付晨熙 肖自華 高飛 周宜君

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

干旱脅迫下蒙古沙冬青葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究

付晨熙 肖自華 高飛 周宜君

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

通過對(duì)蒙古沙冬青［Ammopiptanthus mongolicus（Maxim）Cheng. f］葉組織干旱脅迫下蛋白質(zhì)組變化的研究，從蛋白表達(dá)水平闡釋其應(yīng)答干旱脅迫的分子機(jī)制。以20% PEG 6000脅迫處理1 h和72 h，以0 h為對(duì)照，提取葉片總蛋白，利用雙向電泳和質(zhì)譜鑒定技術(shù)分析差異表達(dá)蛋白。共鑒定了40個(gè)差異表達(dá)蛋白，按功能可分為9類：光合作用，ROS清除，蛋白的合成、加工與降解，物質(zhì)運(yùn)輸，防御相關(guān)，RNA加工，氨基酸代謝，其他相關(guān)蛋白和功能未知蛋白質(zhì)。蒙古沙冬青葉片應(yīng)答干旱脅迫的核心是葉綠體結(jié)構(gòu)和光合作用的維持。

蒙古沙冬青；葉片；蛋白質(zhì)組；差異表達(dá)蛋白

干旱已成為遍及全球的氣候問題之一，不同生態(tài)系統(tǒng)下的自然環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)均受到影響，而且有研究預(yù)測(cè)現(xiàn)在的干旱地區(qū)未來會(huì)遭受到更加頻繁的干旱侵害［1］。在自然條件下營(yíng)固著生長(zhǎng)的植物，已進(jìn)化出多種機(jī)制應(yīng)對(duì)干旱脅迫，如瞬時(shí)響應(yīng)土壤水分虧缺或提早開花躲避季節(jié)性干旱［2］。植物在缺水時(shí)，除了生理、生化等方面發(fā)生變化外［3］，分子水平上的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化［4］。近年來，隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究者在組學(xué)水平上研究植物抗逆響應(yīng)機(jī)制［5］。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，能夠反映生命活動(dòng)的本質(zhì)特點(diǎn)，因此蛋白質(zhì)組學(xué)可為研究生命活動(dòng)提供更多信息。研究結(jié)果顯示，干旱脅迫下植物蛋白質(zhì)組的變化與植物物種、基因型和脅迫強(qiáng)度有關(guān)，表現(xiàn)出多樣化的特點(diǎn)，但主要集中在與滲透調(diào)節(jié)、ROS清除、蛋白質(zhì)合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的蛋白方面［6］。

隸屬于豆科沙冬青屬的蒙古沙冬青（A. mongolicus）是阿拉善荒漠地區(qū)特有的建群種［7］。作為第三紀(jì)古熱帶氣候下的孑遺植物和亞洲中部荒漠唯一和特有的常綠闊葉灌木，因其具有耐干旱、耐低溫、耐貧瘠等強(qiáng)抗逆性使其具有很高的科研價(jià)值和生態(tài)價(jià)值［8］。以蒙古沙冬青為材料從分子水平上研究其干旱逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制和抗逆基因篩選已取得了許多重要成果，如構(gòu)建根和葉響應(yīng)干旱的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，鑒定了一批參與干旱調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子［7，10］；克隆抗逆相關(guān)基因研究其功能［11，12］；通過miRNAs研究干旱脅迫下蒙古沙冬青基因調(diào)控特征，鑒定了一批保守的和新的非保守miRNAs等［13］。但是，目前對(duì)于蒙古沙冬青蛋白質(zhì)組學(xué)的研究較少，可能與蛋白質(zhì)提取相對(duì)較難有關(guān)。本研究基于前期建立了蒙古沙冬青根蛋白質(zhì)組雙向電泳體系［14］，以蒙古沙冬青葉片為研究對(duì)象，改進(jìn)研究方法，從蛋白質(zhì)組學(xué)水平研究干旱脅迫下葉片組織的蛋白質(zhì)表達(dá)特點(diǎn)，旨在為探索耐逆植物蒙古沙冬青應(yīng)答干旱脅迫的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料與脅迫處理 蒙古沙冬青（A. mongolicus）種子采自寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市。在蛭石：珍珠巖：營(yíng)養(yǎng)土（2∶2∶1）的混合基質(zhì)中種植，萌發(fā)8周后以20% PEG 6000處理模擬干旱脅迫處理1 h、72 h，以0 h為對(duì)照。取葉片組織速凍于液氮中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑 固相pH梯度線性干膠條（pH 4-7，24 cm）、IPG buffer（pH 3-10）購自GE公司。尿素（Urea）、CHAPS（3-［（3-Cholamidopropyl）dimethylammonio］propanesulfonate）、 二 硫 蘇 糖 醇（Dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（Iodoacetamide，IAA）、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis-Acrylamide）、過硫酸銨（Ammonium persulphate）、四甲基乙二胺（TEMED）、SDS（sodium dodecyl sulfate）、Triton X-100、甘氨酸、PVPP（Polyvinylpyrrolidone）、Trisbase均購自Amresco公司。考馬斯亮藍(lán)R-250（CBB R-250）、AgNO3購自北京普博欣生物科技責(zé)任有限公司，Bradford法蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，4×Tris-HCl（pH 8.8）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白提取與定量 采用改進(jìn)的TCA-丙酮法提取蒙古沙冬青葉片總蛋白質(zhì)［15］。稱取0.3 g葉片組織，加PVPP 50 mg，置液氮中研磨充分。粉末重懸于預(yù)冷的丙酮溶液（含10% W/V TCA，0.07% W/V DTT）中，轉(zhuǎn)入2 mL離心管，-20℃孵育1 h。12 000×g 4℃離心30 min，棄上清，加入相同丙酮溶液充分洗滌多次直至上清液澄清。真空干燥沉淀物，每管加入裂解液（9 mol/L Urea，35 mmol/L Tris，4% W/V CHAPS，1% V/V pH4-7 IPG buffer，1% W/V DTT）400 μL，室溫震蕩混勻30 min，12 000×g常溫離心15 min，取上清液。轉(zhuǎn)入新的離心管后加入其4倍體積的預(yù)冷的丙酮溶液（含0.07% W/V DTT），-20℃孵育2 h，12 000×g常溫離心20 min，棄上清液，干燥沉淀物，重溶于再水化液中（8 mol/L Urea，2% W/V CHAPS，0.5% V/V IPG buffer，20 mmol/L DTT）。采用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量［16］。

