包琦趙凱段子淵

（1. 中國科學院西北高原生物研究所 高原生物適應與進化重點實驗室 中國科學院西北高原生物研究所 高原魚類進化與功能基因組學實驗室，西寧 810001；2. 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所 遺傳資源中心，北京 100101；3. 中國科學院大學，北京 100049）

豬Btnl5基因的克隆、表達分析及對NF-κB信號通路的調控作用

包琦1，2，3趙凱1段子淵2

（1. 中國科學院西北高原生物研究所 高原生物適應與進化重點實驗室 中國科學院西北高原生物研究所 高原魚類進化與功能基因組學實驗室，西寧 810001；2. 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所 遺傳資源中心，北京 100101；3. 中國科學院大學，北京 100049）

豬類嗜乳脂蛋白5（Btnl5）屬于嗜乳脂蛋白家族，其同源蛋白多為免疫調節(jié)蛋白，為探索Btnl5的序列特征及其功能，利用反轉錄PCR（RT-PCR）和cDNA末端快速擴增（RACE）技術對Btnl5基因cDNA全長進行克隆及序列分析，采用定量PCR技術檢測Btnl5在豬不同組織中的表達豐度，利用報告基因法檢測Btnl5對NF-κB信號通路的影響?？寺〉玫紹tnl5基因cDNA全長共3 334 bp，包含1 680 bp的開放讀碼框，可編碼長度為559個氨基酸殘基的多肽鏈。蛋白結構預測表明Btnl5編碼的蛋白含有信號肽、兩段免疫球蛋白結構域、跨膜結構域和B30.2結構域。定量PCR分析表明，在檢測的11個組織中，Btnl5只在空腸中具有較高水平的表達。報告基因檢測結果顯示Btnl5對NF-κB信號通路有一定的抑制作用。研究結果說明，Btnl5可能通過抑制NF-κB信號通路參與調節(jié)腸道免疫。

豬；類嗜乳脂蛋白5；表達分析；報告基因檢測；核因子κB

嗜乳脂蛋白家族包含嗜乳脂蛋白（Butyrophilin，BTN）、類嗜乳脂蛋白（Butyrophilin-like，BTNL）及Skint（Selection and upkeep of intraepithelial T cells）等成員，屬于免疫球蛋白超家族［1］。首先被發(fā)現(xiàn)的嗜乳脂蛋白是牛嗜乳脂蛋白1A1（Butyrophilin 1A1，BTN1A1），因其可與乳脂結合，控制乳脂分泌而被定義為嗜乳脂蛋白［2，3］。之后的研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)嗜乳脂蛋白基因定位于主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）區(qū)段內［4］，且胞外結構域與B7共刺激分子同源，暗示該類基因可能參與免疫調節(jié)過程［5］。目前針對嗜乳脂蛋白家族的研究主要集中于人和小鼠中［6］。根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫（http://asia.ensembl.org/index.html），人的基因組共包含12個嗜乳脂蛋白基因：BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTN3A3、BTNL2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、ERMAP（紅細胞膜相關蛋白）和MOG（髓鞘少突膠質細胞糖蛋白），其中BTN3A1具有激活γ9δ2 T 細胞的功能［7，8］，BTNL2的剪切突變與結節(jié)病相關［9］，BTNL8可增強T細胞活化［10］，MOG是風疹病毒感染宿主的受體［11］。鼠的基因組中包含18個嗜乳脂蛋白基因：Btn1a1、Btn2a2、Btnl1、Btnl2、Btnl4、Btnl6、Btnl9、Btnl10、ERMAP、MOG和Skint1-Skint8，其中Btn1a1、Btn2-a2和Btnl2具有抑制T細胞活化的功能［12-14］，Skint1可調節(jié)表皮γδT細胞的發(fā)育［15，16］，Btnl1具有抑制腸上皮細胞炎癥因子表達的功能［17］，Btnl1與Btnl6組成異源復合體促進T細胞的增殖［18］。

