王佳雯 高云鵬 孫天霞 劉美辰 趙雨 王思明

（長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心，長春130117）

梅花鹿胸腺素beta10基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

王佳雯 高云鵬 孫天霞 劉美辰 趙雨 王思明

（長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心，長春130117）

轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)Tβ10在鹿茸中高表達(dá)，為了研究Tβ10與鹿茸生長發(fā)育間的關(guān)系，構(gòu)建Tβ10真核表達(dá)載體。使用Trizol法提取梅花鹿鹿茸總RNA，PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增梅花鹿Tβ10基因，利用酶切位點(diǎn)將目的片段插入真核表達(dá)載體VR1012構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，通過Fugene?6將質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，使用Western blotting和免疫熒光方法檢測目的基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆得到的梅花鹿Tβ10基因長度為129bp，編碼42個(gè)氨基酸，成功構(gòu)建真核表達(dá)載體VR1012- Tβ10-HA，轉(zhuǎn)染后使用Western blotting方法檢測到梅花鹿Tβ10在293T細(xì)胞中表達(dá)，免疫熒光方法證明梅花鹿Tβ10主要定位在細(xì)胞漿中。

梅花鹿；胸腺素beta10；質(zhì)粒構(gòu)建；轉(zhuǎn)染；真核表達(dá)

胸腺素（Thymosin）是一類在人類的健康和疾病中發(fā)揮不同重要作用的小分子蛋白。根據(jù)等電點(diǎn)的不同分為3個(gè)家族：胸腺素α（pI＜pH5.0），胸腺素β（pH5.0＜pI＜ph7.0），胸腺素γ（pI＞pH7.0）［1］。胸腺素β10是β族胸腺素中的一個(gè)重要成員，屬于Tβ4的一種類似物［2］，包括43個(gè)氨基酸殘基，具有兩個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)。目前對(duì)Tβ10的研究集中于其在腫瘤［3-7］、胚胎［8］、神經(jīng)發(fā)育系統(tǒng)［9］和炎癥細(xì)胞［10-12］中的差異表達(dá)，以及Tβ10在血管發(fā)生［13］、細(xì)胞生長和凋亡［14-16］方面的作用。同時(shí)，Tβ10被認(rèn)為與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)有關(guān)，影響細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)型等［17-20］。本實(shí)驗(yàn)室通過前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Tβ10在鹿茸快速生長期高度表達(dá)，說明Tβ10可能與鹿茸的生長和再生相關(guān)。通過構(gòu)建梅花鹿Tβ10基因的真核表達(dá)載體，以期為研究其在鹿茸生長和再生中的作用機(jī)制提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)載體VR1012、E.coli DH5α菌株、鹿茸材料和293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。TRIZOL和雙抗購自Invitrogen公司；pMD-18 T vector、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR相關(guān)試劑、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒等購自TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑Fugene?6購自Promega公司；鼠抗HA單克隆抗體和鼠抗Tubulin單克隆抗體購自covance公司；Alexa Fluor 488綠色熒光標(biāo)記二抗購自Thermo Fisher公司；DAPI購自Roche公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗小鼠二抗購自Jackson公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；細(xì)胞爬片、6孔板購自Nest公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝試劑。PCR引物由長春華大中天生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 293T細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，加入10%血清和1%雙抗，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至匯合度90%時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 鹿茸cDNA的獲取 新鮮的梅花鹿茸取下后迅速放入液氮中，冷凍后置于液氮中研磨，0.05 g組織加入1 mL TRIZOL試劑，勻漿后室溫靜置10 min，加入0.3 mL 氯仿劇烈震蕩15 s，室溫靜置2-3 min，4℃條件下12 000 r/min離心20 min，上清加入1/5體積的5 mol/L NaCl混勻，再加入1/3體積的氯仿，震蕩15 s，靜置2 min，4℃條件下10 000 r/min離心15 min，上清加入1/2上清體積的混合液（0.8 mol/L檸檬酸鈉，1.2 mol/L NaCl）與1/2上清體積的異丙醇，震蕩后4℃放置90 min，4℃條件下10 000 r/min離心15 min，棄上清，75%的乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌1次，4℃條件下7 500 r/min離心5 min，棄上清，干燥15 min，DEPC水溶解沉淀RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶以及Oligo（dt）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA。