1.2.2 雙向電泳 雙向電泳體系為：24 cm IPG膠條水化上樣500 μg，12-15 h后在Ettan IPGphor III上進(jìn)行第一向等點(diǎn)聚焦（Isoelectric focusing，IEF）電泳，程序設(shè)定為：100 V 1 h，500 V 1.5 h，1 500 V 2 h，8 000 V 70 000 Vh，500 V任意時(shí)間。聚焦結(jié)束后，膠條轉(zhuǎn)移至平衡液A（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8，6 mol/L Urea，30% glycerol，2% SDS，0.002% bromophenol blue，1% W/V DTT）中平衡15 min，后轉(zhuǎn)入平衡液B（50 mmol/L Tris-HCl pH8.8，6 mol/L Urea，30% glycerol，2% SDS，0.002% bromophenol blue，4% W/V IAA）中平衡20 min。使用Ettan DALTsix電泳系統(tǒng)，采用厚度為1 mm 12.5% SDSPAGE分離膠進(jìn)行第二向垂直SDS-PAGE電泳。以AgNO3染色法染色［17］。進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)以獲得穩(wěn)定清晰的電泳圖譜。

1.2.3 差異蛋白的篩選 使用UMAX Powerlook 2011XL掃描儀軟件MagicScan V6.0以400 dpi分辨率采集圖像。采用ImageMaster 2D Platinum 7.0（GE Healthcare）軟件進(jìn)行差異點(diǎn)分析，選擇表達(dá)豐度（% Vol）的Ratio值超過1.5倍變化、經(jīng)ANOVA 分析（P＜0.05）且重復(fù)性好的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。

1.2.4 質(zhì)譜分析 從凝膠上挖取差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，委托上海厚基生物科技有限公司進(jìn)行蛋白點(diǎn)MALDI-TOFTOF質(zhì)譜鑒定。樣品經(jīng)膠內(nèi)酶解及Ziptip脫鹽，用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer）進(jìn)行質(zhì)譜分析。一級(jí)質(zhì)譜（MS）掃描范圍為800-4000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）分析，每個(gè)樣品點(diǎn)上選擇8個(gè)母離子，二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）累計(jì)疊加2 500次。

1.2.5 數(shù)據(jù)庫檢索 用Mascot 2.2軟件檢索本課題組建立的蒙古沙冬青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫確定蛋白，搜庫所用的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的基因數(shù)為129 557個(gè)。參 數(shù) 為：Database：mongolicus/ SwissProt；下 載時(shí) 間：2016/8/2；Type of search：Combined（MS+ MS/MS）；Enzyme：Trypsin；Fixed modifications：Carbamidomethyl（C）；Dynamical modifications：Oxidation（M）；Mass values：Monoisotopic；Protein Mass：Unrestricted；Peptide MassTolerance：± 100 ppm；Fragment MassTolerance：± 0.4 Da；Peptide Charge State：1+；Max Missed Cleavages：1。

1.2.6 差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析 進(jìn)一步采用擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR10，以BLAST鑒定所獲得的差異表達(dá)蛋白。用AgriGO進(jìn)行Gene Ontology（GO）注釋和富集分析［18］，用KOBAS進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代謝通路富集分析［19］。對(duì)沒有獲得GO注釋的蛋白，基于文獻(xiàn)搜索和蛋白質(zhì)同源物手動(dòng)注釋。因單一工具分類并不能完全詮釋蛋白質(zhì)的功能，本研究參照Bevan的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行分類［20］。參照Zhao等［21］的方法，采用5種軟 件（YLoc［22，23］、LocTree3［24］、Plant-mPLoc［25］、ngLOC［26］和TargetP［27］）在線預(yù)測(cè)所鑒定蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，只有在至少2個(gè)軟件預(yù)測(cè)一致時(shí)才確定結(jié)果有效。若該方法仍無法確定亞細(xì)胞定位，則根據(jù)GO分析的細(xì)胞組分分析和文獻(xiàn)搜索進(jìn)行預(yù)測(cè)。為了解差異表達(dá)蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，采用STRING v10進(jìn)行protein-protein interaction（PPI）網(wǎng)絡(luò)互作分析［28］，使用Cytoscape 2.8.3對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行編輯［29］。

