趙書梅 王霖慧 唐嘉琦 趙靜宜

（中國(guó)石油大學(xué)（華東），青島 266580）

溶藻弧菌中酯酶基因的克隆表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究

趙書梅 王霖慧 唐嘉琦 趙靜宜

（中國(guó)石油大學(xué)（華東），青島 266580）

旨在克隆溶藻弧菌中的酯酶基因，并在大腸桿菌中異源表達(dá)，研究酯酶酶學(xué)性質(zhì)。從溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）7S-1的基因組DNA中克隆得到酯酶基因estZ，將該基因連接入表達(dá)載體pET28a，并在Escherichia coli BL21（DE3）中表達(dá)，對(duì)純化后的酯酶蛋白進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析。結(jié)果顯示，表達(dá)菌株E. coli BL21-28a-estZ可高表達(dá)具有活性的酯酶，在18℃添加0.4 mmol/L IPTG的LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)22 h，酯酶的比酶活可達(dá)5.42 U/μg；重組表達(dá)的酯酶EstZ最適反應(yīng)溫度為25℃，最適pH為9.0。10 mmol/L Na+和Mg2+對(duì)其有較好的激活作用；Cu2+、Ni2+、Co2+對(duì)該酶活性有較大抑制。該酶對(duì)多種有機(jī)溶劑及表面活性劑具有一定的耐受性，同時(shí)具有較高的耐鹽性。對(duì)溶藻弧菌中的酯酶進(jìn)行研究為該菌更好的應(yīng)用于生物脫墨技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ)。

溶藻弧菌；酯酶；酶學(xué)性質(zhì)

近年來(lái)，受到資源短缺和環(huán)境污染的壓力，二次纖維的應(yīng)用已逐漸引起重視。造紙?jiān)现?，廢紙漿所占比例逐漸增加，在我國(guó)已增到38%，由于廢紙品種復(fù)雜，印刷油墨配方也各不相同，脫墨成為再生紙漿的一個(gè)難題［1，2］。一般通過(guò)加堿、非離子表面活性劑、硅酸鈉等處理來(lái)脫墨，由于對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，效率也并不理想。同時(shí)，生活污水中 50%-70% 的磷來(lái)自含磷洗滌劑［3］，這些磷酸鹽隨廢水排入江河湖海，使水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)化，最終在近海產(chǎn)生赤潮，每年給我國(guó)造成的經(jīng)濟(jì)損失約100 億元人民幣［4］。且傳統(tǒng)含磷洗滌劑洗滌時(shí)間長(zhǎng)，所需溫度高，成本大，洗滌行業(yè)也因此急需環(huán)保、節(jié)能、高效的洗滌劑［5］。

低溫酯酶在反應(yīng)過(guò)程中可以節(jié)省掉加熱所消耗的能量，具有低溫高催化活性。造紙脫墨行業(yè)中，酯酶能對(duì)脂及甘油酸酯等膠粘物成份進(jìn)行分解，在此作用下膠粘物尺寸變小或粘性降低，提高了油墨去除率、紙漿得率、白度等，同時(shí)降低了生產(chǎn)成本、化學(xué)品使用和環(huán)境污染［6-8］。在洗滌行業(yè)，低溫酯酶能將來(lái)自皮脂或食品中的脂質(zhì)污垢中含有的甘油三酯分解成甘油單酯和脂肪酸，即可把污垢去除。洗滌劑中加入低溫酯酶后具有如下優(yōu)點(diǎn)，其一，降低了織物洗滌溫度，一方面可以避免高溫環(huán)境對(duì)于織物的破壞作用［9-11］，另一方面也可以減少洗滌過(guò)程中的能源消耗和CO2排放量。其二，減少了洗滌劑中表面活性劑的用量，能使排出的廢水與環(huán)境更相容。其三，增加了節(jié)水、節(jié)能和環(huán)境保護(hù)效益。在洗滌過(guò)程中，通過(guò)酶的作用，可減少漂洗次數(shù)，降低洗滌溫度，而酶本身又是極易被降解的物質(zhì)。因此，加酶洗滌劑成為世界洗滌用品工業(yè)近十多年來(lái)爭(zhēng)相發(fā)展的熱門產(chǎn)品［12］。

