孫海燁張梁，2李由然顧正華丁重陽(yáng)，2石貴陽(yáng)，2

（1. 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122）

利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白研究不同啟動(dòng)子在乳酸克魯維酵母中的功能

孫海燁1張梁1，2李由然1顧正華1丁重陽(yáng)1，2石貴陽(yáng)1，2

（1. 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122）

以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因（egfp）為報(bào)告基因評(píng)價(jià)不同啟動(dòng)子在乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）中的轉(zhuǎn)錄功能，尋找高效表達(dá)外源蛋白的啟動(dòng)子。以改造后載體pKLAC1*為基礎(chǔ)，PCR克隆來(lái)源于K. lactis、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和Spathaspora passalidarum中7個(gè)不同的啟動(dòng)子，采用重疊延伸PCR分別與egfp融合后插入pKLAC1*，Bst XI線性化重組表達(dá)載體后電轉(zhuǎn)化K. lactis GG799獲得重組菌，利用特異性引物PCR擴(kuò)增法快速篩選獲得不同啟動(dòng)子調(diào)控下的單拷貝整合重組菌，通過(guò)定性和定量分析綠色熒光蛋白（EGFP）的表達(dá)，比較不同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，K. lactis來(lái)源的pKladh4、pKlmal22，S. cerevisiae來(lái)源的pScgal7、pScgpd1，S. passalidarum來(lái)源的pSpmal1、pSpmal6、pSpgal1均成功調(diào)控EGFP的表達(dá)。熒光分光光度計(jì)定量測(cè)定結(jié)果表明，重組菌在pKladh4、pScgal7、pScgpd1調(diào)控下熒光強(qiáng)度分別為2.82、2.92和4.74，且在相應(yīng)的誘導(dǎo)條件下轉(zhuǎn)錄能力分別提高了13%、57%和22%，均高于當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的強(qiáng)啟動(dòng)子pKllac4（熒光強(qiáng)度為2.13）。探究了不同來(lái)源啟動(dòng)子在K. lactis中的功能，pKladh4、pScgal7、pScgpd1具有高效起始轉(zhuǎn)錄能力，其中pScgpd1在K. lactis中的應(yīng)用為首次報(bào)道。

乳酸克魯維酵母；啟動(dòng)子；增強(qiáng)型綠色熒光蛋白；單拷貝整合；熒光強(qiáng)度

乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）是美國(guó)FDA（Food and Drug Administration）認(rèn)定為食品安全級(jí)（Generally regarded as safe，GRAS）的酵母菌，具有碳源利用范圍廣、生長(zhǎng)速率快、能夠分泌高分子量蛋白、不會(huì)對(duì)蛋白高度糖基化以及不產(chǎn)生內(nèi)毒素等優(yōu)勢(shì)［1］。同時(shí)，與甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母相比，K. lactis在發(fā)酵過(guò)程不需要添加有毒性的誘導(dǎo)物及防爆設(shè)備［2］，并且分泌外源蛋白的能力高于S. cerevisiae［3］，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域已實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)及應(yīng)用［4］。此外，2004年Dujon等［5］完成了K. lactis的全基因組測(cè)序，有利于深入了解并合理改造該菌株。然而，K. lactis在外源蛋白分泌表達(dá)中仍存在瓶頸，其蛋白產(chǎn)量還有較大的提升空間。目前，很多研究者在發(fā)酵條件優(yōu)化，載體系統(tǒng)包括高效信號(hào)肽、強(qiáng)啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記和整合方式等的選擇，宿主菌的工程改造包括糖基化基因的敲除、分子伴侶的共表達(dá)等方面進(jìn)行了探索，以期獲得高效分泌表達(dá)外源蛋白的工程菌株［1，6］。

啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的DNA序列，一般由100-1 000個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成，是RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，行使起始基因轉(zhuǎn)錄的功能［7，8］。作為基因表達(dá)調(diào)控的順式元件，啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控中占據(jù)關(guān)鍵的地位，其活性高低在很大程度上影響基因的表達(dá)水平，進(jìn)而影響代謝途徑的效率以及外源蛋白的產(chǎn)量［9］。目前，一些學(xué)者在實(shí)驗(yàn)室水平利用個(gè)別啟動(dòng)子進(jìn)行了初步的應(yīng)用研究，但是在K. lactis中針對(duì)啟動(dòng)子的系統(tǒng)理論研究鮮有報(bào)道［6］，用于調(diào)控外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子選擇少，缺乏對(duì)不同啟動(dòng)子間功能比較的研究，限制了進(jìn)一步挖掘功能良好的啟動(dòng)子元件。因此，評(píng)價(jià)不同啟動(dòng)子在K. lactis中的轉(zhuǎn)錄功能，對(duì)于高效表達(dá)外源蛋白具有重要的意義。

通常利用報(bào)告基因的表達(dá)量來(lái)評(píng)價(jià)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性及功能，常用的報(bào)告基因包括β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）、氯霉素乙肽轉(zhuǎn)移酶基因（cat）、熒光素酶基因（luc）和綠色熒光蛋白基因（gfp）。GFP是從水母（Aequorea victoria）體內(nèi)克隆得到的一種熒光蛋白，經(jīng)紫外光和藍(lán)光激發(fā)無(wú)需輔助因子及底物即可發(fā)射穩(wěn)定的綠色熒光，具有檢測(cè)方便、活體表達(dá)、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害、無(wú)種族和組織特異性等優(yōu)點(diǎn)，在分子生物學(xué)、生物傳感器、細(xì)胞生物學(xué)以及藥物研究中得到廣泛的應(yīng)用［10，11］。通過(guò)對(duì)gfp基因進(jìn)行突變改造，獲得增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP），與GFP相比其蛋白合成、折疊效率及熒光強(qiáng)度更高［12］。

為了發(fā)揮K. lactis作為宿主菌株表達(dá)外源蛋白的優(yōu)勢(shì)，基于當(dāng)前針對(duì)K. lactis中不同啟動(dòng)子功能比較的研究相對(duì)匱乏的現(xiàn)狀，亟待開展啟動(dòng)子功能的研究來(lái)尋找具有高效啟動(dòng)外源蛋白表達(dá)能力的啟動(dòng)子。本研究以egfp為報(bào)告基因，初步研究乙醇脫氫酶啟動(dòng)子（padh）、3-磷酸甘油脫氫酶啟動(dòng)子（pgpd）、麥芽糖酶啟動(dòng)子（pmal）、半乳糖苷酶啟動(dòng)子（pgal）在K. lactis中的轉(zhuǎn)錄功能及在相應(yīng)誘導(dǎo)條件下［13-18］轉(zhuǎn)錄活性的變化。以此為基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)在K. lactis中分析和比較不同啟動(dòng)子的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒和菌株見表1。

1.1.2 引物 采用啟動(dòng)子在線測(cè)評(píng)軟件，對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的相關(guān)序列的開放閱讀框上游核苷酸序列進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，利用oligo7設(shè)計(jì)PCR特異性引物（表2），由金唯智公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂粉，添加終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素用于大腸桿菌（Escherchia coli）轉(zhuǎn)化子的篩選；YEPD培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0，用于K. lactis、S. cerevisiae及S. passalidarum的培養(yǎng)；YCB固體培養(yǎng)基（100 mL）：酵母基礎(chǔ)碳源（YCB）1.17 g，pH 7.0 的1 mol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液3 mL（終濃度 30 mmol/L），瓊脂粉2 g，滅菌后加入乙酰胺至終濃度 5 mmol/L，用于K. lactis重組菌的篩選；誘導(dǎo)培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基添加6% NaCl或5 g/L乙醇；YEPDG培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10.0，半乳糖10.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0；YEPG培養(yǎng)基（g/L）：半乳糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0；YEPDM培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10.0，麥芽糖10.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0；YEPM培養(yǎng)基（g/L）：麥芽糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0。

