王玉王建華劉允軍

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，北京 100094；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

AM79 EPSPS蛋白的體外模擬胃腸液消化穩(wěn)定性研究

王玉1，2王建華1劉允軍2

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，北京 100094；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

AM79 EPSPS基因是從草甘膦高度污染的土壤中克隆的、具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的一個新型抗草甘膦基因，在轉(zhuǎn)基因玉米中過表達能顯著提高轉(zhuǎn)基因玉米的草甘膦抗性，具有重要應(yīng)用價值。為了評價AM79 EPSPS蛋白的食用安全性，本研究參考中華人民共和國國家標準，開展了AM79 EPSPS蛋白的消化穩(wěn)定性研究。將AM79 EPSPS基因構(gòu)建到原核表達載體pET-30a上，在大腸桿菌中表達了分子量為48.3 kD的可溶性AM79 EPSPS蛋白。通過Ni-NTA親和層析方法純化了AM79 EPSPS蛋白用于體外模擬胃腸液實驗。結(jié)果表明，AM79 EPSPS蛋白在模擬胃腸液中均在15 s內(nèi)即被消化，SDS-PAGE和Western蛋白免疫印跡均未檢測到蛋白殘留，表明AM79 EPSPS蛋白在模擬胃腸液體系中極易被消化。

AM79 EPSPS蛋白；草甘膦；模擬胃腸液；消化穩(wěn)定性

玉米是我國種植面積最大的作物，可以作為糧食、飼料、工業(yè)原料等。雜草對玉米生產(chǎn)危害嚴重，一般年份可使玉米減產(chǎn)10%-20%。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米，可以利用除草劑有效控制田間雜草，減少農(nóng)藥使用量，降低生產(chǎn)成本，保護環(huán)境。隨著轉(zhuǎn)基因作物的迅猛發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境安全性及食用安全性評價備受關(guān)注，其中最受關(guān)注的是食用安全性問題。轉(zhuǎn)基因作物中所表達的外源蛋白大部分是受體作物中所沒有的蛋白質(zhì)，有可能對人體產(chǎn)生包括致敏性在內(nèi)的一些不良反應(yīng)。因此，外源蛋白致敏性評價一直是轉(zhuǎn)基因食用安全性評價的重要內(nèi)容［1］。

雖然關(guān)于食物致敏的機制還不是十分清楚，但大部分食物蛋白質(zhì)是通過胃腸道途徑引發(fā)致敏反應(yīng)［2-4］。從理論上講，致敏蛋白在通過小腸吸收進入免疫系統(tǒng)前必須能夠抵抗胃腸液消化降解，以完整又有免疫原性的蛋白或蛋白降解片段形式引起人體過敏反應(yīng)［1，5，6］。體外模擬消化實驗即是基于致敏蛋白耐消化這一特點發(fā)展出來的一種過敏評估方法，現(xiàn)已被許多國家以及一些國際組織規(guī)定為轉(zhuǎn)基因作物中新表達外源蛋白致敏性評價的必選實驗項目［7，8］。在中國，農(nóng)業(yè)部于2007年出臺國家標準［9］，詳細規(guī)定了質(zhì)量濃度為5 g/L和2 g/L的外源蛋白在體外模擬胃腸液中消化穩(wěn)定性的檢測方法。到目前為止，已有多種轉(zhuǎn)基因作物的目標或標記基因的表達蛋白，如轉(zhuǎn)Bt基因水稻的Cry1C蛋白［10］、2mEPSPS蛋 白［11］、PAT蛋 白［12］、PMI蛋 白［13］、HPT蛋白［14］等都進行了體外模擬胃腸液消化穩(wěn)定性實驗，作為評估其可能致敏性依據(jù)之一。

