王露+熊慶+郭彩紅+李夢龍+蒲雪梅

摘 要 結(jié)合紫外吸收和偏最小二乘法建立了環(huán)境水樣中2，4，6三硝基甲苯及其分解物的分析方法，在不經(jīng)過任何預(yù)先分離的情況下，實現(xiàn)了環(huán)境水樣中2，4，6三硝基甲苯（TNT）及其分解物2，4二硝基甲苯（2，4DNT）和2，6二硝基甲苯（2，6DNT）的快速準確測定。采用正交試驗設(shè)計（OAD）配制了25個訓(xùn)練集樣本和15個獨立預(yù)測集樣本，采用變量種群分析（VCPA）方法挑選特征變量以提高偏最小二乘法（PLS）模型的預(yù)測效果，預(yù)測集中每個物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)R2均達到0.99。將最優(yōu)的VCPA模型用于真實水樣中TNT以及DNT的檢測，并采用HPLC方法進行了驗證。實驗結(jié)果顯示，VCPA模型的回收率與HPLC法相近。紫外光譜法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法可作為環(huán)境體系中多成分同時測定的一種簡便、快速、有效的方法。

關(guān)鍵詞 三硝基甲苯； 二硝基甲苯； 紫外光譜； 化學(xué)計量學(xué)； 環(huán)境水樣

1 引 言

2，4，6三硝基甲苯（TNT）在軍事和商業(yè)中[1]應(yīng)用廣泛。研究表明，TNT可引起生物體中毒[2～4]，而二硝基甲苯（DNT）是TNT的主要分解物，也是涂料、橡膠和顏料等物質(zhì)生產(chǎn)的中間物[5，6]，該類污染物在環(huán)境水中濃度可達ng/L到 mg/L[7]，長時間接觸痕量的DNT會影響生物體的生長和存活[8，9]。因此，檢測環(huán)境水中TNT和DNT具有重要意義。

文獻報道的用于檢測空氣、水和土壤中TNT及DNT含量的方法，包括熒光光譜法[10]、表面增強拉曼光譜法（SERS）[11，12]、氣相色譜結(jié)合電子捕獲檢測法（GCECD）[13]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GCMS）[14]和高效液相色譜法（HPLC）[1，15]。這些方法選擇性和靈敏度較高，但是大多需要昂貴的儀器，樣品前處理過程復(fù)雜，耗時長，因此，發(fā)展快速、簡單和準確的TNT及DNT定量方法具有重要的實用價值。

紫外吸收法是一種簡單、快速、準確的定量分析方法[16]，但選擇性不高。如果樣本中物質(zhì)相似或者未知干擾存在的情況下，吸收光譜會發(fā)生重疊，影響其準確測量，因此限制了它在一些復(fù)雜體系中的應(yīng)用。化學(xué)計量學(xué)可以利用數(shù)學(xué)分離代替化學(xué)分離來解決光譜重疊的問題[17，18]，其中偏最小二乘法是功能強大的多元統(tǒng)計方法，在樣本數(shù)量較少、光譜重疊的情況下，可以實現(xiàn)定量定性分析[19，20]。研究表明，通過消除一些干擾變量或者挑選一些包含重要信息的變量，可以顯著提高模型的效果[21，22]，如競爭性自適應(yīng)權(quán)重取樣法（CARS）[23]、迭代偏最小二乘（iPLS）[24]、變量消除法（UVE）[25]、遺傳算法（GA）[26]、迭代保留信息變量法（IRIV）[27]。最近，Yun等[28]提出了一種新的變量挑選方法，即變量結(jié)合種群分析法（VCPA），該方法可充分利用子集之間的統(tǒng)計信息和變量間的相互關(guān)聯(lián)，在處理近紅外光譜數(shù)據(jù)時，VCPA方法比CARS、MCUVE、IRIV方法更具有優(yōu)勢。