本實(shí)驗(yàn)室從自主分離并保存的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）7S-1菌株中，克隆到一個(gè)酯酶基因（命名為estZ），并實(shí)現(xiàn)該基因在大腸桿菌（Escherichia coli）中的功能性表達(dá)，同時(shí)初步測(cè)定酯酶EstZ的基礎(chǔ)酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 V. alginolyticus 7S-1菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存，E. coli DH5α和E. coli BL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株。pSP72和pET28a為本實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒載體。

1.1.2 主要試劑 Hind III、Nde I限制性內(nèi)切酶和 Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal（CIAP） 購(gòu)自NEB公司，T4DNA連接酶、Xho I限制性內(nèi)切酶、DNA Marker和蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司，質(zhì)粒提取試劑盒和Cycle Pure試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；PCR 擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Pfu DNA Polymerase、卡那霉素購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。酯酶的系列底物：4-Nitrophenyl acetate（C2）、4-Nitrophenyl butyrate（C4；4-NPB）、4-Nitrophenyl hexanoate（C6）、4-Nitrophenyl caprylate（C8）、4-Nitrophenyl decanoate（C10）、4-Nitrophenyl dodecanoate（C12）、4-Nitrophenyl mgristate（C14）、4-Nitrophenyl palmitate（C16） 購(gòu) 自 Sigma-Aldrich公司或百靈威科技有限公司，HisTrap FF Crude和HiTrap Desalting購(gòu)自GE Healthcare公司，其他試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株7S-1酯酶基因的克隆 提取菌株7S-1的基因組DNA，進(jìn)行Hind III部分酶切。將載體質(zhì)粒pSP72使用Hind III酶切并去磷酸化。將酶切后的基因組片段連接入pSP72，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，克隆子在含有100 μg/mL氨芐西林和1%三丁酸甘油酯的LB平板上進(jìn)行篩選，如果克隆子周邊出現(xiàn)透明圈，挑取克隆子，提取質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.2.2 酯酶基因estZ的驗(yàn)證 以菌株7S-1基因組DNA為模板，以O(shè)rf3F（CCCAAGCTTGGCAAGTAG TGATGACTGATTC）和Orf3R（CCCAAGCTTAGGATT TACTGGGCTGATACGC）為引物，PCR擴(kuò)增estZ基因及其上下游序列。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min終止反應(yīng)。將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物使用Hind III酶切，連接入pSP72，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，克隆子在含有100 μg/mL氨芐西林和1%三丁酸甘油酯的LB平板上進(jìn)行篩選，觀察克隆子周邊是否出現(xiàn)透明圈。

1.2.3 estZ基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以菌株7S-1基因組DNA為模板，以Eorf3F-2（GGGGGGGCATATGA AAATCATCATCTTACATG）和Eorf3R（GATCTCGAG CTATCGACGGAAATAATCTGTG）為引物，PCR擴(kuò)增estZ基因完整序列。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min終止反應(yīng)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pET28a經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，將獲得的陽(yáng)性克隆子提取質(zhì)粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。無(wú)突變的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E. coli BL21（DE3），挑取陽(yáng)性克隆子，富集培養(yǎng)后保種備用。

1.2.4 estZ基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將E. coli BL21-28aestZ接種含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，1%轉(zhuǎn)接含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600=0.6，添加IPTG至終濃度0.4 mmol/L，18℃誘導(dǎo)培養(yǎng)22 h。5 000 r/min離心5 min收集菌體，PBS溶液懸浮菌體，同時(shí)加入0.3%溶菌酶。高壓破碎細(xì)胞，4℃ 10 000 r/min離心20 min取上清液過(guò)濾。濾液取出2 mL，4℃保存?zhèn)溆?。剩余濾液作為粗酶液，進(jìn)行蛋白純化。