AM79 EPSPS基因是從草甘膦高度污染的土壤中克隆的、具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新型草甘膦抗性基因，對于發(fā)展我國的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物有重要的意義。一般來說，Ki/Km可以作為衡量草甘膦抗性的一個重要指標。酶促反應(yīng)中，對草甘膦抑制常數(shù)Ki與底物PEP親和能力Km的比值越大（Ki/Km），說明該基因草甘膦抗性越強。有研究表明，酶活測定顯示AM79 EPSPS的Ki/Km值為10.6，略低于當前生產(chǎn)中應(yīng)用比較廣泛的CP4 EPSPS［15］。因此，在轉(zhuǎn)基因玉米中過表達該基因能顯著提高轉(zhuǎn)基因玉米的草甘膦抗性，具有重要應(yīng)用價值［16］。本研究將AM79 EPSPS基因構(gòu)建到原核表達載體pET-30a中，誘導(dǎo)表達并純化AM79 EPSPS蛋白，并參考中華人民共和國國家標準［9］，通過體外模擬胃腸液消化穩(wěn)定性實驗以對其致敏性作出初步評價，為抗草甘膦基因玉米的食用安全性評估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 克隆載體、細菌表達載體pET-30a，感受態(tài)細胞DE3、菌株由本實驗室提供。

1.1.2 試劑 抗生素氯霉素（Chl）和卡那霉素（Kan）均購自北京中科瑞泰生物科技有限公司，牛血清白蛋白（BSA）、牛β乳球蛋白B（BLG）、大豆胰蛋白酶抑制劑（STI）均購自美國的Sigma公司。

1.1.3 模擬胃消化液（SGF） 稱取0.2 g氯化鈉（NaCl）和105 mg胃蛋白酶，加入70 mL重蒸餾水，加入730 μL鹽酸，再用鹽酸調(diào)pH至1.2，加水定容至100 mL。現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.4 模擬腸消化液（SIF） 稱取0.7 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶于25 mL重蒸餾水中，振蕩使之完全溶解，加入19 mL 0.2 mol/L氫氧化鈉溶液和40 mL重蒸餾水，加入1.0 g胰酶，用0.2 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5，加重蒸餾水定容至100 mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建 利用上游引物5'-GCGGATCCATG TCACATTCTACCTCTAGGTCC-3'和下游引物5'-GCA AGCTTGATTATACTCCACATGTATTCCAAA-3'擴 增AM79 EPSPS基因，在5'端和3'端分別添加BamH I and Hind III酶切位點。AM79 EPSPS用BamH I和Hind III進行酶切，連接到用相同內(nèi)切酶進行酶切的pET-30a上，構(gòu)建載體pET-AM79。將pET-AM79轉(zhuǎn)到大腸桿菌菌株Transetta（DE3）中，用于目的蛋白的表達純化。

1.2.2 蛋白誘導(dǎo)表達 挑取單菌落接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基（含適宜抗生素）中，于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按1∶100稀釋加入到200 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6，加入100 μL IPTG（1 mol/L）誘導(dǎo)劑，160 r/min，28℃搖床培養(yǎng)4-6 h或者于16℃搖床培養(yǎng)20-26 h，誘導(dǎo)目標蛋白表達。之后將菌液轉(zhuǎn)移至離心瓶中，4℃、5 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集菌體。

1.2.3 蛋白表達的可溶性分析 將收集的菌體懸浮于25 mL的緩沖液15 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）中，加入溶菌酶，超聲波破碎菌體至菌液澄清。12 000 r/min，4℃下離心15 min。取上清液和沉淀物分別進行電泳。在沉淀中加入40 μL 15 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）重懸并離心，取40 μL上清分別加入10 μL 5SDS上樣緩沖液后煮沸5 min，12 000 r/min，室溫離心10 min，進行電泳分析。

1.2.4 目的蛋白的純化 將收集的菌體懸浮于25 mL的緩沖液15 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）中，加入300 μL溶菌酶（2 mg/mL），超聲波破碎菌體至菌液澄清。12 000 r/min，4℃下離心15 min，取上清，加入1 mL混勻的Ni-NTA樹脂，冰上置于搖床振蕩60 min，使目的蛋白充分結(jié)合到Ni-NTA樹脂上并過柱純化。用5倍鎳柱體積的含15 mmol/L咪唑的緩沖液平衡事先用70%乙醇浸泡過的鎳柱，4℃環(huán)境中操作，低速向柱子中加入混勻好的蛋白上清和樹脂的混合物，收集流出液，標記為L15，再分別用含有30 mmol/L、100 mmol/L和250 mmol/L的咪唑洗脫液洗脫雜蛋白（其中250 mmol/L洗脫液每2 mL 收集1管，按次序共收集4管），標記為L30，L100，L250-1，L250-2，L250-3，L250-4。

