙齒圍沙蠶(Perinereisaibuhitensis)是灘涂養(yǎng)殖的優(yōu)勢品種,具有很高的生態(tài)和經(jīng)濟價值。研究表明,沙蠶具有較高的營養(yǎng)價值,含有豐富的粗脂肪、粗蛋白、不飽和脂肪酸、人體必需的八種氨基酸以及多種礦物質和維生素[1-2]。鄒文秀等[3]對雙齒圍沙蠶的營養(yǎng)成分進行分析,發(fā)現(xiàn)雙齒圍沙蠶的主要成分依次為蛋白質、碳水化合物、灰分、粗脂肪,含量占干重的比例分別為66.75%、11.27%、8.65%、13.30%。劉向輝等[4]研究發(fā)現(xiàn)沙蠶組織內含有豐富的氨基酸(67.43%)、不飽和脂肪酸(14.24%,其中EPA為6.53%)以及Sn、Hg、Cu、Se、Zn、Cd等微量元素。

人們對沙蠶中生物活性物質進行了大量研究。如鄧志會等從沙蠶體內分離純化得到一種新型金屬蛋白酶(NVMP,28～32 kDa),并對這種沙蠶金屬蛋白酶對家兔新鮮血液的抗凝血和血栓溶解作用進行了研究[5-6]。張云龍等[7]分離純化得到一種等電點為3.0,相對分子質量為3.0×105Da左右的沙蠶蛋白酶(溶栓素)。潘衛(wèi)東等[8]從雙齒圍沙蠶中發(fā)現(xiàn)一種新的堿性蛋白,該堿性蛋白具有顯著抗菌活性及抗癌作用。然而到目前為止,從雙齒圍沙蠶中提取、純化出β-1,3-葡萄糖苷酶方面的研究還未見報道。

β-1,3-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)首次在苦杏仁中被發(fā)現(xiàn),后來發(fā)現(xiàn)它還廣泛存在于其他植物、動物腸道以及細菌、真菌、酵母、霉菌等微生物中[9-12]。它屬于纖維素酶類,能水解結合在末端的非還原性β-D-葡萄糖苷鍵,釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基。β-1,3-葡萄糖苷酶在食品領域有著廣泛的應用。它可以水解以糖苷形式存在的香氣成分,為果酒增香,提高果酒品質。β-1,3-葡萄糖苷酶還具有改良果汁風味的作用。目前,微生物源β-1,3-葡萄糖苷酶研究較多[13-17],而無脊椎動物源β-1,3-葡萄糖苷酶研究較少。雙齒圍沙蠶生活于高鹽環(huán)境中,其參與代謝的酶具有特殊性。本文以雙齒圍沙蠶為材料提取其中的β-1,3-葡萄糖苷酶,并對其性質進行初步探討,以期為利用雙齒圍沙蠶資源提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙齒圍沙蠶 購于大連市興工街水產(chǎn)品批發(fā)市場;對硝基苯-β-D-葡萄糖苷(p-Nitrophenylβ-D-glucopyranoside) 購于Sigma公司;DEAE-52纖維素陰離子交換劑、Sephadex G-100、低分子量標準蛋白 均購于北京索萊寶科技有限公司;三(羥甲基)氨基甲烷 國藥集團化學試劑有限公司。

GL21M型低溫冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;B-2A型組織搗碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;PHS-3C型精密pH計 上海精密科學儀器股份有限公司;BT100-1J型蠕動泵 保定蘭格恒流泵有限公司;FD-1型冷凍干燥機 上海博通經(jīng)貿有限公司;SBS-100型數(shù)控計滴自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司;85-1型磁力攪拌器 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;UV-1750型紫外分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司;DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;酶標儀 德國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1β-1,3-葡萄糖苷酶的提取分離 將新鮮的1 kg雙齒圍沙蠶清洗晾干后勻漿,加入3000 mL 0.9% NaCl溶液,4 ℃抽提過夜。然后9000 r/min、4 ℃條件下離心20 min,取上清液。加(NH4)2SO4至80%飽和度,沉淀過夜。然后9000 r/min、4 ℃條件下離心20 min,取沉淀。將沉淀溶于一定量去離子水中,透析后凍干,得到β-1,3-葡萄糖苷酶粗品,冷凍保藏備用。

取適量粗酶溶解于Tris-HCl緩沖液,于10000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清液加到平衡好的DEAE-52層析柱(2.5 cm×13 cm)中,待上清液全部吸附好后,先用Tris-HCl緩沖液洗脫除去未吸附的物質,然后用1 mol/L的NaCl的Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫,流速為0.75 mL/min,每管收集3 mL。檢測各管OD280和β-1,3-葡萄糖苷酶活力,收集有酶活力的層析組分進行透析凍干。