1.2.5 重組酯酶EstZ的純化及蛋白濃度測(cè)定 將粗酶液樣品使用HisTrap FF Crude親和層析柱和HiTrap Desalting脫鹽柱純化蛋白，上樣緩沖溶液為20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4、5 mmol/L咪 唑、500 mmol/L NaCl，pH7.4，洗脫液為20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4、500 mmol/L咪 唑、500 mmol/L NaCl，pH7.4。蛋白溶于50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液中，即為純酶液，進(jìn)行酶活測(cè)定和SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.6 酯酶酶活和比酶活的測(cè)定

1.2.6.1 4-硝基苯酚（4-NP）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將4-NP使用Tris-HCl（pH8.0）緩沖液進(jìn)行梯度稀釋，配制不同濃度的溶液。在405 nm測(cè)定溶液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6.2 酯酶酶活的測(cè)定 在0.98 mL 50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）中加入0.1 mL 3 mg/mL 4-NPB，震蕩混勻，25℃水浴5 min，加入20 μL稀釋10倍的純酶液，混勻，25℃水浴10 min，加入1.1 mL無(wú)水乙醇終止反應(yīng)，在405 nm測(cè)定溶液吸光度，計(jì)算酯酶活力。在25℃、pH8.0的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液中，每分鐘釋放1 μmol/L 4-硝基苯酚所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位（U）。

1.2.6.3 酯酶比酶活的測(cè)定 采用Bradford Protein Assay Kit測(cè)定蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白［13］。同時(shí)測(cè)定酯酶酶活，計(jì)算酯酶的比酶活。

1.2.7 重組酯酶EstZ的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.7.1 最適溫度 在0℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃測(cè)定酯酶酶活，確定最適溫度。

1.2.7.2 最適pH 在pH4、5、5.8、7.1、8、9、9.6、10的不同緩沖體系中測(cè)定酯酶酶活，確定最適pH。

1.2.7.3 熱穩(wěn)定性 將純酶液分別在40℃、50℃處理10 min、20 min、30 min后測(cè)定酯酶酶活，確定熱穩(wěn)定性。

1.2.7.4 pH穩(wěn)定性 將純酶液分別在不同pH的緩沖液中4℃處理5 h后測(cè)定酯酶酶活，確定pH穩(wěn)定性。

1.2.7.5 最適底物 分別以C2、C4、C6、C8、C10、C12、C14、C16為反應(yīng)底物測(cè)定酯酶酶活，確定酶的最適底物。

1.2.7.6 有機(jī)溶劑影響 在酶促反應(yīng)體系中分別加入甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、氯仿、甘油，終濃度為10%（V/V），測(cè)定酯酶酶活，以未加有機(jī)溶劑的樣品作為對(duì)照。

1.2.7.7 表面活性劑影響 在酶促反應(yīng)體系中分別 加 入SDS、Tween60、Tween80、DMSO、PMSF、EDTA，終濃度為1%（V/V），測(cè)定酯酶酶活，以未加表面活性劑的樣品作為對(duì)照。

1.2.7.8 金屬離子影響 在酶促反應(yīng)體系中分別加入 K+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、Na+，各金屬離子的終濃度為10 mmol/L，測(cè)定酯酶酶活，以未加入金屬離子的樣品作為對(duì)照。

1.2.7.9 NaCl影響 在含有0 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L、100 mmol/L、500 mmol/L、600 mmol/L、700 mmol/L、800 mmol/L、900 mmol/L NaCl的酶促反應(yīng)液中，測(cè)定酯酶酶活。

2 結(jié)果

2.1 酯酶基因estZ的生物信息學(xué)分析

亞克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)重組質(zhì)粒中含有estZ基因時(shí)，大腸桿菌重組子在含有1%三丁酸甘油酯的LB平板上生長(zhǎng)，菌落周圍出現(xiàn)透明圈。酯酶EstZ的編碼基因全長(zhǎng)615 bp，編碼204個(gè)氨基酸，GC含量為32%，理論蛋白分子量為 22.6 kD，pI為8.86。Blast分析表明酯酶EstZ與弧菌來(lái)源的鈷啉醇酰胺腺苷轉(zhuǎn)移酶同源性100%。