在豬的基因組中，經Ensembl數(shù)據(jù)庫預測得到14個嗜乳脂蛋白家族基因，但皆缺乏相關的功能研究。其中豬Btnl5位于7號染色體正鏈：28093234-28108144，定位于MHC區(qū)段內。根據(jù)EST數(shù)據(jù)信息，Btnl5基因主要在腸道中表達［19］。研究顯示，同在腸道表達的鼠源Btnl1可抑制炎癥因子KC/CXCL1、MIP1β/CCL4、IL-15和IL-6的表達［17］，推測Btnl1可能通過抑制核因子κB（NF-κB）從而抑制上述炎癥因子的表達［17］。NF-κB是轉錄調控因子，參與多種基因的轉錄調控。在腸道中，模式識別受體識別病原微生物后激活NF-κB，從而激活 IL-1、IL-6和TNFα等細胞因子的分泌，而上述細胞因子可促進NF-κB進一步活化，導致炎癥的放大和持續(xù)［20］。在炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）和腸炎模型中皆伴隨有NF-κB的過度活化［21，22］，因此，NF-κB是腸道炎癥的關鍵調控因子。為探索Btnl5基因的序列特征，以及是否具有與鼠源Btnl1相似的生物學功能，本研究對Btnl5基因cDNA全長進行克隆，并對其序列進行生物信息學分析，進一步檢測該基因在不同組織中的表達水平及其對NF-κB信號通路的影響，旨為研究豬Btnl5基因的功能以及該基因在豬腸道疾病中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取體重均勻，生長狀況良好的1月齡巴馬香豬3頭，屠宰后立即摘取心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、空腸、結腸、大腦、肌肉、胸腺和腸系膜淋巴結保存于液氮中。腸上皮細胞系IPEC-1由中國農業(yè)大學伍國耀老師惠贈。NF-κB啟動子報告基因、MyD88質粒、β-gal質粒、pcDNA3.1-myc-his質粒由本實驗室保存。RNAiso plus、M-MLV反轉錄酶、Prime STAR高保真PCR酶、T-載體PCR產物克隆試劑盒、去除基因組DNA的反轉錄試劑盒、SYBR定量PCR試劑盒、限制性內切酶Xho I、EcoR I購自Takara公司（中國大連）。RLM-RACE試劑盒、胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000購自life公司（美國）。Bright-Glo熒光素酶檢測試劑盒、RNA提取試劑盒購自promega公司（美國）。質粒小提試劑盒、瓊脂糖回收試劑盒購自OMEGA公司（美國）。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參照Ensembl中提供的豬Btnl5預測序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物，擴增Btnl5片段，根據(jù)擴增得到的序列設計5'和3'端基因特異性的RACE引物。根據(jù)定量PCR要求設計Btnl5和內參基因GAPDH的引物。序列分析確定Btnl5的開放讀碼框后，設計包含限制性內切酶位點的上下游引物，將Btnl5的開放讀碼框連入pcDNA3.1-myc-his真核表達載體中。引物由Invitrogen公司合成，引物序列見表1。

1.2.2 Btnl5基因cDNA全長克隆 空腸組織總RNA按照promega RNA提取試劑盒提取，分別使用1%瓊脂糖電泳及紫外分光光度計檢測RNA完整性、純度及濃度?？漳ccDNA第一鏈按照M-MLV反轉錄酶說明書反轉錄獲得，用于Btnl5片段擴增。5'RACE cDNA第一鏈及3'RACE cDNA第一鏈按照RLMRACE試劑盒說明書反轉錄獲得。PCR擴增使用Prime STAR高保真酶，反應體系皆為50 μL：2 × Prime STAR Max Premix 25 μL，上下游引物各1.25 μL，cDNA 2 μL，dd H2O 20.5 μL。Btnl5片段擴增條件：98℃預變性1 min；98℃變性10 s，59℃退火5 s，72℃ 延伸15 s，32個循環(huán)；72℃延伸1 min。5'RACE擴增退火溫度為55℃，其余條件如Btnl5片段擴增。3'RACE擴增以Gene Racer 3'Primer和3'RACE Primer 1為引物擴增16個循環(huán)，PCR產物回收后作為模板以3' RACE Primer 2和3'Nested Primer為引物擴增18個循環(huán)，其他擴增條件如Btnl5片段擴增。所有PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳、瓊脂糖凝膠回收后進行加A反應，與PMD19-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序鑒定。

