熊科，熊蘇玥，崔曉亭，侯潔，鮑藝佳，孫佳月，李秀婷*

1(北京工商大學(xué)，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京，100048)2(北京工商大學(xué)，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京，100048)3(北京工商大學(xué)，北京市風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)4(北京工商大學(xué)，北京市質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)

鏈霉菌L10608產(chǎn)木聚糖酶純化及特異水解底物生成益生元型產(chǎn)物研究

熊科1,2，熊蘇玥1,2，崔曉亭1,4，侯潔1,3，鮑藝佳1，2，孫佳月1，4，李秀婷1,2*

1(北京工商大學(xué)，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京，100048)2(北京工商大學(xué)，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京，100048)3(北京工商大學(xué)，北京市風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)4(北京工商大學(xué)，北京市質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)

研究對(duì)前期篩選的一株產(chǎn)木聚糖酶菌株L10608進(jìn)行鑒定，判定其為鏈霉菌。并對(duì)該菌株所產(chǎn)木聚糖酶進(jìn)行純化得到電泳級(jí)純度木聚糖酶L10608-Xyn11。該酶蛋白質(zhì)分子量為24 kDa。探究L10608菌株所產(chǎn)木聚糖酶以商品玉米芯木聚糖、商品燕麥木聚糖、自制水不溶性玉米芯木聚糖為底物時(shí)的水解特性，結(jié)果表明該菌所產(chǎn)木聚糖酶對(duì)木三糖有很強(qiáng)的水解作用，以自制水不溶性玉米芯木聚糖為底物水解時(shí)效果最為明顯，底物中木三糖的含量下降了1.521 mg/mL，產(chǎn)物中木二糖增加了1.635 mg/mL，木糖僅增加了0.180 mg/mL。菌株L10608的酶解產(chǎn)物中低聚木糖的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于木糖，且高產(chǎn)低聚木糖中的主要有效成分木二糖，其水解特異性表明該菌有潛力作為益生元型低聚木糖的生產(chǎn)菌株。

鏈霉菌L10608；木聚糖酶；分離純化；益生元產(chǎn)物

木聚糖作為植物半纖維素的重要組分，是自然界中除纖維素以外含量最豐富的可再生生物質(zhì)資源[1]。木聚糖可被降解用于生產(chǎn)低聚木糖，后者具有降低癌癥風(fēng)險(xiǎn)、抗齲齒、降低血壓、降低血清膽固醇、抑制病原菌和腹瀉潤腸通便等作用，可應(yīng)用于酸奶、焙烤食品、功能性食品等[2]。目前，生物酶降解法是制備低聚木糖的主要方法之一[3]，木聚糖酶來源主要依靠真菌、細(xì)菌等微生物的發(fā)酵產(chǎn)生，鏈霉菌屬在低聚木糖的工業(yè)化生產(chǎn)中已實(shí)現(xiàn)初步的應(yīng)用[4-5],具有一定的安全性與應(yīng)用潛力。而目前酶法生產(chǎn)采用微生物來源的木聚糖酶水解木聚糖時(shí)除了存在菌株本身產(chǎn)酶活力低下外，水解產(chǎn)物中木二、木三糖等特異性成分含量也大多低于30%且含大量木糖、阿拉伯糖等非功能性成分，導(dǎo)致后期需要較復(fù)雜的工藝和高額的成本來對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行提純，以提高功能低聚木糖純度(60%～70%)[6-7]。目前報(bào)道的只有極少數(shù)菌株具有底物水解高酶活力,且水解底物時(shí)產(chǎn)物中木二糖、木三糖比例超過50%[8]。