2.2 表達(dá)質(zhì)粒pET28a-estZ驗(yàn)證

將estZ基因連接入表達(dá)載體pET28a構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-estZ，經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切后，得到約5.4 kb和615 bp的兩個(gè)DNA片段，與預(yù)期大小相符（圖1-A），測(cè)序結(jié)果顯示estZ基因正確無(wú)突變。

圖1 表達(dá)質(zhì)粒pET28a-estZ酶切驗(yàn)證電泳圖（A）和酯酶EstZ純化樣品的SDS-PAGE圖（B）

2.3 重組酯酶EstZ的純化

粗酶液經(jīng)過(guò)親和層析和脫鹽純化后，獲得酯酶EstZ純酶液（圖1-B），回收率為25.23%（表1），純化倍數(shù)達(dá)17.26。純化后的EstZ水解4-NPB的比酶活為5.42 U/μg（表1）。

2.4 酯酶EstZ的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 溫度及pH對(duì)酶活的影響 由圖2可以看出，酯酶EstZ的最適溫度為25℃，在10℃-35℃之間有顯著酶活，大于40℃后酶活急劇下降，在0℃時(shí)仍有35%的酶活，且EstZ熱穩(wěn)定性較差，在40℃保溫10 min酶活下降為45%，50℃則酶活直接降為0，說(shuō)明酯酶EstZ在溫度升高的情況下，結(jié)構(gòu)極易遭到破壞，因此是典型的低溫酶，在低溫催化方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。酯酶EstZ的最適pH為9.0，在pH8-9.6之間可以保持較高酶活，屬弱堿性酶，在酸性環(huán)境下表現(xiàn)出極弱的催化活性。在pH10緩沖液中處理5 h EstZ可以保持97%的酶活，說(shuō)明該酶具有較好的堿耐受性。

2.4.2 底物、有機(jī)溶劑、表面活性劑及金屬離子對(duì)EstZ酶活的影響 由圖3可以看出，當(dāng)C4（4-NPB）作為底物時(shí)，酶活力最高，表明EstZ為酯酶，而非脂肪酶，且EstZ具有較寬的底物譜，這在其它已知酯酶中并不常見(jiàn)［14］。甘油對(duì)酶活有激活作用，甲醇、乙醇、丙酮有不同程度的抑制作用，乙腈、氯仿則有明顯的抑制作用，總的來(lái)看該酯酶有一定的抗有機(jī)溶劑能力，可應(yīng)用于有機(jī)合成等方面。EDTA和SDS對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用。EstZ在Tween60、Tween80、DMSO、PMSF存在時(shí)可保持70%以上的酶活，說(shuō)明這些常見(jiàn)的表面活性劑對(duì)該低溫酯酶的酶活性影響不大，該酯酶在洗滌劑等行業(yè)具應(yīng)用潛力。Na+對(duì)酶有較強(qiáng)的激活作用，相對(duì)酶活高達(dá)174%，其次為Mg2+，Ca2+、Mn2+、K+對(duì)酶有微弱的激活作用，Zn2+對(duì)酶活有輕微的抑制作用，Cu2+、Ni2+、Co2+有較強(qiáng)的抑制作用。

2.4.3 酯酶EstZ的耐鹽性 由圖4可以看出，反應(yīng)體系中加入20-500 mmol/L的NaCl可以增強(qiáng)酶的活性，在100 mmol/L NaCl溶液中活性達(dá)到最高，為160%。當(dāng)濃度提高到900 mmol/L時(shí)，酶的活性被抑制，保持原來(lái)的30%。

表1 重組酯酶 EstZ 的純化

3 討論

近年來(lái)，酯酶越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于生物脫墨和洗滌行業(yè)，細(xì)菌或者真菌來(lái)源的各種各樣的水解酶，例如，纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶、木聚糖酶等均可應(yīng)用于辦公廢紙的脫墨技術(shù)上［15-19］。汪順才［20］將以纖維素酶、酯酶等組成的復(fù)合酶對(duì)紙漿進(jìn)行脫墨，得到了較優(yōu)的紙漿脫墨工藝條件；洗滌行業(yè)，有報(bào)道表明，在歐洲、美國(guó)和日本，90%的洗滌劑都含有酶［21］。但對(duì)于酯酶催化特點(diǎn)和理論機(jī)理的基礎(chǔ)研究報(bào)道較少。