表1 引物序列信息

1.2.3 生物信息學分析 將測序得到的3段序列使用SeqMan［23］拼接，得到Btnl5基因的cDNA全長。比對Btnl5的cDNA全長序列與基因組序列，得到外顯子、內含子相對位置及長度。使用NCBI的ORF Finder軟 件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測基因的開放讀碼框，并將基因編碼序列翻譯為相應的氨基酸序列。使用pI/Mw網站（http://web. expasy.org/compute_pi/）計算Btnl5蛋白的分子量和理論等電點。使用TMHMM Server v. 2.0（http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）網站預測Btnl5是否為跨膜蛋白。使用SMART網站（http://smart. emblheidelberg.de/）預測Btnl5的結構域及大小。

1.2.4 相對定量PCR 按照RNAiso plus說明書，分別提取心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、空腸、結腸、大腦、肌肉、胸腺及腸系膜淋巴結總RNA，檢測RNA完整性及純度。使用去除基因組DNA的反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。以持家基因GAPDH為內參，對Btnl5 mRNA在各個組織中的表達量進行相對定量分析，引物見表1。定量PCR體系10 μL：SYBR Premix Ex Taq 5 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3.6 μL。定量PCR反應在Bio-Rad CFX96進行，反應程序為：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火/延伸30 s，60℃檢測30 s，40個循環(huán)；65℃-95℃，0.5℃/5 s繪制溶解曲線。每個組織設二次技術重復，相對定量結果采用2-ΔCT法進行計算。

1.2.5 Btnl5-myc真核表達載體的構建 以Btnl5-T載體為模板，以Btnl5-myc-F和Btnl5-myc-R為引物，使用高保真酶擴增Btnl5編碼區(qū)。擴增體系50 μL：2 × Prime STAR Max Premix 25 μL，上下游引物各1.25 μL，模板2 μL，dd H2O 20.5 μL。擴增條件：98℃預變性1 min；98℃變性10 s，59℃退火5 s，72℃ 延伸15 s，32個循環(huán)；72℃延伸1 min。產物經電泳鑒定后進行膠回收，回收產物和pcDNA3.1-myc-his載體分別經Xho I、EcoR I雙酶切后使用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，酶切鑒定并測序鑒定。

1.2.6 細胞培養(yǎng)及轉染 豬腸上皮細胞系IPEC-1培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基（DMEMF/12，10% FBS，青鏈霉素雙抗）中，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。按照每孔5×104個細胞的密度接種于24孔板，待細胞覆蓋率達到70%-80%時，按照Lipofectamine 2000說明書進行轉染，實驗分3組，每組3個復孔。每孔轉染質粒NF-κB 50 ng、β-gal 25 ng，空白對照組同時轉染pcDNA3.1-myc-his 300 ng，MyD88對照組同時轉染MyD88 100 ng、pcDNA3.1-myc-his 200 ng，實驗組同時轉染MyD88 100 ng、Btnl5-myc 200 ng。

1.2.7 熒光素酶報告基因檢測 IPEC-1細胞系轉染24 h后，使用生理鹽水清洗，加入100 μL細胞裂解液（20 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，1% Nonidet P-40，10%甘油，蛋白酶抑制劑，pH 7.5），4℃震蕩裂解細胞30 min，12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清檢測熒光素酶活性及β-gal活性。熒光素酶活性檢測：20 μL蛋白上清與20 μL熒光素酶底物混勻后立即用熒光檢測儀檢測活性。β-gal活性檢測：20 μL蛋白上清、100 μL ONPG加450 μL Z buffer（60 mmol/L Na2HPO4，40 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgSO4，pH 7）顛倒混勻后37℃靜置反應至溶液變黃，加1 mol/L的碳酸鈉200 μL終止反應，酶標儀檢測410 nm處吸收值。熒光素酶活性與β-gal活性比值即為報告基因的表達活性。