1.2.3 Tβ10基因的PCR擴(kuò)增和亞克隆載體構(gòu)建 以轉(zhuǎn)錄組測序得到的序列設(shè)計(jì)引物，上游引物：5'-TCTAGAGCCACCATGGCAGACAAGC-3'（ 引 入Xba I酶切位點(diǎn)和kozak序列）下游引物：5'-GGATC CTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACTTTG CTTGCTTC-3'（引入HA標(biāo)簽和BamH I酶切位點(diǎn)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)?4℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。所得片段經(jīng)膠回收后與pMD-18 T亞克隆載體16℃連接過夜。轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞，接種氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定。

1.2.4 真核表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定 取測序正確的pMD-18 T-Tβ10-HA質(zhì)粒和真核表達(dá)質(zhì)粒VR1012分別進(jìn)行Xba I和BamH I雙酶切，將目的片段和載體片段經(jīng)膠回收后使用T4DNA連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞，接種卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.5 VR1012-Tβ10-HA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入細(xì)胞爬片，再將胰酶消化后的293T細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板。在5% CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中生長至匯合度達(dá)到70%。使用Fugene?6轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒VR1012-Tβ10-HA轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。

1.2.6 免疫印跡 轉(zhuǎn)染36-48 h后收集細(xì)胞，PBS沖洗1次除去殘留培養(yǎng)基，RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞。加入上樣緩沖液混合并煮沸10 min致蛋白變性，使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳來分離樣品。通過半干轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜在5%的脫脂牛奶中在室溫封閉30 min，PBST溶液沖洗1次，加入含有一抗的1% PBS脫脂牛奶，室溫?fù)u動(dòng)孵育1-2 h或者4℃過夜，棄一抗，用PBST溶液漂洗3次，每次5 min。再加入混有對(duì)應(yīng)二抗的1%PBS脫脂牛奶，室溫?fù)u動(dòng)孵育45 min。再用PBST溶液漂洗3次，PBS溶液漂洗1次，最后加入酶聯(lián)二抗的顯色底物，至特異性條帶清晰可見時(shí)，終止反應(yīng)。

1.2.7 免疫熒光 293T細(xì)胞接種于放置有細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到20%-50%時(shí)使用Fugene?6轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染VR1012-Tβ10-HA。24 h后棄上清，加入4%多聚甲醛溶液，室溫固定10 min。棄去固定液，用0.1%的Triton X-100室溫孵育8 min，用含有10% FBS的PBS溶液室溫封閉10 min。PBS溶液沖洗1次，加入一抗，室溫孵育1-2 h。棄去一抗，用PBST溶液沖洗3次。將對(duì)應(yīng)二抗溶液加入孔板中，室溫孵育1 h。棄去二抗，用PBST沖洗3次。加入含有1 μg/mL DAPI的PBS溶液，孵育5 min后用PBS溶液沖洗1次。取出細(xì)胞爬片，細(xì)胞面沖下倒扣于載玻片上，使用熒光顯微鏡采集熒光圖像，分析蛋白的表達(dá)及細(xì)胞定位情況。