2 結(jié)果

2.1 蒙古沙冬青葉片干旱脅迫下的雙向電泳圖譜特征

基于前期的生理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果，蒙古沙冬青在干旱脅迫1 h和72 h存在較大的差異，而24 h和72 h結(jié)果具有相似性［9］，故本研究以20% PEG 6000模擬干旱處理蒙古沙冬青，選取1 h及72 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別取2個(gè)處理組以及對(duì)照組（0 h）的葉片進(jìn)行雙向電泳分析。每張雙向電泳凝膠上可檢測(cè)到1 500個(gè)以上清晰可見的蛋白點(diǎn)（圖1），處理組與對(duì)照組相比總體相似，但部分蛋白點(diǎn)的表達(dá)量存在一定差異（圖2）。比較不同處理時(shí)間的蛋白質(zhì)表達(dá)量，有73個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)具有顯著差異（P＜0.05）（圖1）。

1 h處理組與對(duì)照組相比，有28個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生變化：5個(gè)點(diǎn)表達(dá)量增加，23個(gè)點(diǎn)表達(dá)量減少；72 h處理組與對(duì)照組相比，有40個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生變化：24個(gè)點(diǎn)表達(dá)量增加，16個(gè)點(diǎn)表達(dá)量減少；72 h與1 h處理組相比，有56個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，47個(gè)點(diǎn)表達(dá)量增加，9個(gè)點(diǎn)表達(dá)量減少。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共響應(yīng)蛋白點(diǎn)13個(gè)，其中3個(gè)點(diǎn)在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量都增加，7個(gè)點(diǎn)在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量都減少，2個(gè)點(diǎn)先減少再增加，1個(gè)點(diǎn)先增加再減少。

2.2 差異表達(dá)蛋白的鑒定和功能分類

質(zhì)譜分析確定了45個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的身份，涉及40個(gè)差異表達(dá)蛋白。GO功能分類分析表明，獲得的差異表達(dá)蛋白參與的生物過程主要有非生物脅迫應(yīng)答（Response to abiotic stimulus）（GO：0009628）和糖代謝過程（carbohydrate metabolic process）（GO：0005975）；細(xì)胞組分主要有葉綠體（Chloroplast）（GO：0009507）和細(xì)胞質(zhì)部分（Cytoplasmic part）（GO：0044422）；分子功能主要有催化活性（catalytic activity）（GO：0003824）和結(jié)合（binding）（GO：0005488）（圖3）。

KEGG途徑富集分析表明，獲得的差異表達(dá)蛋白主要參與光合作用中的碳固定代謝（ko00710）、氨基酸的生物合成代謝（ko01230）、代謝（ko01100）、次生代謝物合成（ko01110）等途徑，其中僅碳固定代謝途徑具有顯著性差異（P＜0.05），該途徑包括Rubisco大亞基（RBCL）（點(diǎn)14）和磷酸丙糖異構(gòu)酶（TIM）（點(diǎn)9），說明干旱處理下葉片的光合作用受到較大影響。

圖1 蒙古沙冬青葉片蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

圖2 對(duì)照組0 h與處理組1、72 h部分差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)

所鑒定的差異表達(dá)蛋白可分為9類：光合作用（Photosynthesis），ROS清除（ROS scavering），蛋白的合成、加工與降解（Protein synthesis，processing and degradation），物質(zhì)運(yùn)輸（Transport），防御相關(guān)（Defence related），RNA加工（RNA processing），氨基酸代謝（Amino acid metabolism），其他（Other）和功能未知（Unkown function）蛋白質(zhì)（圖4-A，表1）。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，差異表達(dá)蛋白定位于細(xì)胞中的7個(gè)部位：即葉綠體（Chl）、細(xì)胞質(zhì)（Cyt）、線粒體（Mit）、細(xì)胞核（Nuc）、胞外空間（E. S.）、液泡（Vac）和過氧化物酶體（Pox）。此外，1個(gè)蛋白質(zhì)（GLT1）定位在兩個(gè)不同的位點(diǎn)（圖4-B，表1）。

2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)分析

圖3 差異表達(dá)蛋白的GO分析

圖4 蒙古沙冬青葉片差異表達(dá)蛋白功能分類、亞細(xì)胞定位與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

表1 蒙古沙冬青葉片響應(yīng)干旱脅迫差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

續(xù)表

PPI分析結(jié)果顯示，部分表達(dá)差異蛋白構(gòu)成一個(gè)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多中心互作網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)含19個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，有27種互作關(guān)系，各差異表達(dá)蛋白質(zhì)間通過多條通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，相互作用較強(qiáng)的蛋白質(zhì)主要為光合作用、蛋白的合成、加工與降解、ROS清除、氨基酸代謝的相關(guān)蛋白（圖4-C）。

3 討論

植物的葉片組織是植物進(jìn)行光合作用的重要器官。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了干旱脅迫下耐逆植物蒙古沙冬青葉片蛋白表達(dá)特點(diǎn)。對(duì)獲得的45個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)分析表明，干旱脅迫影響了蒙古沙冬青葉片的多個(gè)生物學(xué)過程，其中光合作用受到影響最大，此外ROS清除、蛋白合成、加工與降解等也受到影響。