TNT分解物中，2，4DNT和2，6DNT受到研究者的廣泛關(guān)注[29，30]，但是目前尚未有結(jié)合計量學(xué)進行分析檢測的相關(guān)報道。本研究選擇TNT以及2，4DNT和2，6DNT作為環(huán)境水中炸藥及其分解物的代表物質(zhì)，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)和紫外光譜法對其進行同時定量測定。采用正交設(shè)計方法制備了一系列三組分混合物樣本，其中25個作為訓(xùn)練集，15個作為獨立預(yù)測集，此外還預(yù)測了四類真實水樣（共8個樣本）。比較了全譜和變量挑選兩種建模方法的預(yù)測結(jié)果，選取每個物質(zhì)的最優(yōu)模型用于真實水樣中目標物的預(yù)測，并采用HPLC方法對模型的實用性和準確性進行了驗證。研究結(jié)果表明，紫外光譜法結(jié)合變量挑選模型在復(fù)雜體系目標物同時測定中具有良好的應(yīng)用潛力。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Hitachi U2900型紫外分光光度計、 SHIMADZU LC20AT高效液相色譜儀（日本島津公司），色譜條件：流動相為乙腈水（30∶70， V/V），等度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，檢測波長254 nm，整個分離過程由CBM20Alite系統(tǒng)控制。

TNT（中國銀光化學(xué)試劑廠）； 2，4DNT和2，6NDT分析標準品（Aladdin公司上海）；乙腈（色譜純，成都科龍化學(xué)試劑廠）。實驗用水均為超純水。標準工作溶液：準確稱取適量的TNT，2，4DNT和2，6DNT固體粉末，用乙腈溶解并定容，終濃度為200 μg/mL。

2.2 紫外吸收法測定單組分硝基苯

采用單組分校正法確定紫外吸收法測定TNT和DNT的線性范圍。配制系列濃度的工作溶液。以溶劑為空白，測量各工作溶液在200～400 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。根據(jù)各分析物在最大吸收波長下對應(yīng)的吸光度與樣品濃度構(gòu)建立校正曲線，得到測定TNT，2，4DNT和2，6DNT的線性范圍。

2.3 樣本配制

采用三因子五水平的正交試驗設(shè)計（OAD）[31]配制25個訓(xùn)練集樣本，15個獨立測試樣本。為了驗證本方法的實用性，收集了自來水（四川大學(xué)化學(xué)館）、池水（四川大學(xué)望江校區(qū)）、河水1（府南河，成都九眼橋）和涂料廠附近的河水2（江安河，雙流蛟龍港）4種水樣，分別用0.45 μm濾膜過濾。每種水樣配制兩個樣本。各樣本均加入適量TNT，2，4DNT和2，6DNT （濃度均在線性范圍內(nèi)），模擬真實環(huán)境水樣，每個樣本光譜平行測定3次。表1列出了訓(xùn)練集樣本（1～25號樣本）、獨立測試集（26～40號樣本）以及真實水樣（自來水41～42，池水43～44，河水1 45～46， 河水2 47～48）濃度配比。

2.4 化學(xué)計量學(xué)方法

偏最小二乘（PLS）算法通過最大化光譜矩陣X與目標物質(zhì)濃度矩陣y之間的協(xié)方差為目標，逐一求解模型中的各個潛變量。將光譜數(shù)據(jù)矩陣與樣本各組分濃度矩陣之間的內(nèi)在聯(lián)系關(guān)聯(lián)起來，使校正模型更為穩(wěn)健。在面臨樣本數(shù)目少而特征變量較多的問題時，可以有效提取有用化學(xué)信息。

變量模型種群分析（VCPA）[28]是一種結(jié)合模型種群分析和指數(shù)遞減函數(shù)迭代進行變量挑選的方法，將挑選出來的變量用PLS建模。具體步驟如下： （1）隨機將光譜變量建立K個子集，并對這K個子集建立K個PLS子模型； （2）統(tǒng)計K個子模型的評價參數(shù)，選取效果最好的前5%的子模型； （3）將前5%的子模型中的變量進行權(quán)重統(tǒng)計，通過指數(shù)遞減函數(shù)強制刪除權(quán)重較低的變量； （4）確定剩下變量的最佳組合。

