田琳 張珣

（沈陽(yáng)大學(xué)環(huán)境學(xué)院 區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110044）

雌酮脅迫農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化研究

田琳 張珣

（沈陽(yáng)大學(xué)環(huán)境學(xué)院 區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110044）

雌酮是具有雌效應(yīng)的天然類固醇雌激素之一，具有高毒性、難降解的特性，可通過(guò)食物鏈蓄積于體內(nèi)，威脅人類和動(dòng)物的健康。使用PCR-DGGE技術(shù)分析雌酮脅迫下農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，雌酮濃度越高，對(duì)微生物種群的影響越深，種群的親緣關(guān)系也就越復(fù)雜。在雌酮濃度為500 ng/kg至2 000 ng/kg時(shí)，微生物群落多樣性隨著E1濃度的增加而減小，超過(guò)某一值時(shí)其多樣性則會(huì)迅速增加，繼續(xù)增大E1濃度，多樣性增加趨勢(shì)則逐漸變緩。雌酮在微生物作用下可以轉(zhuǎn)變?yōu)榇贫肌⒋迫己徒Y(jié)合態(tài)的E1-3G，這種相互轉(zhuǎn)變也會(huì)給微生物菌群多樣性帶來(lái)更加復(fù)雜的變化。

雌酮；農(nóng)田土壤；微生物群落結(jié)構(gòu)；PCR-DGGE

類固醇雌激素作為環(huán)境激素中雌激素效應(yīng)最高一類物質(zhì)［1］，環(huán)境曝露會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物雄性繁殖能力下降、生殖系統(tǒng)發(fā)育異常，男性精子數(shù)量減少、質(zhì)量下降，女性生理現(xiàn)象混亂，內(nèi)分泌系統(tǒng)異?？簥^或抑制，神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂，激素依賴性器官腫瘤發(fā)病率明顯升高等［2，3］。雌酮（Estrone，E1）作為具有雌效應(yīng)的天然類固醇雌激素之一，在極低的濃度水平即可使水生生物性腺功能異常，具有高毒性、難降解的特性，通過(guò)食物鏈在體內(nèi)蓄積［4］，進(jìn)而威脅人類和動(dòng)物的健康。類固醇雌激素主要由人與動(dòng)物卵巢合成分泌，通過(guò)污水處理廠和禽畜養(yǎng)殖場(chǎng)兩種主要途徑進(jìn)入環(huán)境［5，6］。研究表明處于孕期的女性E1排泄量最多可達(dá)到 1 194 μg/d［7］。國(guó)內(nèi)外各種水體及污水廠出水中均檢測(cè)到較高濃度的E1［8，9］。2007年，中國(guó)天然類固醇雌激素的總排放量高達(dá)10.6 t［10］。E1被土壤微生物降解轉(zhuǎn)化的同時(shí)，微生物也會(huì)受到E1的影響（如細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、酶的產(chǎn)生及效用改變和DNA突變等），具體表現(xiàn)在種群的生長(zhǎng)與消亡；不同種微生物對(duì)E1的敏感程度不同，土壤微生物群落作為混合性的微生物群，E1作用下表現(xiàn)為群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變將直接影響該植被上農(nóng)作物的生長(zhǎng)狀況，進(jìn)而影響高級(jí)生態(tài)系統(tǒng)的健康。

本文以雌酮作為脅迫因子，以農(nóng)田土壤作為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)探討不同雌酮濃度、不同培養(yǎng)時(shí)間下農(nóng)田土壤微生物群落變化，旨在了解雌酮脅迫下農(nóng)田土壤微生物群落動(dòng)態(tài)變化特征。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤：農(nóng)田土壤，采自沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗(yàn)田。該土壤常年種植水稻，并未施用畜禽糞便或市政污水。主要理化性質(zhì)如下：有機(jī)質(zhì)含量23.6 g/kg，總氮1.54 g/kg，有效磷71.6 mg/kg，總磷1.14 g/kg，速效鉀120 mg/kg，總鉀16.7 g/kg，pH值7.62，類固醇雌激素未檢出。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)的主要培養(yǎng)裝置為塑料盒，其長(zhǎng)度、寬度和高度分別為490、350和160 mm。將15 kg的農(nóng)田土壤裝入塑料盒，500 mL不同濃度的雌酮溶液分別加入到各塑料盒中，最后使得各裝置的終含量分別為500、1 000、1500和2 000 ng/kg，于室溫培養(yǎng)。通過(guò)攪拌器使各溶液與農(nóng)田土壤樣品混合，以確保所有的農(nóng)田土壤樣品充分混合。每個(gè)塑料盒每次收集20 g再次充分混合的土壤樣品，重復(fù)3次，曝露時(shí)間分別為 0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60 d。將樣品保存在-80℃用于分子生物學(xué)分析。