1.2.5 模擬胃液穩(wěn)定性測定 1.5 mL離心管中加入190 μL模擬胃液（SGF），37℃恒溫水浴5 min。分別加入10 μL樣品蛋白、模擬胃液空白對照、不穩(wěn)定對照蛋白（5 mg/mL牛血清白蛋白）、穩(wěn)定對照（5 mg/mL牛β-乳球蛋白B）。迅速漩渦振蕩并置于37℃水浴，在每個反應(yīng)時間點，迅速加入70 μL NaHCO3（0.2 mol/L）溶液，冰浴，加入70 μL 5×SDS蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，冷卻至室溫備用。蛋白反應(yīng)時間和穩(wěn)定對照牛β-乳球蛋白B反應(yīng)時間均設(shè)置為0 s、15 s、2 min、30 min和60 min。不穩(wěn)定對照牛血清白蛋白反應(yīng)時間為0 s、15 s、2 min、30 min。胃蛋白酶對照組為只含胃蛋白酶的模擬胃液，試樣蛋白對照為在不含胃蛋白酶的模擬胃緩沖液加入目的蛋白，其他步驟同上。

1.2.6 模擬腸液穩(wěn)定性測定 1.5 mL離心管中加入190 μL模擬腸消化液（SIF），37℃恒溫水浴5 min。分別加入10 μL樣品蛋白、模擬腸液空白對照、不穩(wěn)定對照蛋白（2 mg/mL牛β-乳球蛋白B）、穩(wěn)定對照（2 mg/mL大豆胰蛋白酶抑制劑），迅速漩渦振蕩并快速置于37℃水浴，在每個反應(yīng)時間點立即加入50 μL 5×SDS蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，冷卻至室溫進行SDS-PAGE檢測。反應(yīng)時間均設(shè)為0 s、15 s、2 min、30 min和60 min。胰蛋白酶對照組為只含胰蛋白酶的模擬腸液，試樣蛋白對照為在不含胰蛋白酶的模擬腸緩沖液中加入目的蛋白，其他步驟同上。

1.2.7 SDS-PAGE分析 取蛋白樣品進行制樣，100℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清點樣，5%濃縮膠，12%分離膠，80 V電泳20 min，120 V電泳60 min。電泳結(jié)束后取出凝膠，進行染色、脫色。

1.2.8 Western blot 分析 SDS-PAGE電泳完畢后，20 V電壓條件先轉(zhuǎn)膜48 min。轉(zhuǎn)膜完畢，用PBST漂洗NC膜，之后加封閉液，80 r/min轉(zhuǎn)速搖床上室溫孵育1-3 h或者4℃過夜。加入用封閉液1∶2 000倍稀釋的AM79 EPSPS蛋白小鼠單克隆抗體，室溫孵育1 h。倒掉雜交液，用PBST室溫洗滌3次，每次5 min。再加入用封閉液1∶8 000倍稀釋的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，倒掉雜交液，用PBST室溫洗滌3次，每次3 min。最后加入顯色液室溫下顯色，用UVP觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建

擴增AM79 EPSPS基因，在5'端和3'端分別添加BamH I 和 Hind III酶切位點。AM79 EPSPS用BamH I和Hind III進行酶切，連接到用相同內(nèi)切酶進行酶切的pET-30a上，構(gòu)建載體pET-AM79。將pET-AM79轉(zhuǎn)到大腸桿菌菌株Transetta（DE3）中，用于目的蛋白的表達純化。

2.2 AM79蛋白誘導(dǎo)表達溫度的確定以及可溶性分析

為了探究不同溫度條件對誘導(dǎo)目的蛋白可溶性的影響，實驗設(shè)置了16℃和28℃兩種溫度，通過加入相同濃度的誘導(dǎo)劑IPTG（1mol/L）分別進行20-26 h和4-6 h誘導(dǎo)AM79 EPSPS蛋白，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)在兩種溫度條件下，蛋白表達量沒有明顯差別，且都是上清蛋白表達量明顯低于沉淀蛋白表達量。