1.1.4 主要試劑和儀器 Hind III、Bgl II、Sal I、BstXI等限制性內(nèi)切酶（美國(guó)Fermentas公司）；T4 DNA連接酶、PrimeSTAR、Sac II、Dpn I（大連TaKaRa公司）；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒、膠回收試劑盒、2×Pfu PCR Master Mix、2×Taq PCR Master Mix（杭州寶賽生物技術(shù)有限公司）；氨芐青霉素購(gòu)自上海生工公司；Yeast Carbon Base購(gòu)自New England Biolabs公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。Bio-Rad S1000 PCR儀、Chemi Doc凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Multiporator電轉(zhuǎn)儀（德國(guó)Eppendorf公司）；熒光顯微鏡ECLIPSE 50i（日本NiKon公司）；熒光分光光度計(jì)F-7000（日本日立公司）。

表1 本研究所用的質(zhì)粒和菌株

1.2 方法

1.2.1 缺失Kllac4啟動(dòng)子功能的載體pKLAC1*的構(gòu)建 參照Madhavan等［19］的方法，以載體pKLAC1為模板，采用Oligo 7設(shè)計(jì)引物KlacF/KlacR，PCR擴(kuò)增得到線性化的載體片段。PCR反應(yīng)體系（100 μL）：PrimeSTAR 0.5 μL，5×Buffer 20 μL，dNTP 8 μL，模板1 μL，上下游引物（25 μmol/L）各1 μL，滅菌的ddH2O 68.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：98℃ 2 min；98℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 8 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。純化PCR產(chǎn)物，Dpn I 37℃消化反應(yīng)2 h后，經(jīng)Hind III酶切后純化，16℃ 條件下T4 DNA連接酶將線性化的載體片段自連形成環(huán)狀質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coli JM109，涂布Amp抗性平板，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分別經(jīng)Bst XI、Sac II、Hind III酶切驗(yàn)證正確后，送上海生工公司測(cè)序，測(cè)序正確的載體命名為pKLAC1*。

1.2.2 啟動(dòng)子與報(bào)告基因egfp的克隆及重疊延伸PCR 根據(jù)已報(bào)道的來(lái)源于K. lactis的adh4、mal22啟 動(dòng) 子、S. cerevisiae的 gal7、gpd1啟 動(dòng) 子、S.passalidarum的mal1、mal6、gal1啟動(dòng)子基因序列以及質(zhì)粒pEGFP-N1中egfp序列，采用Oligo 7設(shè)計(jì)重疊延伸PCR引物（表2）。用酸性玻璃珠法分別提取K. lactis、S. cerevisiae、S. passalidarum染色體基因組，并以基因組和質(zhì)粒pEGFP-N1為模板，用表2 中相應(yīng)的引物重疊延伸PCR擴(kuò)增得到promoteregfp融合片段。將PCR產(chǎn)物純化后TA克隆，轉(zhuǎn)化E. coli JM109，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送上海生工公司測(cè)序。

表2 本研究所用的引物

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將測(cè)序結(jié)果正確的promoter-egfp片段酶切后插入載體pKLAC1*，egfp片段酶切后分別插入載體pKLAC1和pKLAC1*，轉(zhuǎn)化E. coli JM109，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體命名為pKLAC1*-promoter-egfp、pKLAC1-egfp、pKLAC1*-egfp。