1.2.2 土壤中總DNA提取 本實(shí)驗(yàn)使用E.Z.N.ATMSoil DNA Kit試劑盒（美國(guó)OMEGA公司）提取農(nóng)田土壤樣品中的總DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其提取結(jié)果?？侱NA保存于-20℃冰箱中。

1.2.3 PCR-DGGE分析 PCR的擴(kuò)增區(qū)域是細(xì)菌16S r DNA的V3可變區(qū)，選用引物對(duì)338F和518R。選用的上游引物P1（5'端連接GC夾）為GC-338F（5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGGG CCT ACG GGA GGC AGC AG-3'）和下游引物P2為518R（5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'）［11］，直接對(duì)總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 0.1 μL，引物P1和P2各0.75 μL，2×GoTaq buffer 25 μL，無(wú)核酸酶水23.4 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，65℃退火1 min（每個(gè)循環(huán)降低1℃），72℃延伸1 min，一共10個(gè)循環(huán)；然后94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。所有的PCR產(chǎn)物約240 bp，可進(jìn)行DGGE分析。

DGGE實(shí)驗(yàn)按照Webster等［12］方法進(jìn)行并適當(dāng)修改。PCR 產(chǎn)物分離使用 DCodeTM 通用突變檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，Dcode，USA.）進(jìn)行DGGE電泳分析。DGGE電泳條件為8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為35%-65%。電泳電壓為150 V，電泳溫度為60℃，緩沖體系是1×TAE緩沖液，電泳時(shí)間為7.5 h。電泳后，將凝膠用EB（溴化乙錠）染色30 min并在紫外光下觀察。為獲得清晰的圖像，將使用凝膠照片系統(tǒng)（GelDoc，Bio-Rad，USA.）進(jìn)行拍照。

1.2.4 DGGE圖譜分析 使用Quantity one圖像分析軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行分析（4.0版本，Bio-Rad，USA.）。該軟件能夠識(shí)別同一個(gè)凝膠不同泳道上占據(jù)相同位置的條帶。兩個(gè)樣本的相似性可以通過(guò)戴斯系數(shù)（Cs）條帶模式進(jìn)行估測(cè)（公式1）：

其中，j是兩條DGGE泳道中共有的條帶數(shù)，a和b分別是兩條DGGE泳道各自的條帶數(shù)量。用非加權(quán)平均法（UPGMA）檢驗(yàn)農(nóng)田土壤樣品的相似性。

基于DGGE條帶數(shù)據(jù)而進(jìn)行的香農(nóng)-威納指數(shù)（H'），豐富度（S）和均勻度（E）的計(jì)算比較了細(xì)菌多樣性的變化。H'計(jì)算公式如下（公式2） pi是指i條帶出現(xiàn)在一條泳道中的概率。S 是一條凝膠泳道的總條帶數(shù)，E計(jì)算方法為H'/ lnS。

2 結(jié)果

2.1 雌酮對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

雌酮濃度為500、1 000、1 500、2 000 ng/kg時(shí)各個(gè)不同的時(shí)間段的細(xì)菌的16S rDNA基因的PCR產(chǎn)物DGGE電泳圖譜如圖1，曝露時(shí)間分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和 60 d。在分離圖譜中，每個(gè)可以區(qū)分的條帶都代表一個(gè)獨(dú)立的細(xì)菌種群［13］。E1對(duì)農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生影響。例如，條帶1與條帶4只存在于E1濃度為500和1 000 ng/kg的土壤樣本中，條帶6只存在于1 500與2 000 ng/kg濃度下，且顏色均是從無(wú)到有并逐漸變亮；而條帶5在4個(gè)濃度下均存在。條帶2與3僅存在于E1濃度為500 ng/kg下農(nóng)田土樣中，區(qū)別在于條帶3在曝露前期就出現(xiàn)，條帶2是從曝露中期出現(xiàn)。條帶7僅出現(xiàn)在E1濃度為2 000 ng/kg的曝露前期，急速出現(xiàn)至鼎盛后又迅速消失。條帶8出現(xiàn)于E1濃度為2 000 ng/kg的農(nóng)田土樣曝露中后期。

