施思，彭智輔，喬宗偉,2，劉多濤，羅青春，涂福明

1(五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644007)2(固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644007)

濃香型大曲貯藏過程中糖化力發(fā)酵力變化及真菌多樣性分析

施思1*，彭智輔1，喬宗偉1,2，劉多濤1，羅青春1，涂福明1

1(五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644007)2(固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644007)

為了探究大曲貯藏過程中微生物群落結構變化，采用高通量測序技術分析了真菌18S rDNA V4區(qū)，聚類分析共產(chǎn)生3 747個OTU分類。結果表明，在貯藏過程中大曲真菌群落結構不斷調整，畢赤酵母屬、根霉菌屬及橫梗霉屬成為最終的優(yōu)勢菌群。隨著時間的推移，大曲發(fā)酵力逐漸升高，而糖化力則經(jīng)歷了由高變低再升高的過程。數(shù)據(jù)結果與大曲質量要求相符，能為后續(xù)釀造提供足夠動力。

大曲；儲藏；真菌多樣性；理化指標

在我國傳統(tǒng)釀酒行業(yè)一直流傳著“曲乃酒之骨”的說法，曲藥既是釀酒的糖化發(fā)酵劑，又是釀酒的重要原料，同時為釀酒提供部分風味物質或風味前體物質，對白酒的香型風格有著舉足輕重的作用。五糧液作為中國濃香型白酒的典型代表，采用了獨特的“包包曲”制曲工藝，以小麥為原料，經(jīng)粉碎、加水拌合壓制而成，天然接種，多微共酵。

作為中國傳統(tǒng)釀造的濃香型白酒大曲，其微生物菌群的豐富度不言而喻，微生物的生長代謝也決定著大曲品質的優(yōu)良。近年來，隨著測序技術的迅猛發(fā)展，廣大科研工作者為了更加全面的認識曲藥微生物，采用免培養(yǎng)技術做了大量研究。梁晨等人采用Mi Seq測序方法研究了大曲貯存過程中原核微生物群落結構演替規(guī)律，共得到3 710個OTUs，指出乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、高溫放線菌屬、乳球菌屬等是大曲中的優(yōu)勢菌群[1]；高亦豹等人利用PCR-DGGE技術對江蘇北部某酒廠高溫和中溫大曲細菌菌群結構進行了分析，檢測到了傳統(tǒng)方法未能分離鑒定的Staphylococcusxylosus、Klebsiellaoxytoca[2]。另外，孟鎮(zhèn)等人運用DGGE技術及條帶測序解析了山東某酒廠濃香型白酒大曲的細菌菌群，其結果顯示了該酒廠大曲中細菌主要屬于厚壁菌門[3]；羅惠波等人利用PCR-SSCP技術對瀘州老窖大曲發(fā)酵過程中原核微生物菌群結構進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)大曲發(fā)酵溫度的變化對原核微生物多樣性影響較小，而發(fā)酵后期的濕度、水分可能是造成原核微生物多樣性改變的重要原因[4]。大量研究結果表明，免培養(yǎng)方法檢測大曲微生物組成更為直觀、高效和全面。

綜合濃香型大曲微生物研究現(xiàn)狀和研究手段可知，利用高通量測序技術對真菌微生物的研究相對較少，而大曲作為糖化發(fā)酵劑，糖化力和發(fā)酵力是衡量大曲質量的重要指標，與之相關的微生物更是研究熱點。而大曲在投入生產(chǎn)前會經(jīng)過長達數(shù)月的儲存過程，期間發(fā)生多種生化反應，使得微生物區(qū)系結構、酶系結構、物系結構都會發(fā)生重大變化，是重要的后熟過程，對最終曲藥質量產(chǎn)生重要影響，也很有必要對其進行深入研究。因此本研究選取儲藏期大曲樣本進行針對18S rDNA V4區(qū)高通量測序，并跟蹤檢測其糖化力發(fā)酵力變化規(guī)律，一方面可以了解大曲微生物菌群的基本構成和豐度變化，弄清微生物多樣性的構成差異與不同大曲質量的相關關系，另一方面，研究結果可以為更好地理解大曲貯藏的科學必要性提供一些參考數(shù)據(jù)及新的思路。

1 材料與方法

1.1 曲樣

選取五糧液制曲車間某一陳化曲庫，在其儲存過程中進行定點跟蹤取樣，每月1次，共計5個樣品。樣品破碎成粉后用無菌袋密封，按取樣時間依次標記為1、2、3、4、5。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑

真菌宏基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)；Q10212 Qubit2.0 DNA檢測試劑盒(life)；

V43NDF引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGA￣T￣C￣T￣N￣G￣G￣C￣A￣A￣G￣T￣C￣T￣G￣G￣TGCCAG；

EukV4R引物：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACC￣C￣G￣A￣G￣A￣A￣TTCCAACGGTATCTRATCRTCTTCG。(上海生工)；理化檢測試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.2 儀器

UNIVERSAL 320R冷凍離心機；HWS26型電熱恒溫數(shù)字水浴鍋；T100TMThermal Cyeler PCR儀；DYCZ-21電泳槽；美國UVP凝膠成像系統(tǒng)等。