將經(jīng)DEAE-52分離后收集的具有糖苷酶活力組分,以Tris-HCl緩沖液配成10 mg/mL樣液,上樣于Sephadex G-100層析柱(2.5 cm×100 cm)中,然后用Tris-HCl緩沖液洗脫,流速為0.3 mL/min,每管收集3 mL。檢測各管OD280和糖苷酶活力,收集有活力的層析組分進行透析凍干。

1.2.2β-1,3-葡萄糖苷酶相對分子質量測定 采用SDS-PAGE,以低分子量標準蛋白為標準,測定β-1,3-葡萄糖苷酶相對分子質量。分離膠為15%聚丙烯酰胺,濃縮膠為5%聚丙烯酰胺。

1.2.3β-1,3-葡萄糖苷酶活力測定 分別取0、20、40、60、80、100、120、125 μL 0.1 mmol/L的對硝基苯酚溶液,125、105、85、65、45、25、5、0 μL H2O及100 μL HAc-NaAc緩沖液(pH5.4、0.05 mol/L)置于96孔板中,在37 ℃水浴中反應2 h,加入50 μL 0.5 mol/L Na2CO3溶液以終止反應,用酶標儀在405 nm波長下測其吸光值的變化。以OD值為縱坐標(y),對硝基苯酚量(×10-10mol)為橫坐標(x),得標準曲線為y=0.4905x+0.0166,R2=0.9996。

分別取50 μL 0.01 mg/mLβ-1,3-葡萄糖苷酶液,100 μL HAc-NaAc緩沖液(0.05 mol/L,pH5.4)以及100 μL對硝基苯-β-D-葡萄糖苷溶液(5 mg/mL)置于96孔板中,37 ℃水浴2 h,加入50 μL 0.5 mol/L的Na2CO3溶液終止反應,用酶標儀在405 nm處測定吸光值。

在一定溫度和pH下,將每分鐘生成1 μmol對硝基苯酚所消耗的酶的量定義為1個酶活力單位。根據(jù)對硝基苯酚濃度吸光度標準曲線,計算酶活力。

1.2.4β-1,3-葡萄糖苷酶的理化性質

1.2.4.1 溫度對β-1,3-葡萄糖苷酶活性的影響 分別取50 μL 0.01 mg/mLβ-1,3-葡萄糖苷酶溶液,100 μL HAc-NaAc緩沖液(0.05 mol/L,pH5.4)以及100 μL對硝基苯-β-D-葡萄糖苷溶液(10 mg/mL)置于96孔板中,分別放置在20、30、37、40、50、60、70、80 ℃的水浴鍋中,反應2 h后,加入50 μL 0.5 mol/L的Na2CO3溶液終止反應,在405 nm處測定吸光值,以考察溫度對β-1,3-葡萄糖苷酶活力的影響。以pH5.4、37 ℃反應2 h的酶活力(設為100%)為對照,考察不同溫度對酶活力影響,確定β-1,3-葡萄糖苷酶的最適反應溫度。

1.2.4.2 pH對β-1,3-葡萄糖苷酶活性的影響 分別取50 μLβ-1,3-葡萄糖苷酶樣品溶液,100 μL對硝基苯-β-D-葡萄糖苷溶液(10 mg/mL)以及100 μL pH分別為3、4、5、5.4、6、7、8、9、10的HAc-NaAc緩沖液(0.05 mol/L)置于96孔板中,37 ℃水浴2 h,然后加入50 μL 0.5 mol/L的Na2CO3溶液終止反應,用酶標儀在405 nm處測定吸光值,以考察pH對β-1,3-葡萄糖苷酶活力的影響。以pH5.4、37 ℃反應2 h的酶活力(設為100%)為對照,考察不同pH對酶活力的影響,確定糖苷酶的最適pH。

1.2.4.3 金屬離子對β-1,3-葡萄糖苷酶的影響 研究金屬離子K+、Mg2+、Fe2+、Ba2+、Ca2+、Al3+、Cu2+、Zn2+、Ag+對β-1,3-葡萄糖苷酶酶活力的影響,用HAc-NaAc緩沖液(0.05 mol/L,pH5.4)分別將KCl、MgCl2、FeSO4、BaCl2、CaCl2、Al(OH)3、CuSO4、Zn(CH3COO)2、AgNO3配制成濃度為0.1 g/mL的金屬離子溶液。分別取50 μL糖苷酶樣品溶液,100 μL對硝基苯-β-D-葡萄糖苷溶液(10 mg/mL)以及100 μL含不同金屬離子的HAc-NaAc緩沖液(0.05 mol/L,pH5.4)置于0.5 mL的離心管中,37 ℃水浴2 h,然后加入50 μL 0.5 mol/L的Na2CO3溶液終止反應。4 ℃,10000 r/min離心6 min,取上清于96孔板中,然后用酶標儀在405 nm處測定吸光值,用以考察金屬離子對糖苷酶活力的影響。以未加金屬離子的糖苷酶為對照,其相對酶活力為100%。