1.2.4 重組菌的構(gòu)建及單拷貝整合重組菌的篩選 Bst XI線性化重組表達(dá)載體后電轉(zhuǎn)化K. lactis GG799，涂布YCB平板，30℃培養(yǎng)4 d，挑選轉(zhuǎn)化子于YCB平板純化多次，接種于YEPD培養(yǎng)基，提取重組菌染色體基因組。參照Read等［20］的方法略作改進(jìn)，線性化的同源重組片段在染色體中l(wèi)ac4位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生雙交換整合，設(shè)計(jì)特異性引物（表2），分別利用單拷貝整合引物Integration P1/ egfp integration P2（Integration P2）和多拷貝整合引物 egfp integration P2（Integration P2）/Integration P3引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證重組菌的整合拷貝數(shù)。為了在同一水平上比較不同啟動(dòng)子的功能，挑選單拷貝整合重組菌（各挑選3個(gè)）進(jìn)行EGFP表達(dá)量的分析。

1.2.5 單拷貝整合重組菌EGFP的觀察 YEPD平板活化重組菌，挑取單菌落分別接種于相應(yīng)培養(yǎng)基（表3），30℃，200 r/min，培養(yǎng)36 h。收集菌體細(xì)胞并用生理鹽水洗滌2次，吸取少量菌懸液置于載玻片上，在Nikon ECLIPSE 50i熒光顯微鏡下觀察菌體細(xì)胞并拍照，放大倍數(shù)為100倍，激發(fā)波長(zhǎng)λ=485 nm，探究不同啟動(dòng)子在K. lactis中的轉(zhuǎn)錄功能及誘導(dǎo)前后啟動(dòng)強(qiáng)度的變化。

表3 不同啟動(dòng)子調(diào)控下重組菌的培養(yǎng)基

1.2.6 單拷貝整合重組菌熒光強(qiáng)度的定量測(cè)定 YEPD平板活化重組菌，挑取單菌落分別接種于相應(yīng)培養(yǎng)基（表3），30℃，200 r/min，培養(yǎng)36 h。收集菌體細(xì)胞并用生理鹽水洗滌2次后將菌體重懸至OD600為0.5左右，用熒光分光光度計(jì)F-7000對(duì)菌體胞內(nèi)EGFP的熒光強(qiáng)度定量測(cè)定，每個(gè)菌株在測(cè)定時(shí)設(shè)置3個(gè)平行。主要設(shè)置參數(shù)為：Wavelength：Excitation=488 nm，Emission=510 nm；EX 5.0 nm，EM 5.0 nm，PMT Voltage 400 V。

2 結(jié)果

2.1 載體pKLAC1*的構(gòu)建

通過(guò)PCR方法使載體pKLAC1自身Kllac4啟動(dòng)子區(qū)域起始密碼子上游700 bp左右的序列缺失，破壞其3個(gè)TATA框及UAS元件，使pKllac4無(wú)法起始轉(zhuǎn)錄，得重組表達(dá)載體pKLAC1*（圖1-A），以此為基礎(chǔ)評(píng)價(jià)不同啟動(dòng)子的功能。如圖1-B所示，在7 500-10 000 bp有單一擴(kuò)增條帶，與目的片段大?。? 438 bp）一致，酶切驗(yàn)證及測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建載體pKLAC1*。

圖1 重組表達(dá)載體pKLAC1*的構(gòu)建（A）及酶切（B）驗(yàn)證

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)1.2.3所述方法得重組載體pKLAC1*-promoter-egfp， 以pKLAC1-egfp和pKLAC1*-egfp分別為陽(yáng)性（PC）和陰性（NC）對(duì)照（圖2）。以pKladh4為例，PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段（1 205 bp）、egfp片段（720 bp）及重疊延伸PCR擴(kuò)增融合片段（1 925 bp）的核酸電泳如圖3-A所示，Hind III與Bgl II 雙酶切得到8.4 kb和2.0 kb兩個(gè)片段，與目的基因大小一致，表明重組載體構(gòu)建成功。PC質(zhì)粒經(jīng)Hind III和Bgl II雙酶切得到8.1 kb和0.7 kb兩個(gè)片段（圖3-B），NC質(zhì)粒經(jīng)Hind III和Bgl II酶切得到8.8 kb和0.7 kb兩個(gè)片段（圖3-C）。