3.1 光合作用相關(guān)蛋白

葉綠體的光合作用對(duì)植物的生存至關(guān)重要。通過亞細(xì)胞定位確定了14個(gè)差異表達(dá)蛋白（共計(jì)17個(gè)蛋白點(diǎn)）定位于葉綠體中，占所鑒定的差異表達(dá)蛋白的比例最高（35%），其中有5個(gè)光合作用相關(guān)蛋白：光系統(tǒng)II（Photosystem II，PS II）亞基（PSBO2）（點(diǎn)34）、藍(lán)藻同源YCF37（YCF37）（點(diǎn)46）、Rubisco大亞基（RBCL）（點(diǎn)14）、Rubisco活化酶（RCA）（點(diǎn)39，57，60，61）和磷酸丙糖異構(gòu)酶（TIM）（點(diǎn)9）。

PSBO2是高等植物PS II的外周蛋白，具有維持PS II活性的功能［34］，且能結(jié)合GTP作為GTP酶，推測(cè)有類似碳酸酐酶的作用［35］。本研究中PSBO2（點(diǎn)34）在1h略有減少，72 h恢復(fù)并略有提高，表明能夠通過調(diào)整來維持PSII與碳固定活性。YCF37是參與組裝與穩(wěn)定光系統(tǒng)I（PSI）的相關(guān)蛋白［36］，在本研究中顯示持續(xù)上調(diào)表達(dá)，表明干旱脅迫下葉片中的YCF37參與調(diào)控PSI的作用增強(qiáng)，有助于穩(wěn)定光合作用。

Rubisco是光合作用中固定CO2的關(guān)鍵酶。研究表明，干旱脅迫下小麥的 Rubisco合成和穩(wěn)定性受到影響，Rubisco亞基表達(dá)降低［37］。本研究結(jié)果顯示蒙古沙冬青葉片的Rubisco大亞基表達(dá)量1 h下調(diào)后，72 h恢復(fù)到正常水平，說明蒙古沙冬青對(duì)干旱環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。Rubisco活化酶（RCA）可以改變Rubisco的活性［38］，刀豆中的RCA在干旱脅迫后表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)［39］，本研究中有4個(gè)蛋白點(diǎn)為RCA，其中3個(gè)蛋白點(diǎn)1 h脅迫后下調(diào)，72 h恢復(fù)到正常水平；另外1個(gè)蛋白點(diǎn)1 h脅迫后無變化，72 h后表達(dá)量增加，表明干旱脅迫下蒙古沙冬青葉片能夠通過調(diào)控達(dá)到恢復(fù)與提高Rubisco的催化活性，以填補(bǔ)Rubisco受脅迫影響而減少的部分，提高耐受能力。磷酸丙糖異構(gòu)酶（TIM）在葉綠體中負(fù)責(zé)光合過程的碳固定［40］，在干旱脅迫下小麥［41］、楊樹［42］葉片的TIM表達(dá)TIM上調(diào)，本研究的結(jié)果與其相同，干旱脅迫下TIM持續(xù)上調(diào)表達(dá)。上述蛋白點(diǎn)的表達(dá)變化表明干旱脅迫對(duì)蒙古沙冬青葉片的光合作用產(chǎn)生了影響，但其能夠采取積極的應(yīng)答策略以適應(yīng)逆境脅迫。

3.2 ROS清除相關(guān)蛋白

干旱脅迫下產(chǎn)生對(duì)植物有毒害作用的活性氧ROS，必須通過植物抗氧化系統(tǒng)及時(shí)清除［43］。本研究鑒定了3種ROS清除相關(guān)蛋白：烯酮/氧化還原酶（AOR）（點(diǎn)42），硫氧還蛋白（Trx）（點(diǎn)48）和過氧化物酶體膜22 kD（Mpv17 / PMP22）家族蛋白（點(diǎn)43）。所鑒定的AOR和Trx定位于葉綠體中。AOR主要參與活性羰基化合物解毒，保護(hù)PSII組件免受ROS的損害［44］。Trx可清除過氧化氫，在光照條件下通過鐵氧還蛋白-硫氧還蛋白還原酶調(diào)節(jié)光合酶的活性［45］。已有研究顯示，干旱脅迫下甜菜的AOR上調(diào)表達(dá)［46］，而刀豆的Trx下調(diào)表達(dá)［39］，本研究中AOR和Trx在脅迫1 h為下調(diào)表達(dá)，但72 h恢復(fù)到正常水平，表明葉綠體內(nèi)的ROS系統(tǒng)在干旱脅迫下受到影響，并能做出調(diào)整得以恢復(fù)。本研究鑒定的過氧化物酶體膜22 kD（Mpv17 / PMP22）蛋白是完全嵌入過氧化物酶體脂質(zhì)雙層中的完整膜蛋白［47］，該蛋白在干旱脅迫下在1 h略有減少，72 h恢復(fù)并表達(dá)增加，表明過氧化物酶體膜蛋白受到脅迫后可以通過調(diào)整表達(dá)量以穩(wěn)固過氧化物酶體、積極應(yīng)對(duì)干旱脅迫。

3.3 蛋白的合成、加工與降解相關(guān)蛋白

已有研究顯示干旱脅迫增加蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的潛在風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致非功能性蛋白質(zhì)合成［48］。本研究鑒定的差異蛋白中有3類蛋白代謝相關(guān)蛋白，分別屬于蛋白質(zhì)合成、加工和降解相關(guān)蛋白。

40S核糖體蛋白S12-2（40S RPS12-2）（點(diǎn)8）是核糖體小亞基的主要組分，在干旱脅迫下在1h略有減少，72 h恢復(fù)并略有提高，表明脅迫后可以通過調(diào)整穩(wěn)定蛋白合成能力，研究顯示干旱脅迫下刀豆中該蛋白呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)［39］。

