李艷美，粟有志，李芳，雷紅琴，袁小雯，張凱麗，楊潔

1(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830046)2(伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆 伊寧，835000)

QuEChERS前處理高效液相色譜法同時測定酵母產(chǎn)品中7種合成酚類抗氧化劑

李艷美1,2，粟有志2，李芳2，雷紅琴2，袁小雯2，張凱麗2，楊潔1*

1(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830046)2(伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆 伊寧，835000)

建立了QuEChERS-HPLC同時定量測定酵母中的沒食子酸(GA)、沒食子酸丙酯(PG)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、沒食子酸異戊酯(IAG)、沒食子酸辛酯(OG)、沒食子酸十二酯(DG)和二丁基羥基甲苯(BHT)7種合成酚類抗氧化劑(SPAs)的分析方法。樣品用乙腈提取，經(jīng)PCX粉凈化，以JADE-PAK C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)分離，采用1%乙酸水溶液和甲醇為流動相梯度洗脫，二極管陣列檢測器(DAD)檢測，結(jié)合保留時間和紫外光譜進(jìn)行定性分析，定量波長280 nm。7種合成酚類抗氧化劑(SPAs)在各自的范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.994，定量限(LOD，S/N=10)為1～10 mg/kg；3個加標(biāo)水平(1、2、10倍定量限)下，活性干酵母和酵母抽提物中回收率分別在79.7 %～102.4 %和79.3 %～107.4 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別在2.5 %～8.7 %和2.7 %～9.6 %。該方法準(zhǔn)確快速、靈敏度高，適用于酵母產(chǎn)品中7種合成酚類抗氧化劑(SPAs)的同時測定。

合成酚類抗氧化劑；酵母產(chǎn)品；高效液相色譜法；QuEChERS

酵母產(chǎn)品是以糖蜜、淀粉類為碳源，添加氮源、磷源等酵母細(xì)胞生長繁殖所需要的營養(yǎng)素，經(jīng)培養(yǎng)、分離、過濾、干燥等工序制成[1]。具有發(fā)酵、改善風(fēng)味、增加營養(yǎng)價值等作用，廣泛用于釀造啤酒、制藥、制茶、飼料加工等行業(yè)。在酵母生產(chǎn)中應(yīng)用合成酚類抗氧化劑(synthetic phenolic antioxidants,SPAs)，以減少儲存過程中因細(xì)胞成分被氧化而造成的活性損失[2]?；瘜W(xué)合成抗氧化劑會對人體造成不同程度的潛在危害[3-5]，許多國家對其添加量加以限制或明確規(guī)定其添加量[6-7]。目前，抗氧化劑的檢測樣品主要集中在食用油脂、含油脂食品及動物飼料中[8-11]，未見檢測酵母產(chǎn)品的報(bào)道。為防止不法廠家超范圍、超限量使用合成酚類抗氧化劑，建立一種快速、靈敏的分析酵母產(chǎn)品中合成酚類抗氧化劑的方法是十分必要的。

合成酚類抗氧化劑檢測標(biāo)準(zhǔn)[12-15]和方法很多，薄層色譜法[16]和比色法[12]檢驗(yàn)步驟復(fù)雜，檢出限高；較準(zhǔn)確分析抗氧化劑含量的方法主要是氣相色譜法[11-12,14,19]、液相色譜法[13,15,20]、氣相質(zhì)譜法[9,18]、液相質(zhì)譜法[10,15,17]等，而氣相色譜法和氣相質(zhì)譜法需要大量的有機(jī)溶劑；液相質(zhì)譜法檢測成本高，儀器價格昂貴。這些檢測方法的前處理既耗時又費(fèi)力，本研究采用以快速、簡單、廉價、高效、耐用、安全著稱的QuEChERS 樣品前處理技術(shù)[21-23]， 結(jié)合液相色譜，用二極管陣列檢測器檢測酵母產(chǎn)品中7種合成酚類抗氧化劑(SPAs)，該方法準(zhǔn)確快速、靈敏度高，檢測效率高，為酵母產(chǎn)品中合成酚類抗氧化劑的檢測提供了實(shí)用的技術(shù)手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(配有二極管陣列檢測器、自動進(jìn)樣器、色譜工作站)，美國Agilent公司；Sigma3-18K臺式冷凍離心機(jī)，Sigma公司；EYELA MMV-1000W振蕩器，東京理化公司；SK8210LHC超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；N-EVAP-112水浴氮吹儀，Organomation公司；MiIIi-Q Advangtage A10 超純水系統(tǒng)，Millipore公司；MS3型渦旋振蕩器，IKA公司。