圖1 不同溫度下AM79 EPSPS蛋白可溶性的SDS-PAGE檢測

2.3 AM79 EPSPS蛋白純化及濃縮

首先對可溶性的AM79 EPSPS蛋白進行Ni-NTA親和純化，用不同濃度的咪唑洗脫收集流出液，經(jīng)過SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)在250 mmol/L咪唑濃度下洗脫的前2 mL的純化蛋白濃度最高（圖2），考馬斯亮藍試劑盒定量后濃度最高為0.2 mg/mL。將250 mmol/L咪唑洗脫下來的蛋白用超濾離心管濃縮后再定量，以不同濃度的BSA標準蛋白作橫坐標，OD595吸光值作縱坐標，繪制蛋白標準曲線（圖3）。利用標準曲線所生成的公式純化目的蛋白定量，結(jié)果用250 mmol/L咪唑濃度下洗脫的L250-1 AM79 EPSPS蛋白濃度為5.05 mg/mL，符合國家標準要求模擬胃腸液消化蛋白的濃度。

2.4 AM79 EPSPS蛋白在模擬胃液中的穩(wěn)定性

模擬胃液消化體系確認結(jié)果（圖4-A）顯示，穩(wěn)定對照牛β-乳球蛋白B（18.4 kD）在60 min內(nèi)沒有被降解，而不穩(wěn)定對照牛乳清白蛋白（BSA）（66.4 kD）在模擬胃液中15 s就已完全消化，說明了該消化體系的穩(wěn)定性及有效性，可以用于以下的轉(zhuǎn)基因玉米蛋白模擬消化實驗。

在該體系下，AM79 EPSPS蛋白在體外模擬胃液消化過程中，SDS-PAGE檢測到消化時間0 s時尚未消化，仍然可以檢測到外源蛋白條帶（48.3 kD），消化時間15 s時，外源蛋白就被完全消化（圖4-B），Western bloting進一步證明了這一結(jié)果，并未檢測到蛋白小片段殘留（圖4-C）。

圖2 AM79 EPSPS蛋白的Ni-NTA親和層析純化結(jié)果

圖3 蛋白定量標準曲線

圖4 AM79蛋白在模擬胃液中消化穩(wěn)定性分析

2.5 AM79 EPSPS蛋白在模擬腸液中的穩(wěn)定性

模擬腸液消化體系確認結(jié)果（圖5-A）顯示，穩(wěn)定對照大豆胰蛋白酶抑制劑（STI）（20.0 kD）在60 min內(nèi)仍不能被消化，而不穩(wěn)定對照β-乳球蛋白B（BLG）（18.4 kD）在模擬腸液中15 s就全部消化，這說明了該消化體系的穩(wěn)定性及有效性，可以用于以下的轉(zhuǎn)基因玉米蛋白模擬消化實驗。

在該體系下，用2 mg/mL的AM79 EPSPS蛋白在體外模擬腸液消化過程中，SDS-PAGE檢測到0 s時外源蛋白未被消化，仍然可以檢測到外源蛋白條帶（48.3 kD），消化時間15 s時外源蛋白就被完全消化（圖5-B），Western bloting進一步證明了這一結(jié)果，并未檢測到蛋白小片段殘留（圖5-C）。

圖5 AM79 EPSPS蛋白在模擬腸液中的消化穩(wěn)定性分析

3 討論

每一個注冊的轉(zhuǎn)基因作物都要根據(jù)國際食品法典的建議進行安全性評價，其中包括蛋白質(zhì)特性、在模擬胃腸液消化中進行穩(wěn)定評估、在小鼠中進行急性高劑量口服毒性試驗、與已知毒素和致敏原進行氨基酸序列比對及對非靶標生物的作用。體外模擬胃腸液消化穩(wěn)定性評價恰好是最基礎(chǔ)也是最關(guān)鍵的一個步驟。自1996年，Astwood等［17］首次將體外胃蛋白酶消化方法系統(tǒng)地應(yīng)用于食物致敏元的消化穩(wěn)定性評價以來，消化穩(wěn)定性實驗一直是外源蛋白質(zhì)，尤其是通過基因工程轉(zhuǎn)入傳統(tǒng)食品中表達的蛋白質(zhì)致敏性評價的重要部分。一般情況下，如果一種蛋白質(zhì)暴露于胃液或腸液后能迅速被消化，可以認為其對機體產(chǎn)生致敏反應(yīng)的機率很?。?8］。目前商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物中表達的CP4 EPSPS［19］、PAT［12］、PMI［13］、HPT［14］等蛋白都進行了嚴格的體外模擬胃腸液試驗，結(jié)果表明這些蛋白均能夠被快速降解。