所獲得與蛋白質(zhì)加工相關(guān)的蛋白有4個(gè)：伴侶蛋白-60α6CPN60A）（點(diǎn)2），dnaJ相關(guān)伴侶蛋白（點(diǎn)38），類親環(huán)素肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶（PPIase）（點(diǎn)29）和TPR超家族蛋白（點(diǎn)41）。CPN60利用ATP水解幫助新合成、易位或應(yīng)激變性蛋白質(zhì)的折疊［49，50］；dnaJ是Hsp40和類Hsp40蛋白與其配體Hsp70之間相互作用所需的主要結(jié)合位點(diǎn)，Hsp40會(huì)刺激Hsp70水解［51］；PPIases是涉及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和組裝的肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶［52］。本研究結(jié)果顯示，干旱脅迫下蒙古沙冬青葉片中的CPN60A、PPIases、dnaJ皆表現(xiàn)為在1 h處理下表達(dá)量不同程度減少，但處理72 h后都恢復(fù)并表達(dá)提高，表明在干旱脅迫下能夠做出調(diào)整，積極處理脅迫產(chǎn)生的錯(cuò)誤折疊蛋白。干旱脅迫下鷹嘴豆中的PPIases表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)［53］，在西瓜中發(fā)現(xiàn)CPN60A、HSP等伴侶蛋白在干旱脅迫下參與葉綠體的發(fā)育和維持［54］。

本研究中鑒定的降解蛋白質(zhì)的相關(guān)蛋白有4個(gè)：泛素結(jié)合酶13（UBC13）（點(diǎn)55）、泛素延伸蛋白1（UBQ1）（點(diǎn)47）、酪蛋白裂解蛋白酶B3（CLPB3）（點(diǎn)12，33）和蛋白酶DegP 1（DEG1）（點(diǎn)59）。泛素在蛋白降解過程中具有樞紐作用［55］，UBC和UBQ是參與泛素化的關(guān)鍵酶，擬南芥中的UBC能通過促進(jìn)脯氨酸滲透來保護(hù)水分匱缺下的植物［56］，這個(gè)蛋白點(diǎn)未在其他物種的干旱脅迫應(yīng)答中發(fā)現(xiàn)表達(dá)變化，但有報(bào)道參與低溫脅迫，如鷹嘴豆葉片中UBC在低溫脅迫下表現(xiàn)為先上調(diào)后下調(diào)表達(dá)［57］。本研究中UBC和UBQ分布于細(xì)胞核中，干旱脅迫后表達(dá)持續(xù)下調(diào)。DEG1主要參與PSII中清除錯(cuò)誤折疊的蛋白，修復(fù)PSII損傷［58，59］，定位于葉綠體中，本研究中表現(xiàn)為持續(xù)上調(diào)表達(dá)。CLPB3介導(dǎo)類囊體膜的形成，可重塑或拆解錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)復(fù)合體［60］，也定位于葉綠體中，2個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)變化趨勢(shì)相反。而DEG1和CLPB3蛋白未在其他物種的干旱脅迫應(yīng)答中發(fā)現(xiàn)表達(dá)變化，但有報(bào)道顯示大麥中的蛋白酶DEG1［61］、甜菜中的CLPB3通過上調(diào)表達(dá)參與高鹽脅迫應(yīng)答［62］。研究結(jié)果表明蒙古沙冬青葉片中定位于不同部位的降解類蛋白采取不同的模式應(yīng)對(duì)干旱脅迫。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白（點(diǎn)30）在干旱脅迫下持續(xù)顯著上調(diào)表達(dá)，RNA結(jié)合蛋白是控制植物生長(zhǎng)、發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)過程中轉(zhuǎn)錄后RNA代謝的中心調(diào)節(jié)因子，某些RNA結(jié)合蛋白含量增加有助于增強(qiáng)植物對(duì)干旱、低溫等脅迫的耐受性［63］，本研究結(jié)果顯示RNA結(jié)合蛋白在干旱脅迫下顯著上調(diào)，有助于增強(qiáng)蒙古沙冬青干旱耐受性。

3.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)的整體調(diào)控機(jī)制

在PPI調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，具有19個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，其中12個(gè)蛋白質(zhì)定位于葉綠體。干旱脅迫下差異表達(dá)蛋白中，與光反應(yīng)相關(guān)蛋白（PSBO2、YCF37）表達(dá)量普遍上調(diào)，與暗反應(yīng)相關(guān)蛋白R(shí)BCL、RCA、TIM等的表達(dá)發(fā)生了變化。定位于葉綠體中的ROS清除蛋白AOR和Trx、具有蛋白的降解和折疊作用的DEG1等表達(dá)也發(fā)生了變化。說明干旱脅迫影響了葉綠體，其干旱應(yīng)答的核心是葉綠體結(jié)構(gòu)和光合作用的維持。此外，定位在細(xì)胞質(zhì)和其他細(xì)胞器的蛋白表達(dá)也發(fā)生了變化［如谷氨酸合成酶（GLT1）表達(dá)上調(diào)、胞質(zhì)內(nèi)核糖體小亞基40S表達(dá)上調(diào)］，這些蛋白的變化說明蒙古沙冬青葉組織可以通過細(xì)胞中各細(xì)胞器的不同蛋白的協(xié)同變化以應(yīng)對(duì)干旱脅迫。