微生物來源的木聚糖酶普遍存在于自然界中且種類繁多，其中細(xì)菌和霉菌來源的木聚糖酶研究較多[9]。本實(shí)驗(yàn)從土壤中篩選得到1株L10608菌株，在前期已完成其液體發(fā)酵條件優(yōu)化及水解特性初步研究發(fā)現(xiàn)其適合以農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯木聚糖為底物，開展水解產(chǎn)物特異性的研究?；诖吮狙芯客ㄟ^形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)手段對(duì)研究菌株進(jìn)行鑒定，并純化其所產(chǎn)木聚糖酶和對(duì)其產(chǎn)酶性質(zhì)進(jìn)行研究，針對(duì)目前酶法生產(chǎn)中反應(yīng)過程難以控制，低聚木糖功能性成分產(chǎn)率低，提純成本高，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)的問題。研究采用不同種木聚糖底物，用HPLC分析考察菌株所產(chǎn)木聚糖酶水解產(chǎn)物特性，以期為工業(yè)生產(chǎn)益生元型低聚木糖提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鏈酶菌L10608(實(shí)驗(yàn)室篩選)；燕麥木聚糖和玉米芯木聚糖(VETEC)，細(xì)菌 DNA提取試劑盒(Sigma)；木糖標(biāo)品 (木糖、木二糖、木三糖、木四糖)色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；硝酸銨、鹽酸、氫氧化鈉、乙酸、醋酸鈉、檸檬酸、三鈉無水亞硫酸鈉：分析純，北京化工廠；玉米芯木聚糖(實(shí)驗(yàn)室提取)。

TCYQ培英臺(tái)式恒溫振蕩器，蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；紫外可見分光光度計(jì)UV-2600，尤尼柯上海儀器有限公司；VEGA-LSU型掃描電子顯微鏡，捷克Tescan公司；SP-Sepharose柱填料，Healthcare公司；AKTAUPC-900蛋白純化儀，美國GE公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，Solarbio公司。

1.2 培養(yǎng)基

菌株發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5，胰蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂20，定容至1L；液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：牛肉蛋白胨10，玉米芯木聚糖20，酵母膏3，NaNO32，KH2PO46，K2HPO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，定容至1L。LB培養(yǎng)基(g/L)：氯化鈉10，胰蛋白胨10，酵母浸粉5，定容至1L。上述培養(yǎng)基均要求pH 5.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 產(chǎn)木糖酶菌株鑒定

將菌株在LB培養(yǎng)基37℃恒溫箱培養(yǎng)2 d，在顯微鏡下進(jìn)行菌株形態(tài)特征的觀察與革蘭氏染色反應(yīng)。DNA的提取按照細(xì)菌DNA提取試劑盒的試劑說明書進(jìn)行。引物為：Primer1: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，Primer2: TACGGCTACCTTGTTACGACTT。將提取的基因組 DNA 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增[8]，PCR反應(yīng)體系為10×PCR Buffer 2.5 μL，20 μmol/L Primer1 0.5 μL，20 μmol/L Primer2 0.5 μL， 2.5 mmol/L dNTP 4 μL，5 U/L rTaq酶0.3 μL，DNA 1.0 μL，ddH2O 17.5 μL[10]。 PCR擴(kuò)增條件預(yù)變性95 ℃10 min，變性95 ℃ 30s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，再延伸72 ℃10 min，1 %瓊脂糖凝膠電泳。送出測序后獲得16S rDNA片段的基因序列，在 NCBI 中BLAST 分析與已登錄基因序列進(jìn)行比對(duì)，選擇相似度最高的基因序列用Clustalx 1.8[9]進(jìn)行多序列對(duì)比分析以及MEGA 6.0軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 木聚糖酶純化

菌株液態(tài)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液10 000 r/min 離心10 min，收集上清液即為粗酶液。取550 mL的粗酶液在冰水浴中，緩慢加入(NH4)2SO4粉末，使(NH4)2SO4的濃度達(dá)30 %的飽和度，然后繼續(xù)攪拌1 h，在10 000 r/min下離心10 min，上清液和沉淀收集測木聚糖酶活力和蛋白含量。向上清液中繼續(xù)加入(NH4)2SO4，至(NH4)2SO4飽和度達(dá)到50%，10 000 r/min 離心10 min 收集沉淀。將沉淀用20 mmol /L的醋酸緩沖液(pH5.5) 溶解，在相同緩沖液體系中4℃透析過夜。

將上述發(fā)酵條件下產(chǎn)生的粗酶液經(jīng)30%～50%(NH4)2SO4沉淀后得到部分提純的酶液，利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)，進(jìn)一步用SP-Sepharose離子交換樹脂交換層析純化酶蛋白。實(shí)驗(yàn)條件為：緩沖體系為pH8的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液；洗脫液為0～0.2mol/L NaCl溶液(溶于pH8的0.02 mol/L Tris-HCl)；以1 mL/min的流速；每管設(shè)定收集1 mL，收集樣品備用。