圖1 農(nóng)田土壤在不同雌酮濃度不同暴露時(shí)間細(xì)菌16S rDNA的DGGE分析

2.2 相似性分析結(jié)果

圖2是不同雌酮濃度下不同曝露時(shí)間的農(nóng)田土壤樣本與原始土壤樣本的戴斯系數(shù)。與初始農(nóng)田土壤樣品相比，在第一個(gè)5 d內(nèi)，由于剛加入雌酮，土壤微生物群落原始平衡被破壞，E1濃度為500 ng/kg的土壤樣本的Cs平均下降了59.7%，E1濃度為1 000 ng/kg的土壤樣本的Cs平均下降了17.1%，E1濃度為15 00 ng/kg的土壤樣本的Cs平均下降了32.8%，E1濃度為2 000 ng/kg的土壤樣本的Cs平均下降了62.8%。E1濃度為1 500 ng/kg的農(nóng)田土壤的Cs直降到第10 d才暫時(shí)停止下降趨勢(shì)，降低了55%。曝露時(shí)間為60 d時(shí)，E1濃度500 ng/kg農(nóng)田土壤樣品的Cs與初始樣品只有30.6%的相似性；曝露時(shí)間為25 d時(shí)，E1濃度2 000 ng/kg農(nóng)田土樣的Cs僅為21.3%。E1濃度為 500 ng/kg的農(nóng)田土壤在第一個(gè)5 d之后，隨著曝露時(shí)間的增加Cs波動(dòng)平緩。E1濃度為1 000 ng/kg的農(nóng)田土壤在曝露前期Cs的變化較緩和，第30 d之后Cs隨著曝露時(shí)間的增加而劇烈變化。E1濃度為1 500 ng/kg的農(nóng)田土壤樣本在曝露時(shí)間內(nèi)Cs始終都在劇烈波動(dòng)。E1濃度為2 000 ng/kg的農(nóng)田土壤的Cs在加入E1的前期劇烈波動(dòng)，從第25 d到第40 d時(shí)波動(dòng)相對(duì)平緩，第40 d后又出現(xiàn)巨大波動(dòng)。

不同雌酮濃度的農(nóng)田土壤樣品，其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖譜有著顯著差異（圖3）。在E1刺激的農(nóng)田土壤樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出很大程度的變化，特別是E1濃度為2 000 ng/kg的農(nóng)田土壤樣品。結(jié)果表明，E1濃度越高，對(duì)微生物種群的影響越深，種群的親緣關(guān)系也就越復(fù)雜。E1濃度為500 ng/kg、1 000 ng/kg、1 500 ng/kg、2 000 ng/kg時(shí)，曝露內(nèi)所有實(shí)驗(yàn)土壤的遺傳相似性分別為37%、71%、47%和39%。

2.3 多樣性分析結(jié)果

多樣性指數(shù)能夠有效地表征微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性。香農(nóng)-維納指數(shù)越高，微生物群落的多樣性越大。除香農(nóng)-維納指數(shù)外，豐富度和均勻度也是多樣性指數(shù)表征的重要參數(shù)：物種的總數(shù)即物種豐富度（S），不同物種個(gè)體數(shù)量的分布即物種均勻度（E）。