3.5 干旱脅迫下蒙古沙冬青葉片蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄

組結(jié)果比較

本課題組此前已對(duì)干旱脅迫下蒙沙冬青葉開展了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究［9］，兩者都顯示72 h脅迫比1 h脅迫得到的差異表達(dá)基因/蛋白數(shù)量更多，但基因/蛋白在功能分類上差異較大。蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)有大量蛋白質(zhì)定位于葉綠體中，而轉(zhuǎn)錄組學(xué)并未發(fā)現(xiàn)光合作用相關(guān)基因，且GO分析中細(xì)胞組分結(jié)果也未發(fā)現(xiàn)基因在葉綠體顯著富集。蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果顯示蛋白的合成、加工與降解類蛋白數(shù)目最多，而轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中次生代謝物的生物合成、激素刺激和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的反應(yīng)富集最多。兩種方法在研究結(jié)果上的差異反映研究水平不同，綜合二者獲得的數(shù)據(jù)，可從不同水平、不同角度為蒙古沙冬青抗逆機(jī)制的研究提供依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過20% PEG 6000模擬干旱脅迫、采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了蒙古沙冬青葉片的干旱脅迫響應(yīng)特點(diǎn)，獲得了40個(gè)差異表達(dá)蛋白。結(jié)果顯示，干旱脅迫影響了蒙古沙冬青葉片中部分蛋白的表達(dá)，主要涉及光合作用、ROS清除、蛋白的合成、加工與降解等相關(guān)蛋白。表明蒙古沙冬青葉片能夠通過改變不同功能蛋白的表達(dá)來維持光合作用，以適應(yīng)干旱脅迫。

［1］Gray SB, Brady SM. Plant developmental responses to climate change［J］. Developmental Biology, 2016, 419（1）：64-77.

［2］Basu S, Ramegowda V, Kumar A, et al. Plant adaptation to drought stress［J］. F1000Research, 2016, 5：1554.

［3］Bray EA. Plant responses to water deficit［J］. Trends in Plant Science, 1997, 2（2）：48-54.

［4］Khan MS, Khan MA, Ahmad D. Assessing utilization and environmental risks of important genes in plant abiotic stress tolerance［J］. Frontiers in Plant Science, 2016, 7：792.

［5］Debnath M, Pandey M, Bisen PS. An omics approach to understand the plant abiotic stress［J］. Omics：a Journal Of Integrative Biology, 2011, 15（11）：739-762.

［6］Wang X, Cai X, Xu C, et al. Drought-responsive mechanisms in plant leaves revealed by proteomics［J］. International Journal of Molecular Sciences, 2016, 17（10）：pii：E1706.

［7］劉果厚. 阿拉善荒漠特有植物沙冬青瀕危原因的研究［J］. 植物研究, 1998, 18（3）：341-345.

［8］周宜君, 高飛, 馮金朝, 等. 民族地區(qū)沙冬青種質(zhì)資源保護(hù)與利用［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39（10）：5851-5853.

［9］Gao F, Wang J, Wei S, et al. Transcriptomic analysis of drought stress responses in Ammopiptanthus mongolicus leaves using the RNA-Seq technique［J］. PLoS One, 2015, 10（4）：e0124382.

［10］Wu Y, Wei W, Pang X, et al. Comparative transcriptome profiling of a desert evergreen shrub, Ammopiptanthus mongolicus, in response to drought and cold stresses［J］. BMC Genomics, 2014, 15（1）：1-16.

［11］郭婷, 王茅雁, 董博, 等. 蒙古沙冬青AmDREB2C基因的克隆及表達(dá)分析［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2015, 16（2）：344-348.

［12］李章磊, 高飛, 曹玉震, 等. 蒙古沙冬青AmDREB2. 1基因的克隆及表達(dá)分析［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2015（3）：108-114.

［13］Gao F, Wang N, Li H, et al. Identification of drought-responsive microRNAs and their targets in Ammopiptanthus mongolicus by using high-throughput sequencing［J］. Scientific Reports, 2016, 6：34601.

［14］劉楠, 高飛, 周宜君, 等. 蒙古沙冬青根蛋白的提取及雙向電泳體系的建立［J］. 北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2013, 49（4）：365-368.

［15］Mathesius U, Keijzers G, Natera SHA, et al. Establishment of a root proteome reference map for the model legume Medicago truncatula using the expressed sequence tag database for peptide mass fingerprinting［J］. Proteomics, 2001, 1（11）：1424-1440.

［16］Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］. Analytical Biochemistry, 1976, 72（1-2）：248-254.

［17］Rabilloud T. Silver staining of 2D electrophoresis gels［J］. Quantitative Methods in Proteomics, 2012, 893：61-73.

［18］Du Z, Zhou X, Ling Y, et al. agriGO：a GO analysis toolkit for the agricultural community［J］. Nucleic Acids Research, 2010, 38：W64-W70.

［19］Xie C, Mao X, Huang J, et al. KOBAS 2. 0：a web server for annotation and identification of enriched pathways and diseases［J］. Nucleic Acids Research, 2011, 39：W316-W322.

［20］Bevan M, Bancroft I, Bent E, et al. Analysis of 1. 9 Mb of contiguous sequence from chromosome 4 of Arabidopsis thaliana［J］. Nature, 1998, 391（6666）：485-488.

［21］Zhao Q, Gao J, Suo J, et al. Cytological and proteomic analyses of horsetail（Equisetum arvense L. ）spore germination［J］. Frontiers in Plant Science, 2015, 6：441.

