吳玉瓊陳瑩胡永樂左正宏王重剛

（1. 武夷學院茶與食品學院，武夷山 354300；2. 廈門大學生命科學學院，廈門 361005）

四種新型農藥對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應

吳玉瓊1陳瑩2胡永樂1左正宏2王重剛2

（1. 武夷學院茶與食品學院，武夷山 354300；2. 廈門大學生命科學學院，廈門 361005）

為了研究4 種農藥（腈苯唑、吡唑醚菌酯、惡霜靈、戊菌隆）單獨及聯(lián)合作用對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響，設計7個實驗組（空白組、溶劑組、4種農藥單獨暴露組及聯(lián)合暴露組）對斑馬魚胚胎暴露72 h，結果顯示，濃度50 ng/L的4種農藥單獨暴露導致心包囊和卵黃囊水腫比率、脊柱彎曲率均顯著高于對照組；腈苯唑、惡霜靈及聯(lián)合暴露導致斑馬魚仔魚心率顯著下降，出現(xiàn)顯著的心律不齊；斑馬魚胚胎的Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性被顯著誘導，而聯(lián)合暴露表現(xiàn)出顯著的抑制作用。結果說明，環(huán)境濃度的農藥暴露對魚類胚胎發(fā)育具有明顯的毒性。

腈苯唑；吡唑醚菌酯；惡霜靈；戊菌隆；聯(lián)合暴露；斑馬魚；胚胎發(fā)育

農藥是化學品中毒性較高、降解緩慢的一種物質［1］，其易隨降雨、徑流及灌溉水等進入地表水、地下水和土壤等不同區(qū)域［2］。農藥進入水體后，易對水中的生物造成影響，嚴重時可引起水生生物急性中毒，即使未導致生物死亡，也可在生物體內富集，通過食物鏈危害人群健康［3］。隨著人們環(huán)境保護意識的增強和生活質量的提高，農藥功用逐漸從殺死轉為調控，品種不斷更新，全面進入高效化時代。據(jù)報道，不同農藥在不同環(huán)境生物條件下降解速度、生物活性、環(huán)境風險等均存在差異［4］。新型農藥的開發(fā)被認為是提高效率、減少用量的綠色化學之路［5］，對于農業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護具有重要意義。

腈苯唑（Fenbuconazole）屬于唑類農藥。唑類農藥作為殺菌劑具有高效、廣譜、低毒、持續(xù)時間長等特點，自1976年以來數(shù)10種唑類農藥被推向市場［6］，2003-2004年銷售額年增長率為47.7%，在所有農藥類別中高居第一位［7］。吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin）屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，該類殺菌劑活性高，殺菌譜廣，作用機制獨特，對環(huán)境友好，是繼三唑類殺菌劑之后一個新的里程碑［8］。惡霜靈（Metoxazon）屬于酰胺類農藥。酰胺類除草劑在市場中所占份額極大，2009年，我國酰胺類除草劑交易額達15億元，占我國農用除草劑總金額的18%［9］。研究發(fā)現(xiàn)部分酰胺類農藥殘效期較長，且具有明顯的致突變性［10，11］。戊菌?。≒encycurone）屬于脲類新型農藥，由日本特殊農藥公司和德國拜耳公司聯(lián)合開發(fā)的脲類殺菌劑，無內吸性，其具有良好的保護和持效活性［12］。在法國的河流表面水中，唑類農藥，包括腈苯唑，檢出的濃度從幾納克水平到最大的微克水平（丙環(huán)唑1.75 μg/L，Propiconazole）［13］。吡唑醚菌酯在美國加利福尼亞的一個河口被頻繁檢出，每升濃度從幾十到兩百多納克［14］。我國福建省九龍江流域水中農藥污染，監(jiān)測結果顯示存在82種農藥，普遍的污染濃度達到幾十納克甚至100納克以上，最高的為腐霉利（Procymidone）（3 904 ng/L）［15］。孫廣大［16］于2008年在九龍江口及廈門西海域表層水和沉積物中，檢測出除傳統(tǒng)的有機磷和有機氯農藥，苯胺類、酰胺類、唑類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、苯胺基嘧啶等“新型”農藥也被大量檢出，說明農業(yè)地區(qū)流域的水環(huán)境中存在多種類農藥復合污染狀況。