1.5 酶活力測定

木聚糖酶活力測定參照DNS[11]法：將0.1 mL的酶液(適當(dāng)稀釋)，加到0.9 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%樺木木聚糖底物液中(底物液用pH5.5的0.05 mol/L的醋酸緩沖液配制)，在55 ℃下反應(yīng)5 min，用1 mL DNS來終止反應(yīng)，以木糖作標(biāo)準(zhǔn)，酶活力單位定義為在一定條件下，單位時(shí)間內(nèi)生成1 μmol木糖所要的酶量(U)。蛋白濃度測定采用蛋白含量測定試劑盒。

1.6 木聚糖酶酶譜及分子量測定

聚丙烯酰胺凝膠電泳[12]在分離膠和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%和4.5%的條件下進(jìn)行，電泳后的凝膠用考馬斯亮蘭染色。變性狀態(tài)下的酶譜分析是添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%樺木木聚糖到分離膠中，其他與SDS-PAGE一致，電泳后的凝膠用異丙醇(25%)與pH7.0的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液各洗4次，然后在50 ℃反應(yīng)15min，接著用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%剛果紅染色15 min，最后用NaCl溶液 (1 mol/L)脫色，直至出現(xiàn)透明斑。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker在SDS-PAGE 中的相對(duì)遷移率對(duì)分子質(zhì)量作圖，求出該木聚糖酶的分子質(zhì)量。

1.7 酶解產(chǎn)物HPLC分析

配置1mL反應(yīng)體系：分別以500μL 20 mg/mL的實(shí)驗(yàn)室自制水不溶性玉米芯木聚糖、玉米芯木聚糖(VETEC)、燕麥木聚糖(Biotopped)為底物，10 U的酶液，用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH5.5)補(bǔ)足至1 mL。將配置好的1 mL反應(yīng)體系于55℃水浴鍋水浴加熱反應(yīng)12 h，0.22 μm水相膜注入進(jìn)樣瓶中等待檢測。色譜柱條件：糖分析柱(4.6ID×250mm,COSMOSIL)；實(shí)驗(yàn)條件：流動(dòng)相為乙腈:水70:30，流速為0.8 mL/min，柱溫箱溫度30 ℃，示差折光檢測器溫度30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)品曲線繪制。分別吸取木糖、木二糖、木三糖、木四糖標(biāo)準(zhǔn)品溶于水中，依次稀釋為濃度為：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得木糖、木二糖、木三糖、木四糖標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。分別取20μL 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣分析，以木糖、木二糖、木三糖、木四糖濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制木糖、木二糖、木三糖、木四糖的峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以木糖、木二糖、木三糖、木四糖濃度為橫坐標(biāo)，以液相檢測峰面積為縱坐標(biāo)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為

式中：X1、X2、X3、X4分別為木糖、木二糖、木三糖、木四糖濃度(mg/mL)。Y1、Y2、Y3、Y4分別為木糖、木二糖、木三糖、木四糖峰面積。

降解率的計(jì)算是酶解后體系中木糖、木二糖、木三糖、木四糖含量的變化與空白底物中相應(yīng)含量的比值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定

菌株L10608在LB培養(yǎng)基上(圖1A)菌落為白色、表面濕潤，菌體呈大小不等的圓形，菌落濕潤不易挑起，長時(shí)間培養(yǎng)后菌體周圍培養(yǎng)基呈深綠色，產(chǎn)生了色素。

圖1 菌株L10608在LB培養(yǎng)基上及顯微鏡(10×100)下形態(tài)特征Fig.1 The morphological characteristics of strain L10608 on a LB medium and a microscope (10×100)

菌株在顯微鏡下的鑒定(圖1B)顯示了生長在LB培養(yǎng)基上的菌株L10608在顯微鏡下結(jié)構(gòu)形態(tài)，從圖中可以看出該菌株革蘭氏染色呈陽性，具有分支狀菌絲體菌體，細(xì)胞小，成鏈狀排列，符合鏈霉菌的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。對(duì)菌株進(jìn)行基因組DNA提取，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段為1500bp左右的目的條帶。將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行基因序列的測定，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對(duì)，選取相似度最高(均在99 %以上)的10株菌株與該段基因序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以判斷L10608為鏈霉菌，并與Streptomycessp.GY2序列相同源性最高為72 %。