2.3 重組菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選與拷貝數(shù)的驗(yàn)證

構(gòu)建成功的重組載體經(jīng)Bst XI酶切線性化后分別電轉(zhuǎn)化K. lactis GG799，得表1所示的9個(gè)重組菌。同源重組片段在lac4位點(diǎn)處發(fā)生單拷貝整合或多拷貝串聯(lián)整合（圖4-A），利用單拷貝整合引物PCR擴(kuò)增得到相應(yīng)大小的片段，表明重組片段成功整合入K. lactis染色體并發(fā)生單拷貝整合；利用多拷貝整合引物PCR擴(kuò)增得到相應(yīng)大小的片段，表明重組片段發(fā)生多拷貝整合。含不同整合拷貝數(shù)的重組菌PCR擴(kuò)增相應(yīng)的產(chǎn)物（表4）經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析（圖4-B），挑選單拷貝整合重組菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 重組菌胞內(nèi)EGFP的觀察

為了在同一水平上比較不同啟動(dòng)子在K. lactis中的功能，在上述重組菌中篩選單拷貝整合的重組菌，因切除α因子信號(hào)肽，EGFP在胞內(nèi)表達(dá)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察各重組菌EGFP的表達(dá)情況。如圖 5所 示，pKladh4、pKlmal22、pScgal7、pScgpd1在K.lactis中實(shí)現(xiàn)了EGFP的有效表達(dá)，并且相對(duì)于YPD培養(yǎng)條件下，加入相應(yīng)誘導(dǎo)物后其表達(dá)能力有一定的提高。同時(shí)，來(lái)源于S. cerevisiae的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性優(yōu)于來(lái)源于自身的啟動(dòng)子，表明pScgal7、pScgpd1具有較強(qiáng)的起始轉(zhuǎn)錄外源基因的能力。來(lái)源于S. passalidarum的pSpmal1、pSpmal6和pSpgal1表達(dá)綠色熒光蛋白能力較弱。

圖2 重組載體pKLAC1*-promoter-egfp（A）、pKLAC1-egfp（B）及pKLAC1*-egfp（C）的構(gòu)建圖譜

2.5 重組菌熒光強(qiáng)度的定量測(cè)定

根據(jù)1.2.5所述方法檢測(cè)重組菌胞內(nèi)EGFP的熒光強(qiáng)度，評(píng)價(jià)不同啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄能力的強(qiáng)弱以及誘導(dǎo)前后強(qiáng)度的變化，結(jié)果如圖6所示。來(lái)源于K. lactis的pKladh4受乙醇誘導(dǎo)，分別在YEPD以及添加5 g/L乙醇后的培養(yǎng)基中測(cè)定熒光強(qiáng)度。pKladh4活性略高于作為陽(yáng)性對(duì)照的pKllac4啟動(dòng)子，在YEPD培養(yǎng)條件下，前者啟動(dòng)子強(qiáng)度為后者的1.3倍，轉(zhuǎn)錄外源基因能力較強(qiáng)。相同的是，兩者在YEPD中即存在較強(qiáng)的本底表達(dá)，在添加相應(yīng)的誘導(dǎo)物后，啟動(dòng)子強(qiáng)度略有提高，兩者表達(dá)量均為在YEPD培養(yǎng)基中表達(dá)量的1.13倍。pKlmal22受麥芽糖誘導(dǎo)，在YEPD中強(qiáng)度較弱，在YEPM和YEPDM培養(yǎng)基中綠色熒光蛋白的表達(dá)量分別提高了46%和15%。

S. cerevisiae來(lái)源的pScgal7和pScgpd1具有較強(qiáng)的活性，其熒光強(qiáng)度分別是陽(yáng)性對(duì)照的1.37倍和2.22倍。其中pScgal7在YEPG條件下EGFP的表達(dá)量提高了57%，而在YEPDG中熒光強(qiáng)度相對(duì)于YEPG培養(yǎng)基中略有降低。pScgpd1受滲透壓調(diào)控，在YEPD中添加6% NaCl后，啟動(dòng)子活性提高了22%。