本實驗通過原核表達并用Ni-NTA親和層析方法純化獲得AM79 EPSPS蛋白。由于外源蛋白AM79 EPSPS濃度較低，因此運用與蛋白分子量大小相符的超濾離心管進行濃縮后參考模擬胃腸液消化穩(wěn)定性試驗的國家標準，將蛋白濃度設(shè)置為國家標準中的樣品質(zhì)量濃度（5、2 mg/mL）進行消化實驗。結(jié)果顯示以國家標準的質(zhì)量濃度進行消化時，AM79 EPSPS蛋白及其可見片段在模擬胃液和腸液中均在15 s內(nèi)完全消化，即AM79 EPSPS蛋白在模擬胃腸液中不穩(wěn)定。在對AM79蛋白進行消化穩(wěn)定性實驗后，該蛋白都會以小肽或氨基酸的形式存在，而這些物質(zhì)在人體內(nèi)僅能夠作為膳食來源的營養(yǎng)物質(zhì)。除了花粉蛋白，其他所有免疫性蛋白對消化酶都有極高的穩(wěn)定性，因此蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可以被認為是預(yù)測蛋白質(zhì)免疫原性的重要參考數(shù)據(jù)［20］。蛋白質(zhì)經(jīng)過胃蛋白酶消化后形成小于3.5 kD的小肽和氨基酸，則被認為幾乎不可能具有免疫原性［21］。根據(jù)以上研究進展，可以初步判斷，AM79 EPSPS蛋白經(jīng)過胃腸液消化后，不具有免疫原性。

4 結(jié)論

得到AM79 EPSPS純化蛋白后，在體外模擬胃腸液消化穩(wěn)定性實驗中，該蛋白在模擬胃液和腸液中均不穩(wěn)定，15 s即被完全消化，屬于極易消化蛋白，不具有免疫原性。

［1］Taylor SL, Hefle SL. Will genetically modified foods be allergrnic？［J］. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2001, 107（5）：765-771.

［2］Lehrer SB, Horner WE, Reese G. Why are some proteins allergenic？ Implications for biotechnology［J］. Critical Reviews Food Science and Nutrition, 1996, 36（6）：553-564.

［3］Mill S, Madsen C, Shewry PR, et al. Food allergens of plant origintheir molecular and evolutionary relations［J］. Trends in Food Science & Technology, 2003, 14（4）：145-145.

［4］Bannon GA. What makes a food protein an allergen？［J］. Current Allergy Asthma Reports, 2004, 4（1）：43-46.

［5］Metcal DD. Astwood JD, Townsend R, et al. Assessment of the allergenic potential of foods derived from genetically engineered crop plants［J］. Critical Reviews Food Science and Nutrition, 1996, 36（Suppl. 1）：165-186.

［6］Taylor SL. Protein allergenicity assessment of foods produced though agricultural biotechnology［J］. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 2002, 42：99-112.

［7］FAO/WHO. Evaluation of allergenicity of genetically modified foods. Report of a joint FAO/WHO expert consultation on allergenicity of foods derived from biotechnology［R］. Rome：FAO/WHO, 2001.

［8］Codex Alimentarius Commission. CAC/GL 45 —2003 Guideline for the Confuct of Food Safety Assessment of Foods Derived from Recombinant-DNA plants［S］.

［9］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部869號公告-2-2007 轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品食用安全檢測模擬胃腸液外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性實驗方法［S］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2007.

［10］Cao S, He X, Xu WT, et al. Safety assessment of Cry1C protein from gentically modified rice according to the standards of PR China for a new food resource［J］. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2010, 58（3）：474-481.

［11］Herouet C, Rouquie D, Freyssinet M, et al. Safety evalation of the double mutant 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase（2mEPSPS）from maize that confers tolerance to glyphosate herbicide in transgenic plants［J］. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2009, 54（2）：143-153.