［22］ Briesemeister S, Rahnenführer J, Kohlbacher O. YLoc-an interpretable web server for predicting subcellular localization［J］. Nucleic Acids Research, 2010, 38：W497-W502.

［23］Briesemeister S, Rahnenführer J, Kohlbacher O. Going from where to why-interpretable prediction of protein subcellular localization［J］. Bioinformatics, 2010, 26（9）：1232-1238.

［24］Goldberg T, Hecht M, Hamp T, et al. LocTree3 prediction oflocalization［J］. Nucleic acids research, 2014, 42（W1）：W350-W355.

［25］Chou KC, Shen HB. Plant-mPLoc：a top-down strategy to augment the power for predicting plant protein subcellular localization［J］. PLoS One, 2010, 5（6）：e11335.

［26］King BR, Guda C. ngLOC：an n-gram-based Bayesian method for estimating the subcellular proteomes of eukaryotes［J］. Genome Biology, 2007, 8（5）：1.

［27］Emanuelsson O, Nielsen H, Brunak S, et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence［J］. Journal of Molecular Biology, 2000, 300（4）：1005-1016.

［28］Szklarczyk D, Franceschini A, Wyder S, et al. STRING v10：protein-protein interaction networks, integrated over the tree of life［J］. Nucleic Acids Research, 2014, 43：D447-D452.

［29］Smoot ME, Ono K, Ruscheinski J, et al. Cytoscape 2. 8：new features for data integration and network visualization［J］. Bioinformatics, 2011, 27（3）：431-432.

［30］Bohler S, Sergeant K, Jolivet Y, et al. A physiological and proteomic study of poplar leaves during ozone exposure combined with mild drought［J］. Proteomics, 2013, 13（10-11）：1737-1754.

［31］Wang Y, Yang L, Chen X, et al. Major latex protein-like protein 43（MLP43）functions as a positive regulator during abscisic acid responses and confers drought tolerance in Arabidopsis thaliana［J］. Journal of Experimental Botany, 2015, 67（1）：421-434.

［32］Shu L, Lou Q, Ma C, et al. Genetic, proteomic and metabolic analysis of the regulation of energy storage in rice seedlings in response to drought［J］. Proteomics, 2011, 11（21）：4122-4138.

［33］Zhang S, Chen F, Peng S, et al. Comparative physiological, ultrastructural and proteomic analyses reveal sexual differences in the responses of Populus cathayana under drought stress［J］. Proteomics, 2010, 10（14）：2661-2677.

［34］Offenbacher AR, Polander BC, Barry BA. An intrinsically disordered photosystem II subunit, PsbO, provides a structural template and a sensor of the hydrogen-bonding network in photosynthetic water oxidation［J］. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288（40）：29056-29068.

［35］Bricker T M, Frankel LK. Auxiliary functions of the PsbO, PsbP and PsbQ proteins of higher plant Photosystem II：a critical analysis［J］. Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology, 2011, 104（1）：165-178.

［36］Wilde A, Lünser K, Ossenbühl F, et al. Characterization of the cyanobacterial ycf37：mutation decreases the photosystem I content［J］. Biochemical Journal, 2001, 357（1）：211-216.

［37］Demirevska K, Zasheva D, Dimitrov R, et al. Drought stress effects on Rubisco in wheat：changes in the Rubisco large subunit［J］. Acta Physiologiae Plantarum, 2009, 31（6）：1129-1138.

［38］Ebrahimzadeh H. Drought stress increases the expression of wheat leaf ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxyenase protein［J］. Iranian Journal of Science and Technology（Sciences）, 2006, 30（1）：1-7.

［39］Zadra?nik T, Hollung K, Egge-Jacobsen W, et al. Differential proteomic analysis of drought stress response in leaves of common bean（Phaseolus vulgaris L. ）［J］. Journal of Proteomics, 2012, 78（1）：254-272.

［40］Zaffagnini M, Michelet L, Sciabolini C, et al. High-resolution crystal structure and redox properties of chloroplastic triosephosphate isomerase from Chlamydomonas reinhardtii［J］. Molecular Plant, 2014, 7（1）：101-120.

［41］Budak H, Akpinar B A, Unver T, et al. Proteome changes in wild and modern wheat leaves upon drought stress by two-dimensional electrophoresis and nanoLC-ESI-MS/MS［J］. Plant Molecular Biology, 2013, 83（1）：89-103.

［42］Durand T C, Sergeant K, Renaut J, et al. Poplar under drought：comparison of leaf and cambial proteomic responses［J］. Journal of Proteomics, 2011, 74（8）：1396-1410.

［43］Ye T, Shi H, Wang Y, et al. Contrasting changes caused by drought and submergence stresses in bermudagrass（Cynodon dactylon）［J］. Frontiers in Plant Science, 2015, 6：951.

［44］Yamauchi Y, Hasegawa A, Mizutani M, et al. Chloroplastic NADPH-dependent alkenal/one oxidoreductase contributes to the detoxification of reactive carbonyls produced under oxidative stress［J］. FEBS Letters, 2012, 586（8）：1208-1213.

［45］Schürmann P, Jacquot JP. Plant thioredoxin systems revisited［J］. Annual Review of Plant Biology, 2000, 51（1）：371-400.

［46］Hajheidari M, Abdollahian-Noghabi M, Askari H, et al. Proteome analysis of sugar beet leaves under drought stress［J］. Proteomics, 2005, 5（4）：950-960.