研究農藥的急性、亞慢性與慢性毒性一般利用水中食物鏈的代表生物如藻類、蚤與魚類等，并用得到的實驗數(shù)據(jù)評價農藥對水生生物的影響［17］。斑馬魚（Danio rerio）具有體型小、繁殖速度快、飼養(yǎng)管理簡便、其胚胎的整個發(fā)育過程透明可見等優(yōu)點，多數(shù)國際組織和國家已將斑馬魚作為制定環(huán)境毒性標準的模式動物［18-20］。經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）于1996已制定了詳細的操作指南［21］。

有研究認為斑馬魚胚胎比成魚對有毒化合物更加敏感，用斑馬魚胚胎為受試生物進行急性毒性研究更為適宜［22］。近年來關于農藥對斑馬魚胚胎發(fā)育影響的報道不為少見［23，24］，其中關于唑類農藥對斑馬魚的發(fā)育毒性有較深入的研究［25，26］。但是新型農藥在環(huán)境濃度下的毒性作用比較鮮有報道。本實驗研究腈苯唑、吡唑醚菌酯、惡霜靈、戊菌隆對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性作用，通過分析相同濃度分別單獨作用及4種農藥聯(lián)合暴露后斑馬魚胚胎的存活率、孵化率、畸形發(fā)生率、ATP酶活性以及心臟功能各生理指標，比較常見的4種農藥的毒性，為新型農藥的合理使用提供科學依據(jù)，也為完善農藥對水環(huán)境污染效應評估標準提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 戊菌隆（純度≥96%）、吡唑醚菌酯（純度≥96%）、腈苯唑（純度≥96%）、惡霜靈（純度≥96%）購于Sigma-Aldrich公司；先以丙酮為助溶劑溶解配制濃度為50 μg/L儲備液，4℃避光保存。蛋白含量測定及ATP 酶活性測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純試劑。

1.1.2 實驗用魚和魚卵收集 斑馬魚（WT-U系）喂養(yǎng)根據(jù)Westerfield［27］的方法進行，飼養(yǎng)于廈門大學生命科學學院斑馬魚養(yǎng)殖中心。循環(huán)養(yǎng)殖水，水溫26±1℃，光照周期14 h光照/10 h黑暗，每天喂食新鮮孵化的豐年蟲（Artemia nauplii）2-3次。

實驗前1 d晚上，將雌雄魚按照2∶1比例放置在孵化槽中，并用隔板將雌雄分開，第2天早上9點左右打開隔板，開燈給予光照刺激使其交配產(chǎn)卵。0.5-1 h內收集魚卵，用斑馬魚養(yǎng)殖液清洗并在顯微鏡下觀察，選取受精胚胎用于暴露實驗。

1.2 方法

1.2.1 暴露實驗 實驗前將農藥儲備液用培養(yǎng)液（3.5 g/L NaCl，0.05 g/L NaHCO3，0.05g/L KCl，0.05 g/L CaCl2）分別配制終濃度為50 ng/L的單種農藥曝污液及4種農藥混合曝污液（即4種農藥分別為12.5 ng/L，總濃度為50 ng/L），共5個曝污組，并設空白組和對照組（丙酮濃度為0.1%。丙酮作為助溶劑適宜濃度為≤0.1%［28］），每個實驗組設5個平行組。分別置于直徑 90 mm 培養(yǎng)皿中，注入曝污培養(yǎng)液30 mL，每皿培養(yǎng)100枚斑馬魚胚胎。實驗期間28±0.5℃恒溫培養(yǎng)，每隔 12 h 更換等量等濃度的培養(yǎng)液并清理死亡胚胎。

1.2.2 相關形態(tài)學指標的統(tǒng)計及計算 分別于斑馬魚胚胎12、24、36、48、72 hpf（Hour postfertilization）時，觀察胚胎的存活（肉眼觀察胚胎變白或者顯微鏡下觀察胚胎絮狀凝結、心臟不跳動即可判定死亡），統(tǒng)計存活率。48 hpf時，統(tǒng)計孵化率（胚胎出膜并能游動視為已孵化），72 hpf時統(tǒng)計畸形率（主要指心包囊水腫、卵黃囊水腫和脊柱彎曲）。