來(lái)源于S. passalidarum的pSpmal1、pSpmal6和pSpgal1啟動(dòng)強(qiáng)度弱，EGFP表達(dá)極弱，其中pSpmal1和pSpgal1分別在麥芽糖和半乳糖誘導(dǎo)下活性最高提高了31%和12%，但仍處于較低水平。

圖3 目的基因克隆及重組表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證

表4 單拷貝和多拷貝整合重組菌PCR驗(yàn)證

圖4 重組菌整合拷貝數(shù)的驗(yàn)證

3 討論

K. lactis作為表達(dá)宿主具有多種優(yōu)勢(shì)已實(shí)現(xiàn)上百種外源蛋白的成功表達(dá)。K. lactis 有兩種類型的表達(dá)系統(tǒng)，一是游離型表達(dá)載體（如pKARS，pKD1），二是整合型表達(dá)載體（如pKLAC1）［6，21］。后者將外源基因整合于基因組中l(wèi)ac4位點(diǎn)并受pKllac4調(diào)控，α因子信號(hào)肽介導(dǎo)下將外源蛋白分泌到胞外，因K.lactis分泌雜蛋白較少，大大降低了后續(xù)分離純化的成本［4，22］。目前，外源蛋白表達(dá)量仍限制于相對(duì)較低的水平。研究表明，外源蛋白調(diào)控水平包括轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和翻譯后修飾水平［23］，目的蛋白的性質(zhì)、宿主細(xì)胞及其發(fā)酵條件、表達(dá)載體系統(tǒng)、啟動(dòng)子的選擇、密碼子的使用、信號(hào)肽、翻譯信號(hào)、蛋白折疊以及分泌等因素都會(huì)影響外源蛋白的分泌表達(dá)［1］，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有助于人們進(jìn)一步探索各表達(dá)元件、分子伴侶等對(duì)外源蛋白分泌表達(dá)的影響。

圖5 不同啟動(dòng)子調(diào)控下單拷貝整合重組菌胞內(nèi)EGFP的觀察（100×）

圖6 不同啟動(dòng)子調(diào)控下單拷貝整合重組菌熒光強(qiáng)度的定量測(cè)定

啟動(dòng)子活性高低在很大程度上影響外源蛋白的表達(dá)，因此，研究啟動(dòng)子成為調(diào)控外源蛋白常用的一種方法。目前，已報(bào)道來(lái)源于K. lactis的啟動(dòng)子只有很少一部分用于調(diào)控外源蛋白的表達(dá)。最常用的啟動(dòng)子包括S. cerevisiae來(lái)源的組成型磷酸甘油酸激酶基因（pgk）啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型酸性磷酸酶基因（pho5）啟動(dòng)子［24，25］，K. lactis來(lái)源的β-半乳糖苷酶基因（lac4）啟動(dòng)子。在培養(yǎng)基中分別添加磷酸鹽、半乳糖或乳糖誘導(dǎo)這些啟動(dòng)子調(diào)控外源蛋白的表達(dá)，然而，在缺乏誘導(dǎo)物的情況下其轉(zhuǎn)錄活性并未受到完全抑制。當(dāng)前，對(duì)啟動(dòng)子的研究主要著眼于表達(dá)某種特定的外源蛋白，存在一定的特異性和局限性，針對(duì)同一評(píng)價(jià)體系中不同啟動(dòng)子之間的功能差異的比較鮮有報(bào)道。因此，分析不同啟動(dòng)子功能、篩選性能優(yōu)越的啟動(dòng)子對(duì)于時(shí)空調(diào)控外源蛋白表達(dá)及代謝途徑控制起著至關(guān)重要的作用。