4S=(b+e+h)+(d+e+f)+(a+e+i)+(c+e+g)=(a+b+c)+(d+e+f)+(g+h+i)+3e=3S+3e，所以有S=3e.由此可以得到：

1.3 實驗方法

1.3.1 宏基因組提取

采用差速離心法收集微生物細胞沉淀[1]，采取反復凍融與試劑盒相結合的方法，收集DNA，置于-20 ℃保存；利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應加入的DNA量。按照產(chǎn)品說明書進行操作。

1.3.2 PCR擴增

利用引物V43NDF和EukV4R對大曲真菌基因組18S rDNA V4進行擴增。擴增體系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L each) 0.5μL，DNA10 ng，引物F(50 μmol/L) 0.5 μL，引物R (50 μmol/L)0.5 μL，PlantiumTaq(5 U/μL)0.5 μL。擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，共5個循環(huán)；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共20個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.3.3 DNA純化及高通量測序

1.3.4 糖化力及發(fā)酵力測定

按照五糧液企業(yè)技術標準執(zhí)行(2005年頒布)。糖化力：1 g絕干曲，在30 ℃、pH4.6、60 min分解可溶性淀粉為葡萄糖的質量(mg)，即mg/(g·h)，底物為2.0%的可溶性淀粉溶液；發(fā)酵力：1 g絕干曲在30 ℃發(fā)酵72 h利用蔗糖產(chǎn)生CO2的體積(mL)，即mL/(g·72 h)，底物為8%的蔗糖溶液。

2 結果與分析

2.1 真菌多樣性分析

2.1.1 測序序列數(shù)目和多樣性指數(shù)分析

由圖1及表1的Coverage指數(shù)可知，取樣覆蓋率均超過97%以上，樣品隨著測序序列數(shù)的增加，多樣性指數(shù)曲線趨于平坦，說明本次試驗取樣合理，結果能代表樣本的真實情況，更多的取樣僅會產(chǎn)生少量的OTU。

對各樣本測序序列進行質控過濾后，大曲儲藏過程中的5個樣本測序共獲得116 122條序列，聚類分析共產(chǎn)生3 747個OTU分類。Shannon 指數(shù)、Chao1指數(shù)是常用的描述群落物種多樣性的指數(shù)，其中，Shannon值越大，說明群落多樣性越高；Chao1指數(shù)常用來估計物種總數(shù)，其值越高，物種豐富度越高[5]。由表1可知，大曲真菌微生物多樣性隨著儲存時間的推移，Shannon index有所上升，接下來則需弄清微生物組成具體發(fā)生了哪些變化。

表1 操作單元分類和多樣性指數(shù)分析

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of samples

2.1.2 OTU分布的Venn圖

Venn圖可以用來統(tǒng)計樣本中共有和獨有的OTU的數(shù)目，直觀地展現(xiàn)樣品OTU數(shù)目組成的相似性及重疊情況。如圖2所示，樣品1到5獨有的OTU數(shù)目依次為654、667、737、680和590，均遠遠超過自身總OTU的半數(shù)以上；5個樣品共有的OTU僅28個，其所代表的真菌物種長期存在于儲藏期內。通過Venn圖可以看出，每個樣品都具有極高的特異性，說明真菌結構隨著時間的變遷發(fā)生了較大的改變。接下來，我們將通過真菌多樣性分析，弄清哪些物種的改變和數(shù)量的變化造成了這樣的差異。

圖2 不同樣品的OTU韋恩圖Fig.2 Venn profile of OTU in different samples

2.1.3 大曲貯藏過程中不同時期真菌多樣性分析

對樣品中物種多樣性進行分類分析，可以得到以下2個信息：(1)樣品中含有何種微生物；(2)各微生物的相對豐度。為了展示效果，一般只顯示相對豐度前50的物種分類，剩余物種合并為other。

如圖3所示，在屬水平上大曲貯藏過程中真菌多樣性有較為明顯的差異。大曲貯藏初始階段，畢赤酵母屬(Pichia)所占比例最高為42.27%，是樣品1中第一大優(yōu)勢屬，其次枝氯霉屬(Ramichloridium)也是主要真菌類群，所占比例為26.09%。復膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)、根霉菌屬(Rhizopus)和橫梗霉屬(Lichtheinia)也被檢測到，所占比例分別為6.03%、5.24%和3.34%。此外，一類分類信息不明的真菌類群(unclassified)所占比例達到了12.4%。隨著時間的推移，Ramichloridium不再是優(yōu)勢真菌，而Pichia比例也略有下降，在貯藏末期(樣品5)中占比為28.11%，不過仍為相對數(shù)量最多的優(yōu)勢真菌；Rhizopus數(shù)量則穩(wěn)步增加，最后比例達到了17.37%。最終，貯藏最后階段的優(yōu)勢真菌類群為Pichia、Lichtheinia及Rhizopus。根霉菌(Rhizopus)是釀酒發(fā)酵中非常重要的常見菌，以產(chǎn)淀粉酶最為突出[6]，在一定條件下，根霉能進行邊糖化邊發(fā)酵，產(chǎn)生如乙醛、乙酸乙酯、乳酸乙酯、苯乙醇等風味物質[7]；橫梗霉屬(Lichtheinia)是非常重要的產(chǎn)酯酶菌，呂梅從瀘州老窖、枝江大曲等中溫、高溫大曲中篩選到了具有產(chǎn)酯酶活性的橫梗霉菌[8]。此外我們也可以看到，Saccharomycopsis、Trichocoma等菌群雖然相對數(shù)量一直不夠豐富，但在整個貯藏過程中穩(wěn)定存在，也是比較重要的功能性微生物。