［12］Herouet C, Esdaile DJ, Mallyon BA, et al. Safety evaluation of the phosphinothricin acety1transferase proteins encoded by the pat and bar dequences that confer tolerance to glufosinate-ammonium herbicide in transgenic plants［J］. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2005, 41（2）：134-149.

［13］Privalle LS. Phosphomannose isomerase, a novel plant selection system：potential allergenicity assessment［J］. Annals of New York Academy of Sciences, 2002, 964：129-138.

［14］Lu Y, Xu W, Kang A, et al. Prokarytic expression and allergenicity assessment of hygromycin B phosphotransferase protein derived from genetically modified plants［J］. Journal of Food Science, 2007, 72（7）：228-232.

［15］ Cao GY, Chen RR, Du J, et al. Analysis of the active sites in an 5-enolpyrvy-shikimate-3-phosphate synthase（EPSPS）gene of AM79 aroA［J］. Journal of Integrative Agriculture, 2015, 23（5）：606-616

［16］Ren ZJ, Cao GY, Zhang YW, et al. Overexpression of a modified AM79 aroA gene in transgenic maize confers high tolerance to glyphosate［J］. Journal of Integrative Agriculture 2015, 14（3）：414-422.

［17］Astwood JD, Leach JN, Fuchs RL. Stability of food allergens to digestion in vitro［J］. Nature Biotechnology, 1996, 14（10）：1269-1273.

［18］楊輝, 向錢, 李寧. 食品中轉(zhuǎn)基因表達蛋白的危險性評估［J］.中國食品衛(wèi)生雜志, 2010, 22（2）：173-178.

［19］Harrison HA, Han CT, Hopkins RG, et al. The expressed protein in glyphosate-tolerrant soybean, 5-enolypyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Agrobacterium sp. strain CP4, is rapidly digested in vitro and is not toxic to acutely gavaged mice［J］. The Journal of Nutrition, 2003, 133（6）：1909-1912.

［20］Astwood JD, Leach JN, Fuchs RL. Stability of food allergens to digestion in vitro［J］. Nature Biotechnology, 1996, 14：1269-1273.

［21］Fu TJ, Abbott UR, Hatzos C. Digestibility of food allergens and nonallergenic proteins in simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid-a comparative study［J］. Journal of Arricultural and Food Chemistry, 2002, 50：7154-7160.

（責(zé)任編輯 李楠）

Digestive Stability of AM79 EPSPS Protein in Simulative Gastric and Intestinal Fluid

WANG Yu1，2WANG Jian-hua1LIU Yun-jun2
（1. College of Agriculture，China Agricultural University，Beijing 100094；2. Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

AM79 EPSPS is a novel glyphosate-resistant gene with independent intellectual property rights in China and isolated from highly glyphosate-polluted soil using metagenomics method. The gene owns a promising value because its overexpression in the transgenic corn increased the corns’ glyphosate resistances. In order to evaluate the safety of AM79 EPSPS protein as food，the digestive stability of AM79 EPSPS protein in simulative gastric and intestinal fluid was analyzed according to the national standard of the People’s Republic of China. Gene AM79 EPSPS was constructed into prokaryotic expression vector pET-30a，and the soluble AM79 EPSPS protein of 48.3 kD was expressed in Escherichia coli，and purified using Ni-NTA chromatography. The digestive stability of the purified AM79 EPSPS protein was performed via in vitro simulative gastric and intestinal fluid. The results showed that the AM79 EPSPS protein was completely digested within 15 s in the simulated gastric and intestinal fluid，no any remain of protein was detected by SDS-PAGE and Western blotting，indicating that AM79 EPSPS protein was easily digested in the simulated gastric and intestinal fluid.

AM79 EPSPS protein；glyphosate；simulative gastric and intestinal fluid；digestive stability

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0072

2017-02-10

轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項（2016ZX08003-001）

王玉，女，碩士，研究方向：分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)基因檢測；E-mail：llcwangy1103@163.com

王建華，女，博士，教授，研究方向：分子生物學(xué)與種子科學(xué)技術(shù)；E-mail：wangjh63@cau.edu.cn

劉允軍，男，博士，副研究員，研究方向：玉米分子育種；E-mail：liuyunjun@caas.cn