圖2 菌株L10608的基因發(fā)育樹Fig.2 L10608 strain gene phylogenetic tree

2.2 木聚糖酶的純化

注: M：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1：粗酶液；2：30%～50%硫酸銨沉淀；3：SP-sepharose離子交換層析；4：酶譜。圖3 鏈霉菌L10608 Xyn11純化圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified L10608-Xyn11

粗酶液經(jīng)過硫酸銨沉淀、SP-Sepharose離子交換層析分離純化后得到電泳級(jí)純酶L10608-Xyn11 (圖3)。圖3表明經(jīng)純化的酶在SDS-PAGE凝膠上呈現(xiàn)單一條帶且酶譜相對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)透明條帶，表明該純化的木聚糖酶達(dá)到電泳純級(jí)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 在SDS-PAGE 中的相對(duì)遷移率可得該木聚糖酶的分子質(zhì)量為24 kDa，純化過程中酶活力回收率為4.62%，木聚糖酶純化倍數(shù)為11.91，木聚糖酶的比酶活升高至4590.9 U/mg(表1)。研究發(fā)現(xiàn)由于鏈霉菌L10608 能夠產(chǎn)生11族、10族兩種木聚糖酶，而L10608-Xyn11 只是其中之一，因此導(dǎo)致該酶的純化倍數(shù)與酶活回收率略低。這與菌株Trichodermasp. K9301[13]的研究結(jié)果類似，該菌也產(chǎn)生2種不同種類的木聚糖酶，其酶活回收率也略偏低。

表1 鏈霉菌L10608產(chǎn)木聚糖酶的純化總結(jié)

研究顯示，鏈霉菌木聚糖酶的分離純化通常要經(jīng)過多步分離，得到的木聚糖酶通常分為11族與10族兩個(gè)水解酶家族，蛋白分子質(zhì)量大多分別為20～25 kDa與30～55 kDa[14]，該酶分子量為24 kDa極可能屬于11家族木聚糖酶。用Edman降解法測定L10608-xyn11N-末端的10個(gè)氨基酸殘基序列用N端序列為ATTITTNQTG(Ala-Thr-

Thr-Ile-Thr-Thr-Asn-Gln-Thr-Gly)，經(jīng)NCBI BLAST對(duì)比后發(fā)現(xiàn)與糖苷水解酶11家族Streptomycessp. JHA19 1,4-beta-xylanase(Sequence ID: WP_055619964.1)N端序列100%相似，可判斷L10608-xyn11為11家族木聚糖酶。

2.3 酶解產(chǎn)物HPLC分析

由表2所示不同來源木聚糖酶在相同酶解條件下，水解不同底物后產(chǎn)物中木糖、木二糖、木三糖、木四糖含量變化情況(mg/mL)。

表2 不同來源木聚糖酶與水解不同底物后的木糖、木二糖、木三糖含量及降解率

結(jié)果表明，L10608-Xyn11與實(shí)驗(yàn)室另外2株菌同期篩選出的菌株L2524與L3221所產(chǎn)的木聚糖酶在同樣酶解條件下，水解3種不同的木聚糖底物時(shí)，不同來源酶與不同底物水解后的木糖、木二糖、木三糖含量的變化差異明顯。當(dāng)水解玉米芯木聚糖(VETEC)底物時(shí)，從結(jié)果可知L10608-Xyn11對(duì)底物中木三糖的水解能力明顯強(qiáng)于另外2株菌所產(chǎn)木聚糖酶，其對(duì)空白中木三糖的水解率達(dá)到了84%以上，使水解產(chǎn)物中木二糖的含量顯著上升至空白樣品的2.8倍，相對(duì)空白水解產(chǎn)生了1.035 mg的木糖。L10608-Xyn11與一些11族的木聚糖酶水解底物生成產(chǎn)物的性質(zhì)不同，比如來自Bacillussubtilis的11族木聚糖BsXynA[15]以20 mg/mL櫸木木聚糖為底物時(shí)其主要水解產(chǎn)物為木三糖。Qi Yang[16]等人從黑曲霉中純化出一種水解終產(chǎn)物主要為木二糖的11族的木聚糖酶rAfxynA，rAfxynA水解10 mg/mL的櫸木木聚糖時(shí)水解產(chǎn)物中含有木糖(0.61±0.04)μmol/mL，木二糖(6.05±0.14)μmol/mL，木三糖(2.47±0.22)μmol/mL，其對(duì)木三糖的水解特異性不高，水解率低。