1.2.5β-1,3-葡萄糖苷酶動力學 分別取50 μL糖苷酶樣品溶液、100 μL HAc-NaAc緩沖液(0.05 mol/L,pH5.4)以及100 μL濃度分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mg/mL的對硝基苯-β-D-葡萄糖苷溶液,置于96孔板中,37 ℃水浴2 h,然后加入50 μL 0.5 mol/L的Na2CO3溶液終止反應,然后用酶標儀在405 nm處測定吸光值。

表1 β-1,3-葡萄糖苷酶分離純化各步的結果Table 1 Summary of the purification for β-1,3-glucosidase

以單位時間內產(chǎn)物生成量表示反應速率v,采用Lineweaver-Burk作圖法作圖,以1/v為縱坐標,1/[S]為橫坐標,繪制雙倒數(shù)曲線,橫截距即為-1/Km,縱截距即為1/Vmax,進而得到糖苷酶動力學方程,求出Km和Vmax值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示,用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析,用Duncan法進行多重比較,顯著性水平設為0.05。

2 結果與討論

2.1 糖苷酶的分離純化

采用80%飽和度(NH4)2SO4沉淀法從雙齒圍沙蠶中得到粗β-1,3-葡萄糖苷酶6 mL(50 mg/mL)通過DEAE-52離子交換層析進行分離。用Tris-HCl緩沖液進行洗脫,當OD280不再變化后,再用1 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫,檢測各管洗脫液的OD280值和酶活力值(OD405),得層析圖如圖1。如圖1所示,經(jīng)DEAE-52層析后得到兩個主要蛋白(OD280)峰,第二個蛋白峰組具有β-1,3-葡萄糖苷酶活力。收集具有酶活力的組分,冷凍干燥。

圖1 粗酶經(jīng)DEAE-52離子交換層析分離純化Fig.1 Ion exchange chromatography of crude enzyme on DEAE-52

將上述收集的具有糖苷酶活力的樣品繼續(xù)經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾層析進一步分離純化。同時檢測OD280和酶活力值(OD405),結果如圖2。經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾層析后得到一個蛋白峰,且該層析峰具有β-1,3-葡萄糖苷酶活力。收集具有糖苷酶活力的組分,冷凍干燥。

圖2 Sephadex G-100分子篩層析Fig.2 Gel filtration chromatography on Sephadex G-100

通過(NH4)2SO4沉淀、DEAE-52離子交換層析、Sephadex G-100層析得到的β-1,3-葡萄糖苷酶進行SDS-PAGE電泳,結果如圖3所示。由圖3可知,β-1,3-葡萄糖苷酶分子量約為28.7 kDa。

圖3 β-1.3-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE結果Fig.3 SDS-PAGE of β-1,3-glucosidase注:1.標準蛋白;2.DEAE-52分離得到的β-1,3-葡萄糖苷酶;3.Sephadex G-100分離得到的β-1,3-葡萄糖苷酶。

由表1可知,隨著分離純化步驟的進行,β-1,3-葡萄糖苷酶的單位酶活力迅速增強,由最初的3.83 U/mg增加到136.88 U/mg,尤其經(jīng)過DEAE-52離子交換層析單位酶活力達到92.44 U/mg。但是在β-1，3-葡萄糖苷酶單位酶活力增強的同時,總活力因為蛋白量的損失整體呈逐漸下降的趨勢,在經(jīng)過Sephadex G-100凝膠過濾層析分離后,回收率為39.49%,純化倍數(shù)為35.74。

2.2 溫度對酶活力的影響

溫度對酶活力的影響結果如圖4所示。當溫度小于50 ℃時,β-1,3-葡萄糖苷酶的酶活力隨著溫度的升高而急劇升高,當溫度大于50 ℃時,酶活力隨著溫度的升高而下降。即β-1,3-葡萄糖苷酶的最適反應溫度為50 ℃。?elik[13]和Kengen[14]實驗結果表明,β-1,3-葡萄糖苷酶的最適溫度35～110 ℃之間都有分布。本研究從雙齒圍沙蠶中提取的糖苷酶的最適反應溫度為50 ℃,較高,可能是因為要適應極端的海洋生存環(huán)境。