本研究對(duì)所選擇的啟動(dòng)子活性差異作了初步探索，表明該體系的可行性，基于該評(píng)價(jià)體系對(duì)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的研究，為挖掘性能優(yōu)越的啟動(dòng)子調(diào)控外源蛋白的高效表達(dá)提供參考。熒光檢測(cè)結(jié)果表明，pKladh4、pScgal7、pScgpd1均能高效啟動(dòng)EGFP在K. lactis中的表達(dá)，且在相應(yīng)的誘導(dǎo)條件下啟動(dòng)能力有所增強(qiáng)，EGFP的表達(dá)量均高于當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的Kllac4啟動(dòng)子。pKladh4具有較強(qiáng)的本底表達(dá)能力，Saliola等［13］證實(shí)與釀酒酵母不同，K. lactis中乙醇脫氫酶在葡萄糖和乙醇同時(shí)存在條件下可表達(dá)，不存在葡萄糖阻遏效應(yīng)，因此在培養(yǎng)基加入乙醇后活性提高。在S. cerevisiae中，半乳糖苷酶基因（gal）和3-磷酸甘油脫氫酶基因（gpd）啟動(dòng)子分別為半乳糖、滲透壓誘導(dǎo)型，在K. lactis中兩者均存在較強(qiáng)的組成型表達(dá)，pScgal7在YEPG中活性提高57%，因此可通過(guò)添加誘導(dǎo)物調(diào)控外源基因的高效表達(dá)。根據(jù)已有報(bào)道［16］，畢赤酵母中隨著滲透壓的提高，pScgpd1啟動(dòng)外源基因轉(zhuǎn)錄的能力有較大提升，但是其表達(dá)量仍較低。本實(shí)驗(yàn)中首次利用pScgpd11調(diào)控K. lactis外源蛋白的表達(dá)，在YEPD培養(yǎng)基中EGFP的表達(dá)量達(dá)到一個(gè)較高的水平，在高滲透壓條件下其表達(dá)強(qiáng)度有所增加，表明滲透壓對(duì)該啟動(dòng)子有一定的激活作用，在一定范圍內(nèi)可通過(guò)改變滲透壓來(lái)調(diào)節(jié)外源蛋白的表達(dá)量，這有待進(jìn)一步研究。pKlmal22起始轉(zhuǎn)錄受麥芽糖的誘導(dǎo)，Leifso等［17］研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖存在的條件下，麥芽糖操縱子受到阻遏，本研究中，在YEPM中熒光強(qiáng)度高于YEPDM，可以間接證實(shí)這一點(diǎn)，但與上述幾個(gè)啟動(dòng)子相比，該啟動(dòng)子表達(dá)水平較弱，可用于調(diào)控分泌過(guò)程中輔助因子、分子伴侶等的共表達(dá)。S. passalidarum是近年來(lái)分離得到的新型酵母，屬于CTG類酵母［26，27］，與K. lactis親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳系統(tǒng)的特殊性使得所選用啟動(dòng)子在K. lactis中調(diào)控外源蛋白表達(dá)時(shí)難以有效適用，啟動(dòng)活性受到影響，通過(guò)對(duì)該酵母啟動(dòng)元件進(jìn)行分析有助于挖掘多樣性啟動(dòng)子，但基于pSpmal1、pSpmal6、pSpgal1調(diào)控EGFP的表達(dá)處在較低水平，后續(xù)研究可以通過(guò)定點(diǎn)突變等基因改造方法研究S. passalidarum中性能優(yōu)越的啟動(dòng)子在K. lactis中的調(diào)控表達(dá)。本研究在同一水平上比較不同啟動(dòng)子的功能，該評(píng)價(jià)體系具有一定的優(yōu)勢(shì)：（1）以載體pKLAC1*為基礎(chǔ)，保留了商業(yè)化質(zhì)粒上lac4整合位點(diǎn)及amdS篩選標(biāo)記，穩(wěn)定整合于基因組中，通過(guò)替換不同啟動(dòng)子即可實(shí)現(xiàn)調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；（2）通過(guò)特異性引物PCR擴(kuò)增方法篩選單拷貝整合重組菌，在同一基因劑量水平比較不同啟動(dòng)子活性差異；（3）以egfp為報(bào)告基因，通過(guò)熒光顯微鏡和熒光分光光度計(jì)實(shí)現(xiàn)熒光強(qiáng)度定性和定量分析，快速直觀。