2 結果

2.1 Btnl5基因cDNA全長克隆及序列分析

實驗分3段克隆Btnl5全長：5'RACE、Btnl5片段和3' RACE（圖1），5'RACE在750 bp左右有明顯條帶。Btnl5片段在2 000 bp左右有特異性條帶。3' RACE經巢式PCR擴增后在1 000 bp處得到明顯條帶。3段均送多個陽性克隆進行測序鑒定。將測序得到的3段序列拼接得到Btnl5基因cDNA全長共3 334 bp，與基因組序列比對得到11個外顯子，外顯子長度分別為302、144、95、348、282、201、21、27、27、27和1 860 bp（圖2）。經NCBI網站的ORF Finder預測，5'非編碼區(qū)456 bp，3'非編碼區(qū)1 198 bp，開放讀碼框為1 680 bp，編碼559個氨基酸殘基的多肽鏈。pI/Mw網站推算Btnl5蛋白分子量為61.7 kD，理論等電點為5.1。TMHMM Server v. 2.0預測1-247氨基酸為胞外區(qū)，248-270氨基酸為跨膜區(qū)，271-559氨基酸為胞內區(qū)。經SMART預測胞外區(qū)包含信號肽、兩段免疫球蛋白結構域，胞內區(qū)為B30.2結構域（圖3）。

圖1 Btnl5基因cDNA全長的克隆

2.2 定量PCR檢測Btnl5在不同組織的表達水平

定量PCR結果顯示，所檢測的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、空腸、結腸、大腦、肌肉、胸腺及腸系膜淋巴結11種組織中，Btnl5主要表達于空腸，在其余10種組織中表達水平極低（圖4-A）。Btnl5與內參GAPDH PCR產物經2%瓊脂糖電泳顯示，Btnl5與GAPDH擴增條帶在100 bp左右，GAPDH在11個組織中表達相似，Btnl5只在空腸有明顯條帶（圖4-B）。

2.3 Btnl5-myc重組表達質粒的構建與鑒定

以Btnl5-T質粒為模板進行PCR擴增，在2 000 bp處得到單一條帶，與Btnl5編碼區(qū)長度一致（圖5）。回收的PCR產物與pcDNA3.1-myc-his連接的重組質粒經Xho I、EcoR I雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，重組質粒雙酶切產物在5 000 bp和2 000 bp左右有清晰條帶，分別與空載體雙酶切所產生條帶和Btnl5擴增產物大小相同（圖5），且經測序驗證Btnl5插入位置、序列均正確。

2.4 Btnl5-myc重組蛋白對NF-κB信號通路的調控作用

實驗表明，腸上皮細胞系IPEC-1轉染MyD88后，NF-κB信號通路活化，報告基因表達增高，而同時轉染Btnl5時，報告基因表達量降低約50%，差異顯著（P=0.009，圖6）。

圖2 Btnl5基因外顯子、內含子長度及編碼區(qū)相對位置

圖3 預測Btnl5蛋白結構域及各結構域長度

圖4 定量PCR分析豬Btnl5的表達

圖5 Btnl5 ORF擴增和Btnl5-myc表達載體酶切鑒定

圖6 Btnl5抑制NF-κB信號通路

3 討論

目前對嗜乳脂蛋白家族的研究數(shù)據(jù)較少，但普遍認為嗜乳脂蛋白是新的免疫調節(jié)蛋白家族［6，24］。本研究克隆得到豬Btnl5基因cDNA全長共3 334 bp，其中包含456 bp 的5'非編碼區(qū)和1 198 bp的3'非編碼區(qū)，以及1 680 bp的開放讀碼框，編碼559個氨基酸。經軟件預測Btnl5蛋白是一個跨膜蛋白，胞外是兩段免疫球蛋白結構域，胞內是B30.2結構域。含有免疫球蛋白結構域的膜蛋白屬于免疫球蛋白超家族，該類蛋白通過結合目的蛋白參與識別、粘附、信號傳遞等功能［25］。而胞內的B30.2結構域是真核生物中最常見的結構域之一［26］，但其功能目前尚不清楚，Perfetto等分析認為該結構域作為接頭蛋白，與其他蛋白形成蛋白復合體發(fā)揮作用［26］。因此推測Btnl5可能通過與其他蛋白相互結合發(fā)揮功能。