2 結(jié)果

2.1 Tβ10 cDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

從梅花鹿鹿茸組織中提取細(xì)胞總RNA，使用nano drop 2000測定OD260/OD280為1.9，通過瓊脂糖凝膠電泳可見3條清晰條帶，分別為28S、18S和5S（圖1，第1泳道），說明RNA無污染，純度較好。經(jīng)RT-PCR技術(shù)獲取cDNA，以其為模板，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得到的序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以DNA Marker為對(duì)照，在100-250 bp左右可見一條特異性亮帶，與預(yù)期大小相符（圖1，第4泳道）。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，連接至亞克隆載體pMD-18 T（圖2，第3泳道）。質(zhì)粒線性大小應(yīng)為2 867 bp，但由于質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)，在電泳結(jié)果呈現(xiàn)出1 000-2 000 bp大小的條帶。連接后的重組質(zhì)粒經(jīng)Xba I和BamH I雙酶切鑒定，在2 000-3 000 bp和100-250 bp兩處可見特異性條帶（圖2，第4泳道），分別為pMD-18 T線性片段及Tβ10-HA片段。提示目的片段成功插入到pMD-18 T載體中。采用通用引物RV-M測序，結(jié)果證明插入片段無突變，構(gòu)建成功。測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中序列匹配率為100%。

2.2 真核表達(dá)載體VR1012-Tβ10-HA雙酶切鑒定

取測序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切獲取目的片段，插入到真核表達(dá)載體VR1012中，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析（圖2）。質(zhì)粒線性大小應(yīng)為5 000 bp左右，但由于質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)，在電泳結(jié)果呈現(xiàn)出2 000-3 000 bp大小的條帶。經(jīng)雙酶切鑒定，在5 000 bp和100-250 bp兩處可見特異性條帶，分別為VR1012線性片段及Tβ10-HA片段，證明VR1012-Tβ10-HA構(gòu)建成功。

圖1 鹿茸軟骨細(xì)胞RNA提取以及Tβ10基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 亞克隆載體pMD-18 T-Tβ10-HA和真核表達(dá)載體VR1012-Tβ10-HA的雙酶切鑒定

2.3 梅花鹿Tβ10基因及蛋白序列分析

分析梅花鹿Tβ10基因可知，其全長為129 bp，共編碼42個(gè)氨基酸。預(yù)測的與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的首要位點(diǎn)為18LKKTET23（圖3）。將梅花鹿Tβ10與人、牛、馬、小鼠、大鼠和豬等不同物種的Tβ10基因序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，得出核苷酸同源性分別為86.7%、99.2%、86.7%、85.2%、85.2%和96.1%，蛋白同源性分別為86.4%、97.6%、86.4%、86.4%、86.4%和100%。說明在進(jìn)化上梅花鹿Tβ10與牛和豬Tβ10較為接近。

圖3 梅花鹿Tβ10核酸和蛋白序列與其他物種的同源性比較

圖4 梅花鹿Tβ10在293T細(xì)胞中過表達(dá)的Western blot分析結(jié)果

2.4 Western blotting分析結(jié)果

轉(zhuǎn)染VR1012-Tβ10-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收取細(xì)胞進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果（圖4）表明，與轉(zhuǎn)染空載體VR1012的對(duì)照細(xì)胞樣品相比，轉(zhuǎn)染VR1012-Tβ10-HA的樣品在6 kD處可見一特異性條帶，說明梅花鹿Tβ10基因在293T細(xì)胞中得到了表達(dá)。

2.5 免疫熒光分析結(jié)果

通過熒光顯微鏡觀察可見，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞可見明顯的綠色熒光，說明梅花鹿Tβ10基因得到了表達(dá)。同時(shí)蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核內(nèi)幾乎無表達(dá)。而未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的陰性對(duì)照則未見綠色熒光。再次說明了梅花鹿Tβ10在293T細(xì)胞中得到了成功表達(dá)（圖5）。

3 討論

胸腺素β10是一種普遍存在于各種組織細(xì)胞當(dāng)中的淋巴細(xì)胞生長因子，參與多種重要的生理和病理活動(dòng)，一直是研究的熱點(diǎn)。鹿茸是目前發(fā)現(xiàn)的唯一可再生哺乳動(dòng)物器官，鹿茸生長速度極快，最快時(shí)可以1-2 cm的速度迅速生長，最終可長至120 cm。鹿茸的快速生長和再生機(jī)制目前尚不明確。通過對(duì)鹿茸不同生長時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)Tβ10在快速生長期表達(dá)量上調(diào)，說明其可能與鹿茸的生長發(fā)育有一定關(guān)系。本研究通過構(gòu)建梅花鹿Tβ10真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究其在鹿茸生長發(fā)育過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