存活率（%）=存活胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%

孵化率（%）=已孵化胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%

畸形率（%）=畸形胚胎數(shù)/存活胚胎數(shù)×100%

1.2.3 心率及相關功能指標的分析 根據(jù)Incardona等［29］、Chen等［30］的方法測量及計算。將斑馬魚仔魚（每個處理組設5個平行，每個平行隨機取3條），固定于6%的甲基纖維素中，并于28±0.5℃下靜置5-10 min，直到仔魚心跳穩(wěn)定后于顯微鏡下對20 s內心房和心室的搏動次數(shù)進行記錄并攝影，分別測量心室舒張/收縮末期的長軸（a），短軸（b）長，記錄胚胎20 s內心跳次數(shù)，計算1 min心率（HR）、心室舒張/收縮容積（EDV/ESV）、每搏輸出量（SV）、心輸出量（CO）。采用Incardona［29］的方法，記錄一個完整心跳所經(jīng)歷的時間幀數(shù)，每條仔魚測3次，取3次所得到的數(shù)值的標準偏差作為這條仔魚的心律參數(shù)，獲得它們的心律參數(shù)分析心律不齊。

1.2.4 ATP 酶活性測定 選擇 72 hpf 的仔魚以超純水蕩洗后用液氮速凍，保存于-80℃冰箱。實驗前將樣品于冰盒上解凍，按1∶4的比例加入生理鹽水，在勻漿器內仔細研磨。準備好的勻漿液在冷凍離心機上，4℃下，4 000 r/min 離心10 min，取上清液測定蛋白含量和酶活性。

蛋白含量測定、Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的測定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。計算酶活力時，定義每小時每毫克組織蛋白的組織中ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1 μmoL 無機磷的量為一個ATP 酶活力單位，即微摩爾磷/毫克蛋白/小時（μmol Pi/mg pro/h）。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 應用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行處理。結果采用平均值±標準誤差（Mean±SE）表示，單因素方差分析（one-way ANOVA）的方法進行統(tǒng)計學分析，組間數(shù)據(jù)用Tukey HSD法進行顯著性水平分析，設定P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 四種農藥暴露對斑馬魚胚胎存活率及孵化率的影響

斑馬魚胚胎分別經(jīng)4種農藥單獨暴露及聯(lián)合暴露72 h，胚胎的存活率與溶劑對照組相比無顯著性差異（結果未顯示）。胚胎孵化率，惡霜靈、腈苯唑及聯(lián)合暴露組與溶劑對照組相比顯著下降，吡唑醚菌酯、戊菌隆組無顯著差異（圖1）。

圖1 暴露48 h對斑馬魚胚胎孵化率的影響

2.2 四種農藥暴露對斑馬魚仔魚囊腫率及脊柱彎曲率的影響

圖2、圖3顯示，各暴露組的脊柱彎曲率顯著上升，其中腈苯唑作用最明顯。囊腫率在各農藥單獨暴露組也表現(xiàn)出明顯上升，在戊菌隆、惡霜靈和腈苯唑組出現(xiàn)顯著差異，但聯(lián)合暴露組與對照組無顯著差異。

2.3 四種農藥暴露對斑馬魚仔魚心臟功能指標的影響

除惡霜靈與對照組無差異，其他各暴露實驗組顯示心率顯著下降（圖4）；從心室容量的變化而言，惡霜靈及聯(lián)合作用導致EDV顯著上升，戊菌隆、吡唑醚菌酯和腈苯唑沒有產(chǎn)生顯著的影響，而ESV在惡霜靈組及聯(lián)合作用組與溶劑對照相比無差異，戊菌隆、吡唑醚菌酯和腈苯唑暴露使ESV下降（圖5-A）；惡霜靈暴露及聯(lián)合暴露導致每搏輸出量（SV）顯著上升（圖5-B）；心輸出量CO在惡霜靈組顯著增加，在吡唑醚菌酯、戊菌隆和腈苯唑組顯著下降，聯(lián)合作用組與對照組無顯著差異（圖5-C）。各農藥暴露組均導致仔魚出現(xiàn)心律不齊，惡霜靈、腈苯唑及聯(lián)合暴露組呈現(xiàn)心律不齊效應顯著（圖6）。