在檢測的11個組織（心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、空腸、結腸、大腦、肌肉、胸腺和腸系膜淋巴結）中，Btnl5僅在空腸檢測到較高表達水平，具有明顯的組織特異性，與EST信息相符［19］。腸道是機體對抗外來入侵的第一道屏障，哺乳動物腸道內含有大量細菌，在腸道內執(zhí)行重要的新陳代謝功能。這些細菌中的多數(shù)在其他組織中會引起強烈的宿主反應，卻能與腸道細胞并存，甚至促進腸道的穩(wěn)定。其機制遠未研究清楚，但越來越清楚的是NF-κB在維持腸道穩(wěn)定方面起到了關鍵性的作用［27］。

本研究發(fā)現(xiàn)Btnl5對MyD88激活的NF-κB信號通路有抑制作用。NF-κB信號通路對細胞存活、腸道緊密連接具有重要作用［28］，同時可通過調控炎癥因子的表達對抗微生物感染，防止致病菌侵入。但過量的炎癥因子會破壞細胞間的緊密連接，致使腸上皮細胞滲透性增加［29］，增加癌癥及自身免疫疾病發(fā)生的風險［30］。為防止NF-κB信號通路過度活化，機體會同時啟動NF-κB的負向調節(jié)。如NF-κB的活化啟動IκBα（Inhibitor of NF-κB）的表達，終止下游基因轉錄［31］；Lawrence等［32］研究發(fā)現(xiàn)，活化的IKKα加速p65的降解；此外，A20亦可負調控NF-κB的表達［33］。通過報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，Btnl5同樣具有抑制NF-κB信號通路的作用，推測Btnl5可能參與NF-κB的負調控過程。但Btnl5對NF-κB下游基因是否具有廣泛的抑制作用及其抑制NF-κB信號通路的機制，還有待進一步研究。

4 結論

克隆了豬Btnl5基因cDNA全長3 334 bp，包含1 680 bp的開放讀碼框，編碼559個氨基酸殘基的多肽鏈。在檢測的11個組織（心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、空腸、結腸、大腦、肌肉、胸腺、腸系膜淋巴結）中，Btnl5只在空腸中具有較高水平的表達，并且具有抑制NF-κB信號通路的作用。

致謝

本研究在實驗和文稿修改過程中得到了中國科學院生物物理研究所李翀研究員及本實驗室許崇鳳、張瑞瑩助理研究員的無私幫助和大力支持，本文工作得到國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973）（2013CB835200）資助，在此深表感謝。

［1］Afrache H, Gouret P, Ainouche S, et al. The butyrophilin（BTN）gene family：from milk fat to the regulation of the immune response［J］. Immunogenetics, 2012, 64（11）：781-794.

［2］Heid HW, Winter S, Bruder G, et al. Butyrophilin, an apical plasma membrane-associated glycoprotein characteristic of lactating mammary glands of diverse species［J］. Biochim Biophys Acta, 1983, 728（2）：228-238.

［3］Jeong J, Rao AU, Xu J, et al. The PRY/SPRY/B30. 2 domain of butyrophilin 1A1（BTN1A1）binds to xanthine oxidoreductase：implications for the function of BTN1A1 in the mammary gland and other tissues［J］. J Biol Chem, 2009, 284（33）：22444-22456.

［4］Rhodes DA, Stammers M, Malcherek G, et al. The cluster of BTN genes in the extended major histocompatibility complex［J］. Genomics, 2001, 71（3）：351-362.

［5］Arnett HA, Viney JL. Immune modulation by butyrophilins［J］. Nature reviews Immunology, 2014, 14（8）：559-569.