沒食子酸(gallic acid，GA，純度97.8%)，沒食子酸丙酯(propyl gallate，PG，純度99.9%)，叔丁基對苯二酚(tertiary butylhydroquinone，TBHQ，純度97.5%)，沒食子酸異戊酯(isoamyl gallate，IAG，純度98%)，沒食子酸十二酯(dodecyl gallate，DG，純度98%)，二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT，純度99.0%)標(biāo)準(zhǔn)品(均為固體)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；沒食子酸辛酯(octyl gallate，OG，純度99.52%)，上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司；乙睛、甲醇、丙酮、甲酸和正己烷均為色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司；冰乙酸(優(yōu)級純)試驗(yàn)用水為Milli-Q超純水(符合GB/T 6682-2008一級水要求)；酸性氧化鋁(ALA)，振翔公司；硫酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)、C18粉、N-丙基乙二胺(PSA)、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)、石墨化炭黑(GCB)、氨基(NH2)均購自Agela公司；分析樣品為實(shí)驗(yàn)室送檢和市售樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

分別準(zhǔn)確稱取沒食子酸(GA)、沒食子酸丙酯(PG)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、沒食子酸異戊酯(IAG)、沒食子酸辛酯(OG)、沒食子酸十二酯(DG)和二丁基羥基甲苯(BHT)7種標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg(精確到0.000 1 g)于10 mL容量瓶內(nèi)，用甲醇定容至刻度線，配置成質(zhì)量濃度為10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，轉(zhuǎn)移至12 mL棕色小瓶內(nèi)，儲存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)液的制備

根據(jù)不同合成酚類抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的響應(yīng)靈敏度，確定其在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中質(zhì)量濃度，用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各抗氧化劑的最終濃度如下：沒食子酸辛酯(OG)、沒食子酸丙酯(PG)、沒食子酸(GA)為250 mg/L；沒食子酸十二酯(DG)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)為500 mg/L；沒食子酸異戊酯(IAG)為100 mg/L；二丁基羥基甲苯(BHT)為1 000 mg/L。

1.3 樣品前處理

稱取1 g樣品(精確到0.01 g)于具塞離心管，加入10 mL乙腈，2 500 r/min充分渦旋振蕩3min，加入2 g NaCl，2 500 r/min渦旋振蕩1 min，超聲2 min。置于離心機(jī)8 000 r/min離心5 min，取2 mL乙腈層于具塞離心管中，加入吸附劑PCX 0.1 g，渦旋振蕩1 min，置于離心機(jī)8 000 r/min離心5 min，取上清液至于玻璃試管中，常溫水浴氮吹至干，用1 mL甲醇溶解殘?jiān)^0.22 微孔濾膜過濾，濾液待測。

1.4 儀器條件

色譜柱：JADE-PAK C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：A相為1 %乙酸水溶液，B相為甲醇，梯度洗脫(見表1)；流速：0.800 mL/min；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：2 μL；運(yùn)行時間：15 min。

表1 梯度洗脫表

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

將本實(shí)驗(yàn)中檢測的7種SPAs配制的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用二極管陣列檢測器在190 nm～400 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描。其中分子結(jié)構(gòu)式相似的沒食子酸型抗氧化劑(GA、PG、IAG、OG、DG)，均含有的3個羥基苯環(huán)提供了主要的紫外特征吸收，致使這5種沒食子酸型抗氧化劑的波長掃描圖相似，最大吸收波長接近，且均在272～274 nm，而另外2種抗氧化劑(TBHQ、BHT)最大吸收波長分別為290 nm、278 nm。綜合考慮，選擇波長為280 nm作為7種SPAs的最佳檢測波長。圖1為7種SPAs的混合標(biāo)液在280 nm的波長下進(jìn)行梯度洗脫后所得到的色譜圖。