［47］Tugal HB, Pool M, Baker A. Arabidopsis 22-kilodalton peroxisomal membrane protein. Nucleotide sequence analysis and biochemical characterization［J］. Plant Physiology, 1999, 120（1）：309-320.

［48］Ashoub A, Beckhaus T, Berberich T, et al. Comparative analysis of barley leaf proteome as affected by drought stress［J］. Planta, 2013, 237（3）：771-781.

［49］Jiang Q, Mei J, Gong XD, et al. Importance of the rice TCD9 encoding α subunit of chaperonin protein 60（Cpn60α）for the chloroplast development during the early leaf stage［J］. Plant Science, 2014, 215-216：172-179.

［50］Dickson R, Weiss C, Howard RJ, et al. Reconstitution of higher plant chloroplast chaperonin 60 tetradecamers active in protein folding［J］. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275（16）：11829-11835.

［51］Hennessy F, Nicoll W S, Zimmermann R, et al. Not all J domains are created equal：implications for the specificity of Hsp40-Hsp70 interactions［J］. Protein Science, 2005, 14（7）：1697-1709.

［52］Weisman R, Creanor J, Fantes P. A multicopy suppressor of a cell cycle defect in S. pombe encodes a heat shock-inducible 40 kDa cyclophilin-like protein［J］. Embo Journal, 1996, 15（3）：447-456.

［53］Bhushan D, Pandey A, Choudhary MK, Datta A, Chakraborty S, Chakraborty N. Comparative proteomics analysis of differentially expressed proteins in chickpea extracellular matrix during dehydration stress［J］. Mol Cell Proteomics 2007, 6：1868-1884.

［54］Akashi K, Yoshida K, Kuwano M, et al. Dynamic changes in the leaf proteome of a C3 xerophyte, Citrullus lanatus（wild watermelon）, in response to water deficit［J］. Planta, 2011, 233（5）：947-960.

［55］王彥杰, 張超, 王曉慶, 等. 牡丹泛素延伸蛋白基因片段克隆與表達(dá)分析［J］. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版, 2013（1）：79-83.

［56］Wan X, Mo A, Liu S, et al. Constitutive expression of a peanut ubiquitin-conjugating enzyme gene in Arabidopsis confers improved water-stress tolerance through regulation of stress-responsive gene expression［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2011, 111（4）：478-484.

［57］Heidarvand L, Maaliamiri R. Physio-biochemical and proteome analysis of chickpea in early phases of cold stress［J］. Journal of Plant Physiology, 2013, 170（5）：459-469.

［58］Krojer T, Sawa J, Sch?fer E, et al. Structural basis for the regulated protease and chaperone function of DegP［J］. Nature, 2008, 453（7197）：885-890.

［59］Hau ühl K, Andersson B, Adamska I. A chloroplast DegP2 protease performs the primary cleavage of the photodamaged D1 protein in plant photosystem II［J］. The EMBO Journal, 2001, 20（4）：713-722.

［60］Lee U, Rioflorido I, Hong SW, et al. The Arabidopsis ClpB/Hsp100 family of proteins：chaperones for stress and chloroplast development［J］. The Plant Journal, 2007, 49（1）：115-127.

［61］Wu D, Shen Q, Qiu L, et al. Identification of proteins associated with ion homeostasis and salt tolerance in barley［J］. Proteomics, 2014, 14（11）：1381-1392.

［62］Yang L, Zhang Y, Zhu N, et al. Proteomic analysis of salt tolerance in sugar beet monosomic addition line M14［J］. Journal of Proteome Research, 2013, 12（11）：4931-4950.

［63］Lee K, Kang H. Emerging roles of RNA-binding proteins in plant growth, development, and stress responses［J］. Molecules & Cells, 2016, 39（3）：179-185.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Proteomics Analysis of Ammopiptanthus mongolicus Leaves Under Drought Stress

FU Chen-xi XIAO Zi-hua GAO Fei ZHOU Yi-jun
（College of Life and Environmental Sciences，Minzu University of China，Beijing 100081）

The aim of the present study is to reveal the proteomic variation of Ammopiptanthus mongolicus（Maxim）Cheng. f leaves under drought stress. The plants were exposed to 20% PEG 6000 for 1 and 72 h，and 0 h as control. The extracted leaves proteins of the treatment and the control were analyzed by two-dimensional electrophoresis（2-DE），and the differentially expressed proteins were identified by MALDI-TOF-TOF. In total，40 differentially expressed proteins were detected. These identified proteins were mainly involved in photosynthesis，ROS scavenging，protein synthesis，processing and degradation，transport，defense related，RNA processing，amino acid metabolism，other and unknown function. Conclusively，the key of A. mongolicus response to drought stress was the maintenance of structure and photosynthesis of chloroplasts.

Ammopiptanthus mongolicus；leaf；proteome；differentially expressed proteins

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0012

2017-01-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370356，31670335），建設(shè)世界一流大學(xué)（學(xué)科）和特色發(fā)展引導(dǎo)專項(xiàng)資金（YDZXXK201619，2015MDTD08C），中央民族大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（2015）

付晨熙，女，博士，研究方向：植物抗逆分子生物學(xué)；E-mail：fcx0214@muc.edu.cn

周宜君，女，博士，教授，研究方向：植物抗逆分子生物學(xué)；E-mail：queenzhou@263.net