2.4 四種農藥對斑馬魚仔魚ATP酶活性的影響

斑馬魚胚胎經(jīng)惡霜靈暴露72 h，其仔魚組織的Na+/K+-ATP酶活性表現(xiàn)出顯著上升，在聯(lián)合作用組則出現(xiàn)顯著降低，其它暴露組均與對照組無差異；Ca2+-ATP酶活性在吡唑醚菌酯、惡霜靈、腈苯唑暴露組顯著上升，而聯(lián)合作用組為顯著下降（圖7）。

圖2 暴露72 h對斑馬魚仔魚脊柱彎曲率的影響

圖3 暴露72 h對斑馬魚仔魚囊腫率（含心包囊腫和卵黃囊腫）的影響

圖4 胚胎暴露72 h對斑馬魚仔魚心率的影響

3 討論

魚類是對化學污染物較敏感的脊椎動物之一，其胚胎發(fā)育階段更為敏感，生理和器官形成方面更易受到外界環(huán)境影響［31］。心包囊腫、脊柱彎曲等是斑馬魚胚胎毒性檢測實驗中常出現(xiàn)的毒性反應［32］。已有研究表明，甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺等農藥誘導斑馬魚胚胎出現(xiàn)心包囊水腫、軀干彎曲等癥狀［23］；戊唑醇、烯唑醇、異丙甲草胺、阿特拉津等農藥在高濃度時對斑馬魚胚胎發(fā)育顯著表現(xiàn)出心包囊腫和脊柱彎曲［33］；斑馬魚胚胎在β-氯氰菊酯暴露后幼魚體軸表現(xiàn)出嚴重致畸效應［34］；還有表面活性劑［35］、四溴聯(lián)苯醚［36］、四氯二苯并-p-二噁英［37］、重金屬銅、鎘、汞［38，39］等都會引起斑馬魚胚胎發(fā)育畸形。本實驗結果顯示各農藥暴露組對斑馬魚仔魚出現(xiàn)顯著的心包囊和卵黃囊水腫、脊柱彎曲等反應，表明4種農藥對斑馬魚胚胎具有發(fā)育毒性。

Ca2+-ATP酶是質膜上鈣離子轉運系統(tǒng)中最重要的部分，可利用ATP水解的能量維持細胞內外鈣離子濃度［40］。Na+/ K+-ATP 酶在水生生物體內普遍存在，是橫跨質膜的一種固有蛋白，也是組成Na+/ K+泵活性的主要部分，對維持細胞內離子的轉運以及能量代謝有著重要作用［40］。體軸的彎曲通常是由于體軸肌肉組織損壞，包括肌肉細胞壞死及肌纖維受損，或脊椎骨自身發(fā)生畸形所致［41］。此外，Ca2+通道功能紊亂也會導致脊柱彎曲［41］。本實驗結果顯示，斑馬魚胚胎在各農藥暴露后Ca2+-ATP酶、Na+/ K+-ATP酶活性上升，聯(lián)合作用中兩種ATP酶活性下降，兩種ATP酶活性的上升或下降引起Ca2+通道功能紊亂都引起脊柱彎曲［41］。所以，Na+/ K+-ATP 酶和Ca2+-ATP酶活性的改變可能是農藥導致斑馬魚胚胎脊柱彎曲的原因之一。ATP 酶活性作為生態(tài)毒理學指標可以作為水體農藥監(jiān)測的生物標志物［42］。