1-GA；2-PG；3-TBHQ；4-IAG；5-OG；6-DG；7-BHT圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the mixed standard solution

2.2 提取溶劑的選擇

比較了極性試劑水、乙腈、甲醇、乙腈-甲醇(1∶1v/v)、水-甲醇(1∶1,v/v)、水-乙腈(1∶1,v/v)對7種SPAs的提取效果。圖2為不同溶劑提取7種SPAs的回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水做提取劑時，對DG的提取效果不理想；甲醇和1∶1 乙腈水溶液做提取劑時，對GA的提取回收率也只有30%左右；雖然1∶1 甲醇水溶液做提取劑時回收率較集中在68%～88%；而乙腈做提取劑時，7種SPAs的回收率均>90%，滿足檢測要求。綜合考慮，選取乙腈作為提取劑。

1-GA；2-PG；3-TBHQ；4-IAG；5-OG；6-DG；7-BHT圖2 不同溶劑提取SPAs的回收率Fig.2 Recoveries of SPAs extracted by different solvents

2.3 凈化條件的選擇

QuEChERS前處理凈化過程包括干擾目標(biāo)分析物雜質(zhì)的去除以及影響回收率酵母產(chǎn)品基質(zhì)的去除，比較了酸性氧化鋁(ALA)、硫酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)、C18粉、N-丙基乙二胺(PSA)、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)、石墨化炭黑(GCB)、氨基(NH2)7種吸附劑對樣品的凈化效果。圖3為不同吸附劑對7種SPAs的凈化回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用ALA凈化時，對沒食子酸型抗氧化劑(GA、PG、IAG、OG、DG)無回收；PEP和NH2為凈化劑時，沒食子酸回收率為零，有部分抗氧化劑的回收率達(dá)不到檢測要求；而GCB為凈化劑時，對長鏈沒食子酸酯類(沒食子酸辛酯和沒食子酸月桂酯)吸附過強(qiáng)，回收率為零，且部分抗氧化劑的回收率較低；PSA和C18凈化劑吸附樣品基質(zhì)同時也吸附酚類抗氧化劑，從而導(dǎo)致目標(biāo)物回收率低，部分抗氧化劑的回收率只有40%～55%；PCX凈化時7種目標(biāo)物的影響最小，回收率較高。圖4(A)中a為未加凈化劑的活性干酵母樣品圖譜，c為加入C18凈化劑的活性干酵母樣品圖譜，去除干擾目標(biāo)峰的雜質(zhì)不明顯，b為加入PCX凈化劑的活性干酵母樣品圖譜，使樣品基線噪音明顯降低，尤其是對影響GA、PG出峰的雜質(zhì)凈化較好，因PCX屬于陽離子聚合物，具有離子交換與反相保留雙重保留模式，有機(jī)提取溶液乙腈沉淀了樣品中的蛋白，PCX又對樣品中堿性基質(zhì)化合物的吸附較強(qiáng)，從而使樣品提取液較為清澈，降低樣品基質(zhì)干擾。實(shí)驗(yàn)還考察了PCX加入量50 、100、200、300 mg對凈化效果的影響，發(fā)現(xiàn)PCX加入量100 mg時，去除酵母產(chǎn)品中的雜質(zhì)峰較好，因此，選用0.1 g PCX作為樣品前處理時的吸附劑。

1-GA；2-PG；3-TBHQ；4-IAG；5-OG；6-DG；7-BHT圖3 不同吸附劑對7種SPAs的凈化回收率Fig.3 Purification effect of 7 SPAs with different adsorbent

a-未加凈化劑;b-加入PCX凈化劑;c-加入C18凈化劑；1-GA；2-PG；3-TBHQ；4-IAG；5-OG；6-DG；7-BHT圖4 活性干酵母樣品(A)及加標(biāo)活性干酵母樣品(B)的色譜圖Fig.4 Chromatograms of active dry yeast(A)and spiked active dry yeast sample(B)