基于上述不同啟動(dòng)子功能的分析及比較，下一步可以篩選啟動(dòng)強(qiáng)度高、易于進(jìn)行調(diào)控、適用性廣的啟動(dòng)子，同時(shí)可以針對(duì)特定啟動(dòng)子進(jìn)行核心元件分析及上游增強(qiáng)子的分析，對(duì)啟動(dòng)子改造提供理論支撐，為今后在乳酸克魯維酵母中高效表達(dá)外源蛋白奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以egfp為報(bào)告基因，比較pKladh4、pKlmal22、pScgal7、pScgpd1、pSpmal1、pSpmal6、pSpgal在K. lactis中的功能，并通過(guò)篩選單拷貝整合重組菌定性和定量分析胞內(nèi)EGFP的表達(dá)，同時(shí)，在不同培養(yǎng)條件下分析了各啟動(dòng)子強(qiáng)度的變化。結(jié)果表明，pKladh4、pScgal7、pScgpd1具有較強(qiáng)起始外源基因轉(zhuǎn)錄的能力，并在相應(yīng)誘導(dǎo)物存在條件下活性提高，均高于目前廣泛應(yīng)用的pKllac4啟動(dòng)子，為高效表達(dá)并調(diào)控外源蛋白提供更多的選擇。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Study on the Function of Different Promoters in Kluyveromyces lactis by Enhanced Green Fluorescent Protein

SUN Hai-ye1ZHANG Liang1，2LI You-ran1GU Zheng-hua1DING Zhong-yang1，2SHI Gui-yang1，2
（1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122；2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122）

In order to seek the promoters efficiently expressing heterologous protein，the transcription functions of different promoters were evaluated using Enhanced Green Fluorescent Protein gene（egfp）as a reporter gene in Kluyveromyces lactis. Seven different promoters from K. lactis，Saccharomyces cerevisiae and Spathaspora passalidarum were cloned by PCR，fused to egfp respectively by overlap extension PCR and cloned into the reformed vector pKLAC1*. The recombinant expression plasmids were linearized by Bst XI and electro-transformed into K. lactis GG799. Further，the single-copy integrated recombinants regulated by different promoters were screened by PCR with specific primers，and the functions of different promoters were compared after qualitative and quantitative analysis of EGFP. The results of fluorescence microscopy showed that the expression of EGFP was regulated by the pKladh4 and pKlmal22 from K. lactis，pScgal7 and pScgpd1 from S. cerevisiae，as well as pSpmal1，pSpmal6 and pSpgal1 from S. passalidarum. The quantitative results of fluorospectrophotometer revealed that the fluorescence intensity of EGFP regulated by pKladh4，pScgal7 and pScgpd1 was 2.82，2.92 and 4.74，respectively；moreover，under the condition of the corresponding induction，the expression of EGFP was improved 13%，57% and 22%，respectively. These promoters were much stronger than pKllac4（2.13）that was the most widely used currently. Conclusively，this work probed the functions of promoters from different organisms in K. lactis，and the pKladh4，pScgal7 and pScgpd1 presented efficient initial transcription. It is the first time to report the application of pScgpd1 in K. lactis.

Kluyveromyces lactis；promoter；EGFP；single-copy integration；fluorescence intensity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0049

2017-01-24

江蘇省杰出青年基金（BK20140002），國(guó)家星火計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2015GA690004）

孫海燁，女，碩士研究生，研究方向：微生物與分子生物學(xué)；E-mail：13771092048@163.com

張梁，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：酵母生理代謝工程和工業(yè)微生物；E-mail：zhangl@jiangnan.edu.cn