本研究采用以下指標對模型進行評價：校正集均方根誤差（RMSEC）、預(yù)測集均方根誤差（RMSEP）、相關(guān)系數(shù)（R2），其計算公式如下：

所有數(shù)據(jù)處理及計算在MATLAB（Version 2013a， Math work， Inc）環(huán)境下完成，PLS和VCPA算法代碼來自于中南大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究中心。

3 結(jié)論與討論

3.1 紫外光譜表征

TNT，2，4DNT和2，6NDT的紫外吸收光譜（圖1）最大吸收波長分別位于228、245和236 nm，3個物質(zhì)的吸收光譜存在嚴重的光譜重疊，在不經(jīng)過預(yù)分離的情況下，使用傳統(tǒng)校正方法難以準確分析3種物質(zhì)的混合物。 因此，引入化學(xué)計量學(xué)模型，通過數(shù)學(xué)分離代替化學(xué)分離來解決光譜重疊的問題。

按照2.2節(jié)中方法，建立了紫外光譜法分別測定單組分TNT，2，4DNT和2，6NDT的標準曲線方程，表2列出了單組分測定的一些特征參數(shù)。

表1中的參數(shù)是沒有經(jīng)過任何預(yù)處理的樣品得到的結(jié)果，雖然與文獻報道的一些TNT和DNT測定方法[3234]相比，檢測限和線性范圍的濃度偏高，但完全可以滿足國家標準的測定需求（國家《污水綜合排放標準》[35]中規(guī)定第二類污染物最高允許排放濃度硝基苯類為：一級標準2.0 mg/L、二級標準3.0 mg/L、三級標準5.0 mg/L）。

3.2 全譜偏最小二乘模型

為了建立可靠、準確和穩(wěn)定的模型，本研究用了兩種光譜預(yù)處理方法（SG平滑，一階導(dǎo)數(shù)）處理原始光譜數(shù)據(jù)，并與未經(jīng)處理的數(shù)據(jù)進行建模結(jié)果對比。因此，對于每個目標物而言，共建立了3個全譜模型。五倍交叉驗證用于評估模型的質(zhì)量。表3列出了PLS全譜模型的建模結(jié)果。

由表3可知，對于TNT和2，4DNT， 經(jīng)過SG平滑預(yù)處理的數(shù)據(jù)建模結(jié)果較好，然而對于2，6DNT而言，一階導(dǎo)數(shù)處理的數(shù)據(jù)建模效果更好。通過比較RMSEP和R2發(fā)現(xiàn)，全譜PLS建模預(yù)測TNT和2，6DNT的R2<0.98，并不理想，這可能是因為全譜數(shù)據(jù)中包含較多的無信息變量，因此進一步采用變量種群分析（VCPA）方法來去除無信息變量，提高模型的預(yù)測結(jié)果。

3.3 變量挑選模型

同樣采用三種光譜數(shù)據(jù)（原始，SG平滑和一階導(dǎo)數(shù)）對每個物質(zhì)建立了三種VCPA模型，預(yù)測結(jié)果見表4。比較表3和表4的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，雖然VCPA模型挑選出來的變量個數(shù)只有10個左右，但是每一個物質(zhì)預(yù)測結(jié)果的R2>0.98，高于沒有變量挑選的PLS模型，表明通過有效變量的挑選可以提高模型的準確率。最后得到了每個物質(zhì)的最優(yōu)模型為：TNT，VCPA+SG平滑；2，4DNT，VCPA+SG平滑；2，6DNT，VCPA+一階導(dǎo)數(shù)。