圖3 各樣本在屬水平上的真菌群落結構柱狀圖Fig.3 The histogram of fungal community structure of all samples in the genus level

2.2 糖化力及發(fā)酵力分析

如表2所示，從糖化力指標上來看，大曲貯藏初期其值最高，中期逐漸降低，而末期又有所回升；從發(fā)酵力指標上來看，總體趨勢為緩慢升高。最終，出庫曲的糖化力為416 mg/(g·h)，發(fā)酵力為190 mL/(g·72h)，與生產(chǎn)上的要求一致，達到了出庫標準，能為后續(xù)的釀造提供足夠的動力和條件。

表2 各樣品糖化力與發(fā)酵力結果

注：大曲品溫數(shù)據(jù)由車間跟蹤記錄所得。

3 結論

本研究采用高通量測序技術對大曲真菌多樣性進行分析，進一步揭示了大曲貯存過程中真菌微生物的多樣性及群落結構變化。同時，在各樣本的分析數(shù)據(jù)中還有一定比例的OTU沒有屬的歸屬，這當中可能存在新的物種，屬于五糧液釀造微生物新資源。

結合糖化力發(fā)酵力指標可以看出，本次樣品的最終群落特征與工藝需求相符。隨著大曲貯藏時間的推移，大曲中真菌微生物的多樣性指數(shù)總體趨勢是逐漸升高的。其過程大致可分為3個階段：(1)入庫初始階段，曲塊品溫較高，水分最大(樣品1)，大曲發(fā)酵力最低，糖化力最高，初步推斷該階段糖化力發(fā)酵力指標受前期培曲工藝影響較大，酵母菌群雖占主體，但受溫度影響，其活性可能受到抑制；(2)隨著貯藏時間的推移，品溫維持在30℃左右，水分下降約1%(樣品2、3，4)。而從第1階段過渡至第2階段時，大曲溫度及水分下降較快，真菌群落結構迅速調整，從Shannon指數(shù)可以看出，真菌微生物多樣性提高明顯，從2.08上升為2.57，期間指數(shù)略有下滑但總體平穩(wěn)，其中根霉菌得到有效繁殖；(3)貯存末期(樣品5)，曲塊溫度下降至22℃，Shannon指數(shù)達到最大值，從群落結構柱狀圖可以看出，該階段真菌類群最為豐富，其中畢赤酵母菌，根霉菌趨于穩(wěn)定，橫梗霉菌也成為了優(yōu)勢真菌，該群落結構也為大曲相應指標的提升奠定了基礎。一般認為，糖化力主要與根霉菌有關，發(fā)酵力主要與酵母菌有關。從試驗結果可以發(fā)現(xiàn)，相關菌群相對數(shù)量的多少并不能完全決定糖化力與發(fā)酵力的大小，這說明大曲微生物的活動是復雜的，微生物在一定條件下可以進行繁殖，但受到不同溫濕度影響，其代謝產(chǎn)酶等活動會表現(xiàn)不一。因此，我們可以通過特定的培養(yǎng)方法，分離篩選優(yōu)勢酵母菌，根霉菌，分析其功能性，為工藝控制及解釋傳統(tǒng)大曲的發(fā)酵代謝機理提供更完善的科學依據(jù)。

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Analysis of the change of saccharifying power and fermenting power for Luzhou-flavorDaquand their fungal diversity during storage

SHI Si1*, PENG Zhi-fu1, QIAO Zong-wei1,2, LIU Duo-tao1,LUO Qing-chun1, TU Fu-ming1

1(Wuliangye Group Co.,Ltd.,Yibin 644007,China)2(Solid-state Fermentation Resource Utilization Key Laboratory of Sichuan Province, Yibin 644007, China)

To explore the change of microorganisms communities ofDaquin the storage process, the V4 regions of fungal 18S rDNA were analyzed by high-throughput sequencing, 3747 OTUs were obtained in clustering analysis. The results showed that fungal community structure was constantly adjusted,Pichia,Rhizopus,Lichtheiniabecame the dominant genera at the end of storage. The fermenting power ofDaqugradually increased as time going on, while saccharifying power gradually decreased and then increased again. The data meet the requirements for quality ofDaqu, which can provide enough power for the subsequent brewing.

Daqu; storage; fungal diversity; physicochemical index

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705013

碩士研究生(本文通訊作者，E-mail: sstype@sina.com)。

固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室開放基金項目(2015GTJ004)

2016-12-21，改回日期：2017-02-08