圖5 暴露72 h對斑馬魚仔魚心室容量（舒張/收縮容量）（A）、每搏輸出量（B）、心輸出量（C）的影響

圖6 暴露72 h導致斑馬魚仔魚心律不齊

圖7 暴露72 h對斑馬魚仔魚Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的影響

心臟作為胚胎發(fā)育過程中最早發(fā)揮功能的器官，其完善的循環(huán)功能對于胚胎正常發(fā)育起關鍵作用。斑馬魚發(fā)育過程中心血管在20 hpf 開始形成，能夠收縮但尚未與發(fā)育中的血液循環(huán)系統(tǒng)相連，發(fā)育至30 hpf時心臟分化出心室和心房，36 hpf 時開始規(guī)律心跳［43］。正常生長條件下，48 hpf 時主要的器官系統(tǒng)完成形態(tài)發(fā)生并開始破膜孵化，此時心臟功能已相對比較完善，是斑馬魚胚胎發(fā)育進程的一個重要轉折點。心率易受外界因素如溫度、污染等影響，有研究表明化學污染物暴露會使斑馬魚心率上升或下降［44］。心律不齊是心血管疾病危害的病癥之一，而引起心律不齊的原因很多，研究表明K+和Ca2+失調在心律不齊中有重要影響［45］。本實驗結果顯示4種農藥單獨暴露后表現(xiàn)心率下降趨勢，心室容量有不同程度的上升或下降，致使每搏輸出量及心輸出量出現(xiàn)上升或下降，從而使各暴露組表現(xiàn)出心律不齊。4種農藥的暴露均可致斑馬魚胚胎心臟功能異常。

生物處于脅迫條件下時，酶活性會隨之變化，可表現(xiàn)為抑制或誘導，還能反映能量代謝的變化［46］。本實驗結果中各農藥單獨暴露組Na+/ K+-ATP酶和Ca2+-ATP 酶的活性被誘導，聯(lián)合作用則抑制了兩種ATP酶活性，提示雖然農藥的濃度相同，聯(lián)合暴露對這兩種ATP酶活性的影響更大。ATP酶在細胞內具有重要功能［47］，在離子平衡和滲透壓穩(wěn)態(tài)的維持方面具有重要作用［48］。K+和Ca2+的轉運相互協(xié)調和制約共同維持心肌細胞動作電位的穩(wěn)定［49］，Ca2+-ATP 酶活性的改變會影響心臟功能［50，51］，所以Na+/ K+-ATP 酶和Ca2+-ATP酶活性的改變也是農藥暴露影響魚類胚胎心臟功能的原因。

4 結論

通過對腈苯唑、吡唑醚菌酯、惡霜靈、戊菌隆等4種新型農藥在相同濃度下斑馬魚胚胎的暴露實驗，結果表明，在低濃度下4種農藥單獨作用均可導致斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性，尤其心臟發(fā)育受毒性影響較敏感；從導致脊柱彎曲及心律不齊效應來看腈苯唑毒性最強；Na+/ K+-ATP 酶和Ca2+-ATP酶是功能較廣泛的酶，聯(lián)合暴露抑制這兩種ATP酶的活性，可能對斑馬魚許多生理活動產(chǎn)生不利的影響。

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（責任編輯 李楠）

Toxic Effects of Four Currently-used Pesticides on Zebrafish Embryonic Development

WU Yu-qiong1CHEN Ying2HU Yong-le1ZUO Zheng-hong2WANG Chong-gang2
（1. College of Tea and Food Science，Wuyi University，Wuyishan 354300；2. School of life Sciences，Xiamen University，Xiamen 361005）

In order to study the effects of four pesticides（fenbuconazole，pyraclostrobin，metoxazon，and pencycurone），either individually or jointly，on the development of zebrafish embryos，seven experiments（blank control，solvent control，individual of 4 pesticides，and jointly combined four pesticides）were designed to treat zebrafish embryos for 72 h. The results showed that individual exposure to any of 4 pesticides at 50 ng/L led to the significant elevation on the rate of pericardial and yolk sac edema and the frequency of dorsal curvature in the larvae compared to the control. The exposure to fenbuconazole，metoxazon，and combined four pesticides resulted in a significant reduction in the heart rate and a significant increase in cardiac arrhythmia in the zebrafish larvae. The activities of Na+/K+-ATPase and Ca2+-ATPase of the embryos were significantly induced by the individual exposure to 4 pesticides，while the both activities were remarkably inhibited by the combined exposure. The results confirmed that these pesticides at environmental relevant concentration presented the clear toxicity to the development of fish embryo.

fenbuconazole；pyraclostrobin；metoxazon；pencycurone；combined exposure；Zebrafish；development of embryo

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0032

2017-01-20

國家自然科學基金項目（41376118），福建省2011協(xié)同創(chuàng)新中心（閩教科［2015］75號）

吳玉瓊，女，副教授，研究方向：環(huán)境毒理、食品營養(yǎng)與安全；E-mail：wyq93042@163.com