圖2 溫度及pH對(duì)EstZ酶活的影響

圖3 底物、有機(jī)溶劑、表面活性劑及金屬離子對(duì)EstZ酶活的影響

本研究克隆到溶藻弧菌7S-1的一種低溫酯酶EstZ，并進(jìn)行了異源表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)的探究。該酯酶雖與弧菌來(lái)源的鈷啉醇酰胺腺苷轉(zhuǎn)移酶同源性100%，但是關(guān)于鈷啉醇酰胺腺苷轉(zhuǎn)移酶酶學(xué)性質(zhì)的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

酯酶EstZ最適溫度為25℃，在0℃時(shí)依舊有35%的酶活，因此是明顯的低溫酶。洗滌行業(yè)，出于節(jié)能，日常洗衣正由傳統(tǒng)的高溫洗滌轉(zhuǎn)向低溫洗滌。低溫酯酶在低溫下具有較高的催化活性，可以克服中高溫酶在低溫條件下活性低的缺點(diǎn)。一般脫墨時(shí)漿料pH控制在9-11之間，為堿性脫墨，相比于中性脫墨，所得紙漿濾水性能好，物理強(qiáng)度高［22，23］。該酯酶最適pH為9，且具有較好的耐堿性，可在紙漿脫墨時(shí)發(fā)揮它的最大酶活力。Na+、Mg2+對(duì)該酶有強(qiáng)烈的激活作用，且該酶對(duì)甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑及Tween60、Tween80、DMSO、PMSF具有一定的耐受性，因此具有較廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。

綜上，estZ基因的異源表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)的研究，有助于進(jìn)一步揭示該酯酶的催化機(jī)制，拓展酯酶EstZ在生物脫墨和洗滌行業(yè)的應(yīng)用。后續(xù)研究可采用定點(diǎn)突變技術(shù)以提高低溫酯酶的活性，為該酶更好地實(shí)現(xiàn)工業(yè)化奠定理論基礎(chǔ)。

圖4 酯酶EstZ的耐鹽性

4 結(jié)論

本研究從溶藻弧菌7S-1中克隆到一種低溫酯酶基因estZ，并進(jìn)行了異源表達(dá)和基礎(chǔ)酶學(xué)性質(zhì)的探究。EstZ是典型的低溫酶，對(duì)有機(jī)溶劑和表面活性劑具有一定耐受性，耐堿耐鹽，有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning，Expression and Characterization of the Esterase Gene estZ from Vibrio alginolyticus

ZHAO Shu-mei WANG Lin-hui TANG Jia-qi ZHAO Jing-yi
（Center for Bioengineering and Biotechnology，China University of Petroleum（East China），Qingdao 266580）

This work aimed to investigate the esterase gene estZ of Vibrio alginolyticus 7S-1，which was expressed in Escherichia coli and characterized. The estZ gene was obtained from the genomic DNA of V. alginolyticus 7S-1 by gene cloning，then ligated to the vector pET28a，and expressed in E. coli BL21（DE3）. E. coli BL21-28a-estZ expressed the estZ gene with esterase activity. The specific activity of the purified protein EstZ reached 5.42 U/μg when the E. coli cells were induced by 0.4 mmol/L IPTG and grew at 18℃ for 22 hours. The optimal temperature and pH of the EstZ protein were 25℃ and 9.0，respectively. EstZ was activated by 10 mmol/L Na+and Mg2+，but highly inhibited by Cu2+，Ni2+and Co2+. In addition，EstZ is resistant to some organic solvents，surfactants and salt. This study would provide some insights of V. alginolyticus in biological deinking industry.

Vibrio alginolyticus；esterase；enzymatic property

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0028

2017-01-18

山東省中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金（ZR2016CB11），中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 （16CX02043A）

趙書梅，女，碩士，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：978220481@qq.com

趙靜宜，女，博士，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：jyzhao@upc.edu.cn