雌酮污染農(nóng)田土壤樣本中微生物群落的多樣性指數(shù)如表1所示。在曝露前，原農(nóng)田土壤的H'在3.581-3.582之間，S 均為53，E 在0.908-0.909之間，說(shuō)明在添加污染物前，農(nóng)田土壤系統(tǒng)具有穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)和活性，同時(shí)具有基本的同質(zhì)性。橫向?qū)Ρ炔煌珽1濃度發(fā)現(xiàn)，濃度為500 ng/kg和1 500 ng/kg的農(nóng)田土壤中微生物群落多樣性指數(shù)明顯大于另外兩組。E1濃度為500 ng/kg時(shí)農(nóng)田土壤H'、S、E在曝露期間明顯高于其余E1濃度曝露下的H'、S、E。E1濃度為1 000 ng/kg的農(nóng)田土壤的多樣性隨著曝露時(shí)間的增加總體呈下降趨勢(shì)；而E1濃度為500 ng/kg、1 500 ng/kg和2 000 ng/kg的農(nóng)田土壤的多樣性隨著時(shí)間的推移總體趨勢(shì)在逐步增長(zhǎng)，且濃度為2 000 ng/kg時(shí)其增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯高于濃度為500 ng/kg與1 500 ng/kg時(shí)的增長(zhǎng)趨勢(shì)?？v向?qū)Ρ绕芈稌r(shí)間，E1濃度為500 ng/kg農(nóng)田土壤在第30 d時(shí)H'、S、E均高于其余曝露時(shí)間，但總體波動(dòng)都比較平緩。E1濃度為1 000 ng/kg的土樣在第20 d時(shí)H'、S、E達(dá)到最高值，之后在緩慢下降。濃度為2 000 ng/kg時(shí)，第40 d時(shí)的H'、S、E均達(dá)到最大值，且該濃度下多樣性總體波動(dòng)程度高于濃度為500 ng/kg和1 000 ng/kg時(shí)。E1濃度為1 500 ng/kg的農(nóng)田土壤在曝露時(shí)間內(nèi)，當(dāng)S達(dá)到最大時(shí)，H'、E并沒(méi)有達(dá)到最大，相比與其他濃度的微生物群落，此濃度下微生物群落顯然是個(gè)不穩(wěn)定的體系。

圖2 不同雌酮濃度不同暴露時(shí)間下農(nóng)田土樣微生物群落的戴斯系數(shù)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)相似性與多樣性分析結(jié)果表明，在E1濃度為500 ng/kg至2 000 ng/kg之間，隨著E1濃度的增大，其對(duì)微生物的影響增大，微生物生長(zhǎng)受到抑制，多樣性降低；可能因?yàn)樵械膬?yōu)勢(shì)微生物因E1濃度的增大而逐步消亡（例如，條帶2、3代表的種群），或者有可能已經(jīng)出現(xiàn)新物種，只是新物種仍處于適應(yīng)生長(zhǎng)階段，其在數(shù)量上并沒(méi)有占據(jù)主要地位，故而在E1濃度為1 000 ng/kg的曝露后期微生物群落多樣性都在不斷下降；當(dāng)超過(guò)某一濃度時(shí)，其對(duì)微生物的影響促使抗E1和可以有效降解E1的新型微生物（如條帶6代表的種群）迅速適應(yīng)、大量生長(zhǎng)并逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，使得在E1濃度為1 500 ng/kg時(shí)，整個(gè)曝露期間內(nèi)微生物多樣性呈現(xiàn)平穩(wěn)增長(zhǎng)；繼續(xù)加大濃度，E1為2 000 ng/kg時(shí)雖然在整個(gè)曝露階段微生物多樣性仍在緩慢持續(xù)增長(zhǎng)，但是同1 500 ng/kg時(shí)增長(zhǎng)趨勢(shì)相比，此濃度下的增長(zhǎng)趨勢(shì)變緩，其原因有可能是原優(yōu)勢(shì)微生物受到一定的抑制作用進(jìn)而消亡（例如，條帶7所代表的種群），或者新式微生物出現(xiàn)并處于逐步適應(yīng)階段（例如，條帶8所代表的種群）。

E1在土壤中的吸附量的多少會(huì)影響其被微生物降解轉(zhuǎn)化的多少。劉建林［14］與吳喬龍［15］的研究表示，雌激素在土壤中吸附是自發(fā)放熱過(guò)程，且在24 h內(nèi)達(dá)到吸附平衡。而E1在土壤中的吸附作用受離子強(qiáng)度、pH、腐殖酸及其他共存污染物的共同作用。石月娥［16］發(fā)現(xiàn)E1在砂質(zhì)壤土和粉砂性粘土中的吸附平衡時(shí)間延長(zhǎng)約300%。

研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，E1與E2在生物降解過(guò)程中可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化或單向轉(zhuǎn)化，且在E1的降解過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了E3［17］。同時(shí)E1在微生物酯化作用下也可形成結(jié)合態(tài)的E1-3G（G是葡萄糖苷酸）。類固醇雌激素之間的相互轉(zhuǎn)化也會(huì)給微生物菌群多樣性帶來(lái)更為復(fù)雜的變化。張照韓［18］通過(guò)等摩爾比與等毒性單位復(fù)合的方式研究二元雌激素復(fù)合效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，除EE2和E1復(fù)合體系呈現(xiàn)拮抗作用外，其它復(fù)配體系均呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，且復(fù)合作用效應(yīng)的類型及強(qiáng)度與共存物質(zhì)的種類及各種物質(zhì)的比例有關(guān)。