在同樣酶解條件下水解實(shí)驗(yàn)室自制水不溶性玉米芯木聚糖底物的結(jié)果表明，其與水解玉米芯木聚糖(VETEC)底物時(shí)情況相似，L10608-Xyn11對(duì)木三糖同樣有很強(qiáng)的水解能力，導(dǎo)致水解產(chǎn)物中有大量的木二糖與部分木糖累積，相對(duì)空白水解產(chǎn)物中木二糖的含量增加了1.635 mg，木糖含量增加了0.180 mg。另外2株菌所產(chǎn)的木聚糖酶雖然超過了L10608-Xyn11對(duì)木三糖的水解率，但其木二糖的產(chǎn)率遠(yuǎn)低于L10608-Xyn11?？梢耘袛郘10608-Xyn11對(duì)玉米芯來源的木聚糖水解能力良好，對(duì)木三糖有較強(qiáng)的底物特異性。一般研究認(rèn)為木二糖至木五糖均是較好的低聚木糖類雙岐因子，雖然木三糖對(duì)某些益生菌如青春雙歧桿菌的增殖能力與降低總糖含量的能力強(qiáng)于木二糖[17]，其降低培養(yǎng)液 pH 值的能力和木二糖及低聚木糖相當(dāng)[18],但同時(shí)也有研究認(rèn)為雙歧桿菌傾向于優(yōu)先利用聚合度較低的低聚糖[19-20]，因此在一定的水解時(shí)間內(nèi)，木二糖的利用率可能高于木三糖。

表2中3株菌所產(chǎn)木聚糖酶在同樣酶解條件下水解燕麥木聚糖(Biotopped)底物時(shí)，由于空白底物本身含有大量的木二糖、木四糖和少量木三糖，且無木糖。L10608-Xyn11酶解產(chǎn)物中木四糖與木二糖的含量下降，木三糖含量相對(duì)空白底物上升了0.340 mg，與水解玉米芯木聚糖底物的酶解結(jié)果相反。推測可能由于燕麥木聚糖中木二糖含量較高，常常會(huì)產(chǎn)生一些終產(chǎn)物抑制作用[21-22]，從而抑制了木三糖進(jìn)一步分解為木二糖，且底物中大量木四糖水解為木三糖，因此產(chǎn)物中木三糖含量相對(duì)空白底物有所上升。為進(jìn)一步驗(yàn)證L10608-Xyn11對(duì)木三糖的強(qiáng)水解能力，采用相同的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)木三糖單品進(jìn)行水解。發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)物中木糖和木二糖含量分別為0.655 mg和0.578 mg，木三糖已被完全水解。證明了L10608-Xyn11對(duì)木三糖的水解能力。結(jié)果圖4所示。

圖4 以木三糖為底物的酶解產(chǎn)物圖(HPLC)Fig.4 Thehydrolysates when use xylotriose as substrate

鏈霉菌L10608產(chǎn)木聚糖酶的水解木聚糖底物可大量產(chǎn)生木二糖產(chǎn)物的特點(diǎn)與Meagher[23]等人對(duì)Aspergillusnigersp.中來源的木聚糖酶的研究結(jié)論相似。該研究發(fā)現(xiàn)此木聚糖酶圍繞著催化位點(diǎn)存在8個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，無法水解木二糖，推測可能是因?yàn)楫?dāng)木聚糖酶與木二糖只存在兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合時(shí)(±1)，無法形成穩(wěn)定的中間體參與水解反應(yīng)。劉亮偉[24]等人通過構(gòu)建發(fā)育樹研究了木聚糖酶11家族木聚糖酶及10家族木聚糖酶兩個(gè)家族的分子進(jìn)化差別，認(rèn)為10家族木聚糖酶族催化域結(jié)合底物位點(diǎn)數(shù)要比11家族木聚糖酶少一些，而11家族木聚糖酶需要多于4個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)，因此可能無法水解聚合度較低的木聚糖。而蛋白質(zhì)分子量[25]及后續(xù)實(shí)驗(yàn)得到基因序列推斷，鏈霉菌L10608產(chǎn)木聚糖酶屬于11家族木聚糖酶。因此該酶也無法水解聚合度較低的木二糖。