由于鹿茸軟骨中存在較多蛋白，本研究采用改良的Trizol法來提取總RNA。該方法可除去絕大部分蛋白及多糖雜質(zhì)，得到較為純凈的RNA。同時(shí)，本研究首次成功克隆得到了Tβ10的基因序列，與人、牛、馬、小鼠、大鼠和豬等不同物種的Tβ10基因序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，得出核苷酸同源性分別為86.7%、99.2%、86.7%、85.2%、85.2%和96.1%，蛋白同源性分別為86.4%、97.6%、86.4%、86.4%、86.4%和100%。說明Tβ10在進(jìn)化上非常保守，梅花鹿Tβ10的氨基酸序列與牛和豬Tβ10更為接近，與人、馬、大鼠和小鼠Tβ10的C端有一定差異，這是否會(huì)影響梅花鹿Tβ10的功能，是未來要研究的一個(gè)內(nèi)容。

利用本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的Tβ10真核表達(dá)質(zhì)粒，可以通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，研究Tβ10是否可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長，刺激軟骨細(xì)胞分化；同時(shí)可以利用本研究發(fā)現(xiàn)的Tβ10序列，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，獲得重組Tβ10蛋白，研究其對(duì)軟骨細(xì)胞增值的影響，從而深入探索Tβ10在鹿茸軟骨細(xì)胞快速增長過程中所起的作用。

圖5 梅花鹿Tβ10-HA在293T中過表達(dá)的免疫熒光檢測結(jié)果

4 結(jié)論

本研究從梅花鹿鹿茸中獲得了Tβ10的cDNA，通過Xba I和BamH I酶切位點(diǎn)連入VR1012真核表達(dá)質(zhì)粒，成功構(gòu)建梅花鹿Tβ10真核表達(dá)載體，使用Western blotting和免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證了其在293T細(xì)胞中的表達(dá)。

［1］Chen C, Li M, Yang H, et al. Roles of thymosins in cancers and other organ systems［J］. World J Surg, 2005, 29（3）：264-270.

［2］Erickson-Viitanen S, Ruggieri S, Natalini P, et al. Thymosin beta 10, a new analog of thymosin beta 4 in mammalian tissues［J］. Arch Biochem Biophys, 1983, 225（2）：407-413.

［3］Wang H, Jian, S, Zhang Y, et al. High expression of thymosin beta 10 predicts poor prognosis for hepatocellular carcinoma after hepatectomy［J］. World J Surg Oncol, 2014, 12：266.

［4］Gu Y, Wang C, Wang Y, et al. Expression of thymosin beta10 and its role in non-small cell lung cancer［J］. Hum Pathol, 2009, 40（1）：117-124.

［5］Oien KA, Vass JK, Downie I, et al. Profiling, comparison and validation of gene expression in gastric carcinoma and normal stomach［J］. Oncogene, 2003, 22（27）：4287-4300.

［6］Huang L, Zheng M, Zhou Q, et al. Identification of a gene-expression signature for predicting lymph node metastasis in patients with earlystage cervical carcinoma［J］. Cancer, 2011, 117（15）：3363-3373.

［7］Alldinger I, Dittert D, Peiper M, et al. Gene expression analysis of pancreatic cell lines reveals genes overexpressed in pancreatic cancer［J］. Pancreatology, 2005, 5（4-5）：370-379.

［8］Lin SC, Morrison-Bogorad M. Developmental expression of mRNAs encoding thymosins beta 4 and beta 10 in rat brain and other tissues［J］. J Mol Neurosci, 1990, 2（1）：35-44.

［9］Nakanishi F, Ohkawa K, Ishida H, et al. Alteration in gene expression profile by full-length hepatitis B virus genome［J］. Intervirology, 2005, 48（2-3）：77-83.