2.4 線性參數(shù)、檢出限和定量限

按照表2的線性范圍濃度配置混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。以峰面積(y)對合成酚類抗氧化劑的質(zhì)量濃度(x)作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，7種SPAs各自的線性范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.994。方法的檢出限(S/N>3)在0.3～3 mg/kg，定量限(S/N>10)在1～10 mg/kg。7種SPAs的線性參數(shù)、檢出限和定量限詳見表2。

2.5 方法準(zhǔn)確度與精密度

選取活性干酵母、酵母抽提物為空白樣品，以1、2、10倍LOQ為加標(biāo)水平進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。按照本文進(jìn)行樣品前處理和儀器條件測定，每一樣品重復(fù)測定6次，其回收率詳見表3。結(jié)果表明，活性干酵母中7種SPAs的回收率為79.7 %～102.4 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.5 %～8.7 %；酵母抽提物中7種SPAs的回收率為79.3 %～107.4 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.7 %～9.6 %。表明該方法的準(zhǔn)確度高，通用性好。圖4為活性干酵母樣品及加標(biāo)活性干酵母樣品的色譜圖。

表2 7種SPAs的線性參數(shù)、檢出限和定量限

表3 不同基質(zhì)中7種SPAs的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.6 樣品測量

利用本方法對樣品(活性干酵母、酵母抽提物)進(jìn)行7種酚類抗氧化劑含量的檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品中均未檢測出目標(biāo)分析物。

3 結(jié)論

建立了以乙腈為提取劑，經(jīng)PCX粉凈化，高效液相色譜二極管陣列檢測器測定酵母產(chǎn)品中7種SPAs的檢測方法。對酵母抽提物和活性干酵母粉進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，該方法操作簡便、快速、節(jié)省溶劑、加標(biāo)回收率良好、方法穩(wěn)定，回收率高，能有效降低基質(zhì)干擾，可為酵母產(chǎn)品中此類物質(zhì)的風(fēng)險監(jiān)控提供可靠的技術(shù)支持。

[1] 酵母產(chǎn)品分類導(dǎo)則：GB/T 32099—2015[S].

[2] 劉緒斌,武運(yùn),孟茹.酵母生產(chǎn)技術(shù)及安全性檢測分析[M].北京:中國質(zhì)檢出版社,2014:114-118.

[3] XUE H,XING Y,YIN Y, et al.Application of an enzyme immunoassay for the quantitative determination of azo dye (Orange II) in food products[J].Food Additives & Contaminants Part A Chemistry Analysis Control Exposure & Risk Assessment,2012, 29(12):1 840-1 848.

[4] Kashanian S,Dolatabadi J E N.DNA binding studies of 2- tert -butylhydroquinone (TBHQ) food additive[J].Food Chemistry,2009, 116(3):743-747.

[5] Okubo T,Yokoyama Y,Kano K,et al Cell death induced by the phenolic antioxidant tert-butylhydroquinone and its metabolite tert-butylquinone in human monocytic leukemia U937 cells[J].Food & Chemical Toxicology,2003,41(5):679-688.

[6] 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)：GB2760—2014[S].

[7] General Standard For Food Additives:CXS 192—2014[S].

[8] 張雪飛,李昊力,李家林.油脂中抗氧化劑的分析檢測方法研究進(jìn)展[J].廣東化工,2016,43(13):112-113.

[9] 李東剛,李春娟,劉敬東.GC-MS-SIM檢測糕點(diǎn)中的防腐劑和抗氧化劑[J].分析儀器,2009(4):56-60.

[10] 林安清,張曼,唐丹舟,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測飼料中多種抗氧化劑[J].分析測試學(xué)報(bào),2007:26(Z1)：278-280.

[11] 黃錦燕, 張全美, 王守卿,等. 采用甲醇提取-氣相色譜法檢測食用油中兩種抗氧化劑的研究[J]. 化學(xué)分析計(jì)量, 2011, 20(5):89-91.