3.4 環(huán)境水樣的檢測

為了驗證上述最優(yōu)模型的應(yīng)用性和可靠性，將構(gòu)建的最優(yōu)模型用于4種環(huán)境水的8個樣本（每種水樣取兩個樣本）中TNT、2，4DNT和2，6DNT的濃度預(yù)測，并同時采用HPLC方法進行驗證。表5總結(jié)了環(huán)境水樣的全譜PLS、VCPA和HPLC方法的測定結(jié)果。

圖2A顯示了真實樣本的紫外吸收光譜圖，2A中插圖為未加入TNT，2，4DNT和2，6DNT的自來水、湖水和河水的紫外吸收光譜圖。在200～230 nm波長范圍內(nèi)有較強的未知背景吸收，而這個區(qū)域也是3個目標物的主要光譜信息區(qū)。這種背景干擾導(dǎo)致了全譜PLS模型的預(yù)測效果較差，3個目標物質(zhì)的回收率分別在60.8%～155.2%、73.2%～174.6%和47.2%～141.0%。然而，盡管真實水樣中存在較大的未知干擾和目標物的光譜重疊，VCPA建模卻可以通過消除無信息變量和干擾變量仍然取得了滿意的結(jié)果，呈現(xiàn)出強的抗干擾能力，其預(yù)測值與真實值和HPLC測定值非常接近，VCPA模型的平均回收率分別為97.5%、99.1%和98.6%，HPLC方法的平均回收率分別為104.7%、101.0%和102.2%。

圖2B～圖2D顯示了VCPA挑選出來的光譜點，其中a， b分別代表TNT，2，4DNT和2，6DNT之間的差譜[36]，藍色和紅色點為VCPA挑選出來的變量點。圖2B～圖2D的結(jié)果顯示：VCPA模型挑選出來的光譜點主要分布在3種分析物的強吸收區(qū)域220 nm～300 nm之間，是屬于苯環(huán)的ππ*躍遷的主要吸收帶區(qū)域。 差譜圖顯示， 大多數(shù)VCPA光譜點分布在每種分析物與其它兩種物質(zhì)的差譜峰附近，表明挑選出來的光譜點大多位于這些分析物差異較大的區(qū)域。雖然VCPA挑選出來的少量點也位于3種分析物的弱吸收區(qū)域（300～400 nm），并且差譜的差異也比較小，但這些點也同時位于環(huán)境水背景吸收弱的區(qū)域，并且VCPA測試結(jié)果顯示這些點對這3種物質(zhì)的同時定量有一定貢獻。上述分析證明了復(fù)雜體系中特征變量挑選的重要性，可以通過變量挑選來降低干擾，明顯提高預(yù)測結(jié)果的準確性。

4 結(jié) 論

結(jié)合紫外吸收與化學(xué)計量學(xué)中的PLS方法提出了一種簡單、快速、有效的分析方法，可以在不經(jīng)過任何預(yù)分離的情況下準確地測定環(huán)境水樣中的TNT及其分解物（2，4DNT和2，6DNT）的含量。本研究建立了兩種模型：全譜PLS模型和變量挑選VCPA模型，用于預(yù)測獨立測試集和環(huán)境水樣中目標物的含量，并用HPLC方法作為參照。通過對比兩種模型和HPLC的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全譜PLS模型在存在干擾的環(huán)境水樣中預(yù)測準確度低，而VCPA變量挑選方法通過有效地選出重要特征變量，剔出無信息變量，所以在存在未知干擾的情況下依然可以取得準確的結(jié)果，VCPA模型對每個目標物的相關(guān)系數(shù)R2>0.99， 真實環(huán)境水樣目標物的回收率為101.0%～104.7%，與HPLC方法的結(jié)果相近，顯示出了良好的實際應(yīng)用潛力。本研究結(jié)果表明，紫外光譜法與化學(xué)計量學(xué)方法相結(jié)合的分析策略，可以為環(huán)境中炸藥及相關(guān)物質(zhì)的定量檢測提供一種簡便有效的分析方法。

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