［10］Ka SM, Rifai A, Chen JH, et al. Glomerular crescent-related biomarkers in a murine model of chronic graft versus host disease［J］. Nephrol Dial Transplant, 2006, 21（2）：288-298.

［11］Tsuji M, Monkawa T, Yoshino J, et al. Microarray analysis of a reversible model and an irreversible model of anti-Thy-1 nephritis［J］. Kidney Int, 2006, 69（6）：996-1004.

［12］Gutierrez-Pabello JA, McMurray DN, Adams LG. Upregulation of thymosin beta-10 by Mycobacterium bovis infection of bovine macrophages is associated with apoptosis［J］. Infect Immun, 2002, 70（4）：2121-2127.

［13］Lin SC, Morrison-Bogorad M. Cloning and characterization of a testis-specific thymosin beta 10 cDNAexpression in post-meiotic male germ cells［J］. J Biol Chem, 1991, 266（34）：23347-23353.

［14］Maelan AE, Rasmussen TK, Larsson LI. Localization of thymosin beta10 in breast cancer cells：relationship to actin cytoskeletal remodeling and cell motility［J］. Histochem Cell Biol, 2007, 127（1）：109-113.

［15］ Mu H, Ohashi R, Yang H, et al. Thymosin beta10 inhibits cell migration and capillary-like tube formation of human coronary artery endothelial cells［J］. Cell Motil Cytoskeleton, 2006, 63（4）：222-230.

［16］Hall AK. Thymosin beta-10 accelerates apoptosis［J］. Cell Mol Biol Res, 1995, 41（3）：167-180.

［17］Eadie JS, Kim SW, Allen PG, et al. C-terminal variations in betathymosin family members specify functional differences in actinbinding properties［J］. J Cell Biochem, 2000, 77（2）：277-287.

［18］Santelli G, Califano D, Chiappetta G, et al. Advances in thymosin beta10 research：differential expression, molecular mechanisms, and clinical implications in cancer and other conditions［J］. Cancer Invest, 2009, 27（10）：1016-1022.

［19］Xue B, Aguda AH, Robinson RC. Models of the actin-bound forms of the beta-thymosins［J］. Ann N Y Acad Sci, 2007, 1112（1）：56-66.

［20］Lee SH, Zhang W, Choi JJ, et al. Overexpression of the thymosin beta-10 gene in human ovarian cancer cells disrupts F-actin stress fiber and leads to apoptosis［J］. Oncogene, 2001, 20（46）：6700-6706.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Construction and Identification of Recombinant Eukaryotic Plasmid of Sika Deer Thymosin Beta10

WANG Jia-wen GAO Yun-peng SUN Tian-xia LIU Mei-chen ZHAO Yu WANG Si-ming
（Traditional Chinese Medicine and Biotechnology Research and Development Center，Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117）

Tβ10 was discovered to be highly expressed in sika antler in transcriptome sequencing. In order to study the relationship between Tβ10 and the growth and development of antler，the Tβ10 eukaryotic expression vector was constructed. Extracting the total RNA from sika deer antler by Trizol regent，the coding region of Tβ10 gene was amplified by RT-PCR，and then the gene fragment was inserted into the recombinant eukaryotic expression vector VR1012. The eukaryotic expression plasmids were transfected into 293T cells by Fugene 6 agent. The ORF of Tβ10 cDNA was 129 bp，encoding for a protein of 42 amino acids. The eukaryotic expression vector VR1012- Tβ10-HA was constructed successfully. The expression of sika deer Tβ10 was detected in 293T cells by Western blotting. Immunofluorescence demonstrated that the expressed fusion protein of the Tβ10 was located in the cytoplasm in 293T cells.

sika deer；thymosin beta10；plasmid construction；transfection；eukaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1000

2016-11-02

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃（20140622003JC）

王佳雯，女，助理研究員，研究方向：中藥生物技術(shù)；E-mail：wangjiawen1229@163.com

王思明，男，實(shí)驗(yàn)員，研究方向：中藥化學(xué)；E-mail：369257449@qq.com