王凌云［19］發(fā)現(xiàn)E1分子中C17-C13鍵級(jí)最低，因此E1可能會(huì)通過(guò)環(huán)開(kāi)裂生成小分子羧酸等易降解物質(zhì)。Ascenzo等［20］發(fā)現(xiàn)，即使經(jīng)過(guò)最徹底的發(fā)酵E1仍有一定量的殘留。目前對(duì)于環(huán)境介質(zhì)（如土壤）中類固醇雌激素的代謝過(guò)程仍沒(méi)有確定的途徑，本實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步研究在該類農(nóng)田土壤下E1的轉(zhuǎn)化途徑與代謝過(guò)程。不同種類固醇雌激素對(duì)微生物菌群的影響不同，這種情況與復(fù)合污染物類似。故針對(duì)單一污染物下分析微生物群落變化存在不確定的因素。因此，后續(xù)研究擬篩選有效降解類固醇雌激素的降解菌，并研究降解菌的降解特性。

圖3 不同雌酮濃度不同暴露時(shí)間農(nóng)田土樣的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

表1 不同雌酮濃度刺激農(nóng)田土壤的微生物群落多樣性指數(shù)

4 結(jié)論

PCR-DGGE指紋技術(shù)可以有效分析雌酮污染農(nóng)田土壤樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。雌酮濃度和曝露時(shí)間的變化能夠?qū)ξ⑸锏幕钚院凸δ墚a(chǎn)生影響，進(jìn)而造成微生物群落變化。

（1）經(jīng)戴斯系數(shù)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖譜分析可知，雌酮濃度越高，對(duì)微生物種群的影響越深，種群的親緣關(guān)系也就越復(fù)雜。（2）經(jīng)不同曝露時(shí)間與不同雌酮濃度微生物群落多樣性指數(shù)對(duì)比分析可知，在一定濃度范圍內(nèi)，微生物群落多樣性隨著E1濃度的增加而減小，超過(guò)某一值時(shí)其多樣性則會(huì)迅速增加，繼續(xù)增大E1濃度，多樣性增加趨勢(shì)則逐漸變緩。（3）雌酮可以轉(zhuǎn)變?yōu)镋2、E3以及在微生物酯化作用下形成結(jié)合態(tài)的E1-3G，這種相互轉(zhuǎn)變也會(huì)給微生物菌群多樣性帶來(lái)更加復(fù)雜的變化。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Study on the Changes of Soil Microbial Community Structure in Farmland by Estrone Stress

TIAN Lin ZHANG Xun
（College of Environment/Key Laboratory of Regional Environment and Eco-Remediation，Ministry of Education，Shenyang University，Shenyang 110044）

Estrone is one of natural steroidal estrogens which have female effect and characterizes by high toxicity and refractory. It can accumulate in the body through the food chain，threatening human and animal health. In this study，PCRand DGGE was used to analyze the variation of the microbial community structure in estrone-contaminated farmland soil samples. The results showed that the higher the concentration of estrone，the deeper the effect on the microbial population，and the more complex the phylogenetic relationship among populations. When the concentration of estrone was 500 ng/kg to 2 000 ng/kg，the diversity of microbial community decreased with the increase of E1 concentration；the diversity increased rapidly when the concentration of estrone was over a certain value，and the increase trend of diversity gradually became slower when the concentrations of E1 continuously increased. Estrone in the presence of microorganisms can be transformed to estradiol，estriol and bound-state E1-3G，this transformation brings more complex changes to the microbial community diversity.

estrone；soil in farmland；microbial community structure；PCR-DGGE

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0861

2016-09-12

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（41472237），遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（LJQ2015077），遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃面上項(xiàng)目（201602530）

田琳，女，碩士研究生，研究方向：土壤污染生態(tài)修復(fù)治理；E-mail：opqrvu@163.com

張珣，男，副教授，研究方向：土壤污染生態(tài)修復(fù)治理；E-mail：zhangeasy@sohu.com