［6］ Rhodes DA, Reith W, Trowsdale J. Regulation of Immunity by Butyrophilins［J］. Annu Revi Immunol, 2016, 28（34）：151-172.

［7］Wang H, Morita CT. Sensor function for butyrophilin 3A1 in prenyl pyrophosphate stimulation of human Vgamma2Vdelta2 T cells［J］. Journal of Immunology, 2015, 195（10）：4583-4594.

［8］Sandstrom A, Peigne CM, Leger A, et al. The intracellular B30. 2 domain of butyrophilin 3A1 binds phosphoantigens to mediate activation of human V gamma 9V delta 2T Cells［J］. Immunity, 2014, 40（4）：490-500.

［9］ Valentonyte R, Hampe J, Huse K, et al. Sarcoidosis is associated with a truncating splice site mutation in BTNL2［J］. NatureGenetics, 2005, 37（4）：357-364.

［10］ Chapoval AI, Smithson G, Brunick L, et al. BTNL8, a butyrophilinlike molecule that costimulates the primary immune response［J］. Molecular Immunology, 2013, 56（4）：819-828.

［11］Cong HL, Jiang Y, Tien P. Identification of the myelin oligodendrocyte glycoprotein as a cellular receptor for rubella virus［J］. Journal of Virology, 2011, 85（21）：11038-11047.

［12］Smith IA, Knezevic BR, Ammann JU, et al. BTN1A1, the mammary gland butyrophilin, and BTN2A2 are both inhibitors of T cell activation［J］. J Immunol, 2010, 184（7）：3514-3525.

［13］Sarter K, Leimgruber E, Gobet F, et al. Btn2a2, a T cell immunomodulatory molecule coregulated with MHC class II genes［J］. J Exp Med, 2016, 213（2）：177-187.

［14］Swanson RM, Gavin MA, Escobar SS, et al. Butyrophilin-like 2 modulates B7 costimulation to induce Foxp3 expression and regulatory T cell development in mature T cells［J］. Journal of Immunology, 2013, 190（5）：2027-2035.

［15］Barbee SD, Woodward MJ, Turchinovich G, et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108（8）：3330-3335.

［16］Turchinovich G, Hayday AC. Skint-1 identifies a common molecular mechanism for the development of interferon-gammasecreting versus interleukin-17-secreting gammadelta T cells［J］. Immunity, 2011, 35（1）：59-68.

［17］Bas A, Swamy M, Abeler-Dorner L, et al. Butyrophilin-like 1 encodes an enterocyte protein that selectively regulates functional interactions with T lymphocytes［J］. Proc Natil Acad Sci USA, 2011, 108（11）：4376-4381.

［18］Lebrero-Fernandez C, Bergstrom JH, Pelaseyed T, et al. Murine butyrophilin-like 1 and btnl6 form heteromeric complexes in small intestinal epithelial cells and promote proliferation of local T lymphocytes［J］. Frontiers in Immunology, 2016, 7（12）：1-13.

［19］Gorodkin J, Cirera S, Hedegaard J, et al. Porcine transcriptome analysis based on 97 non-normalized cDNA libraries and assembly of 1, 021, 891 expressed sequence tags［J］. Genome Biology, 2007, 8（4）：90-105.

［20］Jobin C, Sartor R. The I kappa B/NF-kappa B system：a key determinant of mucosal inflammation and protection［J］. Am J Physiol-Cell Physiol, 2000, 278（3）：C451-C462.

［21］Rogler G, Brand K, Vogl D, et al. Nuclear factor kappa B is activated in macrophages and epithelial cells of inflamed intestinal mucosa［J］. Gastroenterology, 1998, 115（2）：357-369.

［22］Schreiber S, Nikolaus S, Hampe J. Activation of nuclear factor kappa B in inflammatory bowel disease［J］. Gut, 1998, 42（4）：477-484.

［23］Swindell SR, Plasterer TN. SEQMAN. Contig assembly［J］. Methods in Molecular Biology, 1997, 70（70）：75-89.