圖4 溫度對β-1,3-葡萄糖苷酶的影響Fig.4 Effect of temperature on the enzyme activity of β-1,3-glucosidase

2.3 pH對酶活力的影響

pH對酶活力的影響結果如圖5所示。隨pH的升高,β-1,3-葡萄糖苷酶的酶活力先升高后下降,最適pH為7。

圖5 pH對β-1,3-葡萄糖苷酶的影響Fig.5 Effect of pH on the enzyme activity of β-1,3-glucosidase

2.4 金屬離子對酶活力的影響

金屬離子對酶活力的影響結果如圖6所示。在K+、Mg2+、Fe2+、Ba2+、Ca2+等存在時,β-1,3-葡萄糖苷酶酶活力受影響較小;而添加Al3+、Cu2+、Zn2+、Ag+時β-1,3-葡萄糖苷酶酶活力較低;且添加Zn2+時,相對酶活力僅達15.33%。

圖6 金屬離子對β-1,3-葡萄糖苷酶的影響Fig.6 The effect of metal ions on enzyme activity of β-1,3-glucosidase

2.5 糖苷酶的動力學

通過不同底物濃度[S]得到相應反應速率v,采用Lineweaver-Burk作圖法作圖,以1/v為縱坐標,1/[S]為橫坐標,繪制雙倒數(shù)曲線,結果如圖7所示。根據(jù)雙倒數(shù)曲線方程,計算出β-1,3-葡萄糖苷酶催化對硝基苯-β-D-葡萄糖苷的最大反應速度Vmax為3.2×10-4μmol/h,Km為8.2×10-4mol/L。

圖7 β-1,3-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk圖Fig.7 Lineweaver-Burk of β-1,3-glucosidase

3 結論

本研究從雙齒圍沙蠶中通過DEAE-52離子交換層析、Sephadex G-100凝膠過濾層析提取出分子量為28.7 kDa的β-1.3-葡萄糖苷酶,提取回收率為39.49%。雙齒圍沙蠶β-1.3-葡萄糖苷酶最適溫度為50 ℃,最適pH為7,以對硝基苯-β-D-葡萄糖苷為底物時Vmax和Km分別為3.2×10-4μmol/h和8.2×10-4mol/L。金屬離子K+、Mg2+、Fe2+、Ba2+、Ca2+對β-1,3-葡萄糖苷酶酶活力影響較小,Al3+、Cu2+、Zn2+、Ag+對β-1,3-葡萄糖苷酶酶活力抑制較大,其中Zn2+抑制作用最強。研究結果可為雙齒圍沙蠶的利用及糖苷酶藥物開發(fā)利用提供了基礎數(shù)據(jù)。

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Purification and characterization ofβ-1,3-glucosidase fromPerinereisaibuhitensis

YU Hai-hui,SONG Shu-mei,TONG Chang-qing*,LI Wei*

(College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

To isolate and purifyβ-1,3-glucosidase fromPerinereisaibuhitensisand study its properties,the crudeβ-1,3-glucosidase was obtained from theP.aibuhitensisby ammonium sulfate precipitation,which was purified using ion-exchange chromatography on DEAE-52 and gel filtration chromatography on Sephadex G-100. Finally theβ-1,3-glucosidase was purified 35.74-fold and 39.49% recovery yield. Theβ-1,3-glucosidase was estimated to be 28.7 kDa with SDS-PAGE. The optimal temperature for theβ-1,3-glucosidase was 50 ℃. The optimum pH was 7. The Kmand Vmaxofβ-1,3-glucosidase were 8.2×10-4mol/L and 3.2×10-4μmol/h,respectively.The enzyme activity was not affected by K+,Mg2+,Fe2+,Ba2+and Ca2+,while inactivated by Al3+,Cu2+,Zn2+and Ag+,and especially strongly inactivated by Zn2+.P.aibuhitensismight be a candidate resource in producingβ-1,3-glucosidase.

Perinereisaibuhitensis;β-1,3-glucosidase;isolation and purification;enzymatic properties;Km

2016-10-18

于?；?1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail：597215153@qq.com。

*通訊作者:佟長青(1976-)，男，博士，副教授，研究方向：海洋生物活性物質，E-mail：changqingtong@dlou.edu.cn。 李偉(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：aisingioro@hotmail.com。

國家海洋公益性行業(yè)專項(201205022-7)；項目國家自然基金(31571916)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)10-0227-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.035