[12] 食品中叔丁基羥基茴香醚(BHA)與2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)的測定：GB/T 5009.30—2003[S].

[13] 出口油脂中抗氧化劑的測定 高效液相色譜法：SN/T 1050—2014[S].

[14] 食品中抗氧化劑丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)與特丁基對苯二酚(TBHQ)的測定：GB/T 23373—2009[S].

[15] 出口食品中多種抗氧化劑的測定：SN/T 3849—2014[S].

[16] MIRZAIE A,JAMSHIDI A,HUSAIN S W,et al.TLC quantification of methylparaben on an inorganic ion-exchanger in the presence of other food additives[J].Jpc Journal of Planar Chromatography Modern Tlc,2007,20(2):141-143.

[17] 凌云,儲曉剛,張峰,等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定調(diào)味料中的17種防腐劑和抗氧化劑[J].色譜,2011,29(8):723-730.

[18] 邢寒竹,王霞,陳相峰,等.分散液液微萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速分析食用油中的酚類抗氧化劑[J].分析化學(xué), 2015(3):409-413.

[19] YANG M H,LIN H J,CHOONG Y M.A rapid gas chromatographic method for direct determination of BHA, BHT and TBHQ in edible oils and fats[J].Food Research International,2002,35(7):627-633.

[20] SAAD B,YONG Y S,NAWI M A,et al.Determination of synthetic phenolic antioxidants in food items using reversed-phase HPLC[J]. Food Chemistry,2007,105(1):389-394.

[21] 粟有志,李芳,齊鑫,等.QuEChERS-高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中9種新煙堿類殺蟲劑殘留[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2015, 31(2):203-207

[22] LEHOTAY S J,SON K A,KWON H,et al.Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables [J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(16):2 548-2 560.

[23] HE Z, LU W,YI P,et al.Multiresidue analysis of over 200 pesticides in cereals using a QuEChERS and gas chromatography-tandem mass spectrometry-based method[J].Food Chemistry,2015,169:372-380.

Simultaneous determination of 7 synthetic phenolic antioxidants in yeast products using QuEChERS sample preparation and high performance liquid chromatography

LI Yan-mei1, 2, SU You-zhi2, LI Fang2, LEI Hong-qin2, YUAN Xiao-wen2,ZHANG Kai-li2, YANG Jie1*

1(College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046,China)2(Comprehensive Technical Service Centre of Yili Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yining 835000，China)

A method was developed for the simultaneous determination of 7 synthetic phenolic antioxidants(SPAs), including gallic acid(GA),propyl gallate(PG),tertiary butylhydroquinone(TBHQ),isoamyl gallate(IAG),octyl gallate(OG),dodecyl gallate(DG) and butylated hydroxytoluene(BHT), in yeast products by using high performance liquid chromatographic (HPLC) method. The yeast products was extracted with acetonitrile and then cleaned up by PCX. The separation of analytes was performed on a JADE-PAK C18column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) by gradient elution using 1% aqueous acetic acid solution and methanol as mobile phase. The sample was separated and detected with photodiode array detector (DAD). The qualification analysis was performed by using retention time and UV spectrum, and the quantification analysis was based on the detection wavelength of 280 nm. The calibration curves showed good linearity for seven synthetic phenolic antioxidants (SPAs), and the correlation coefficients (r2) were higher than 0.994. The limits of quantification (LOQs, S/N>10) were in the range of 1-10 mg/kg. The average recoveries were in the range of 79.7 %-102.4 % and 79.3 %-107.4 % for seven antioxidants respectively in active dry yeast and yeast extract, with the relative standard deviations (RSDs) of 2.5 %-8.7 % and 2.7 %-9.6 % at the spiked levels of 1,2,10 LOQ. The method is accurate, rapid and sensitive, and suitable for monitoring of seven synthetic phenolic antioxidants (SPAs) in yeast products.

synthetic phenolic antioxidants(SPAs);yeast products; high performance liquid chromatography(HPLC);QuEChERS

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705032

碩士，工程師(楊潔教授為通訊作者,E-mail：1670330098@qq.com)。

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016IK266)

2016-10-26，改回日期：2017-01-26