有大量研究表明，當(dāng)不同結(jié)構(gòu)和組成成分的木聚糖與木聚糖酶結(jié)合時(shí)，由于木聚糖酶空間結(jié)構(gòu)的容納性，導(dǎo)致結(jié)合方式的改變引起產(chǎn)物發(fā)生變化。Ebringerova[26]等人分析了玉米芯木聚糖的結(jié)構(gòu)，認(rèn)為玉米芯可溶性木聚糖和水不溶性木聚糖的主要差別在于前者含較多的阿拉伯糖, 阿拉伯糖連接在木糖主鏈上形成較多的支鏈結(jié)構(gòu)[27]，因此可能是較多的阿拉伯木聚糖側(cè)鏈在空間結(jié)構(gòu)上阻礙了酶與底物的結(jié)合，導(dǎo)致了L10608-Xyn11水解玉米芯木聚糖(水溶性木聚糖)與實(shí)驗(yàn)室自制木聚糖(水不溶性木聚糖)時(shí)，水不溶性木聚糖的水解效率是水溶性木聚糖的2倍。燕麥同屬禾本科植物, 其木聚糖結(jié)構(gòu)與玉米芯木聚糖的結(jié)構(gòu)相似性較高但較多的分支側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，燕麥木聚糖樣品中含有約15%的葡萄糖殘基和10%阿拉伯糖殘基, 木糖殘基僅占70%左右[28]，水解產(chǎn)物可能含有大量的葡萄糖醛、阿拉伯糖殘基等側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的異五糖，這樣的結(jié)構(gòu)影響了木聚糖酶對(duì)其的進(jìn)一步降解降低。這導(dǎo)致了燕麥木聚糖作為水解底物時(shí)L10608-Xyn11對(duì)其水解效率較低。KatarínaKolenova[29]等人的研究也得出類似結(jié)果。他們認(rèn)為來自鏈霉菌StreptomyceslividansXlnA的Xyn-11因?yàn)榭臻g結(jié)構(gòu)的原因無法水解帶有葡萄糖醛酸側(cè)鏈的木三糖，導(dǎo)致了水解產(chǎn)物組成和比例的改變。

3 結(jié)論

鏈霉菌L10608發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀和SP-Sepharose離子交換層析兩步純化后，得到分子量為24 kDa的電泳級(jí)純酶(L10608-Xyn11)酶活力達(dá)到4 590.9 U/mg。同時(shí)，該酶對(duì)木三糖的水解能力非常強(qiáng)，有一定的底物特異性，可水解多種木聚糖產(chǎn)生低聚木糖木二糖，但同時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定量的木糖，可以通過分子改造等手段進(jìn)一步提升其水解底物形成低聚木糖的產(chǎn)率，使其在低聚木糖工業(yè)生產(chǎn)等方面具備良好的應(yīng)用價(jià)值。

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Research on xylanase fromStreptomycessp. L10608 hydrolysis substrate to generate specific prebiotics product

XIONG Ke1,2, XIONG Su-yue1,2, CUI Xiao-ting1,4, HOU Jie1,3,BAO Yi-jia1,2, SUN Jia-yue1,4,LI Xiu-ting1,2*

1(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)2 (Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology and Business University, Beijing 100048,China) 3 (Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China) 4 (Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Preparation of oligosaccharide from xylan hydrolysis is an effective way to add value to hemicellulose material of agricultural waste recycling, which has enormous economic potential and environmental protection significance. A 24 kDa xylanase (L10608-Xyn11) fromStreptomycessp. L10608 was purified by ammonium precipitation and anion-exchange chromatography, and its hydrolysis products from three different xylan substrates were analyzed by HPLC. The xylanase fromStreptomycessp. L10608 displayed strong hydrolysis on xylotriose. The content of xylotriose in the substrate was decreased by 1.521mg/ml, that of xylobiose increased by 1.635mg/ml and that of xylose only increased by 0.180mg/ml. The yield of xylooligosaccharides in substrate hydrolyzed by L10608 strain was much higher than that of xylose, and the main effective component in xylooligosaccharides produce was xylobiose. It indicated that the xylanase fromStreptomycessp. L10608 had potential application prospect in prebiotics production.

Streptomycessp. L10608; xylanase; purification; prebiotics

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705009

博士，副教授(李秀婷教授為通訊作者,E-mail：lixt@btbu.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金(31601408)；北京自然科學(xué)基金面上基金(6172003)；國家自然科學(xué)基金(31371723)

2016-10-20，改回日期：2017-02-10