［24］Di Marco Barros R, Roberts NA, Dart RJ, et al. Epithelia use butyrophilin-like molecules to shape organ-specific γδ T cell compartments［J］. Cell, 2016, 167（1）：203-218.

［25］Barclay AN. Membrane proteins with immunoglobulin-like domains - a master superfamily of interaction molecules［J］. Seminars in Immunology, 2003, 15（4）：215-223.

［26］Perfetto L, Gherardini PF, Davey NE, et al. Exploring the diversity of SPRY/B30. 2-mediated interactions［J］. Trends in Biochemical Sciences, 2013, 38（1）：38-46.

［27］Eckmann L, Neish AS. NF-kappa B and Mucosal Homeostasis［J］. Current Topics in Microbiology & Immunology, 2011, 349（349）：145-158.

［28］Peterson LW, Artis D. Intestinal epithelial cells：regulators of barrier function and immune homeostasis［J］. Nature Reviews Immunology, 2014, 14（3）：141-153.

［29］Gitter AH, Bendfeldt K, Schulzke JD, et al. Leaks in the epithelial barrier caused by spontaneous and TNF-alpha-induced single-cell apoptosis［J］. Faseb Journal, 2000, 14（12）：1749-1753.

［30］Karin M, Greten FR. NF-kappaB：linking inflammation and immunity to cancer development and progression［J］. Nature Reviews Immunology, 2005, 5（10）：749-759.

［31］Sun SC, Ganchi PA, Ballard DW, et al. NF-κB controls expression of inhibitor I κB α：evidence for an inducible autoregulatory pathway［J］. Science, 1993, 259（5103）：1912-1915.

［32］Lawrence T, Bebien M, Liu GY, et al. IKKα limits macrophage NF-κB activation and contributes to the resolution of inflammation［J］. Nature, 2005, 434（7037）：1138-1143.

［33］Majumdar I, Paul J. The deubiquitinase A20 in immunopathology of autoimmune diseases［J］. Autoimmunity, 2014, 47（5）：307-319.

（責任編輯 狄艷紅）

Cloning，Expression Analysis and Regulation to NF-κB Pathway of Btnl5 in Porcine

BAO Qi1，2，3ZHAO Kai1DUAN Zi-yuan2
（1. Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota，Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Laboratory of Plateau Fish Evolutionary and Functional Genomics，Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810001；2. Genetic Resource Center，Institute of Genetics and Developmental Biology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101；3. University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049）

Porcine butyrophilin-like 5（Btnl5）belongs to butyrophilin family and most of its homologous proteins are immune regulators. In order to explore the sequence characteristics and function of Btnl5，full-length cDNA of Btnl5 was cloned and characterized by reverse transcription PCR and rapid amplification of cDNA ends（RACE）. Then the mRNA expression abundances of Btnl5 in different tissues were detected using quantitative PCR，and its effect on NF-κB pathway was detected by reporter gene assay. The full length cDNA of Btnl5 was 3 334 bp containing a 1 680 bp open reading frame（ORF）encoding 559 amino acids. Structural analysis showed that this protein was a transmembrane protein，and its extracellular region contained a signal peptide，two immunoglobulin domains，its intracellular region was B30.2 domain. Quantitative PCR analysis showed that Btnl5 transcripts almost exclusively expressed in jejunum among 11 detected tissues. Reporter gene analysis indicated that Btnl5 suppressed the NF-κB pathway. The above results suggest that Btnl5 may involve in intestinal immune regulation through inhibiting NF-κB signaling pathway.

porcine；butyrophilin-like 5；expression analysis；reporter gene assay；nuclear factor κB

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1151

2016-12-20

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（“973”計劃）（2013CB835200）

包琦，女，博士研究生，研究方向：分子生物學；E-mail：baoqi1988@126.com

趙凱，男，研究員，研究方向：功能基因組學；E-mail：zhaokai@nwipb.cas.cn

段子淵，男，研究員，研究方向：分子生物學；E-mail：zyduan@genetics.ac.cn