朱穎潔+郭磊+劉易+龔瑩+邱澤武+吳劍峰+謝劍煒

摘 要 建立了一種快速、簡便的基于殼層隔絕納米粒子和在線裂解捕集技術的血液氰化物表面增強拉曼光譜（SERS）檢測方法。構建了新型在線裂解吹掃捕集裝置，通過濃H2SO4酸化，將全血中結合態(tài)氰化物裂解，并轉化為揮發(fā)性的HCN氣體，經N2吹掃至堿液中形成NaCN，實現了中毒血液中氰化物的高效裂解與捕集； 在強堿性條件下，以殼層隔絕金納米粒子為基底，極大地削弱了氰化物的溶金效應，使得檢測信號穩(wěn)定，存在時間由普通金納米粒子的5 min提高至1 h； 方法檢出限達10 μg/L，線性范圍為100～2000 μg/L。將此方法應用于氰化物染毒大鼠及真實氰化物中毒患者全血的快速檢測，為氰化物中毒快速檢測提供了一種靈敏、特異、可靠的新方法。

關鍵詞 殼層隔絕納米粒子； 氰化物； 中毒血液樣品； 在線裂解吹掃捕集； 表面增強拉曼光譜

1 引 言

氰化物是一種廉價、速殺的血液性毒劑，中毒事件屢有發(fā)生[1～3]。氰化物吸收入體后，氰根可迅速與細胞線粒體內高鐵細胞色素氧化酶結合，生成氰化高鐵細胞色素氧化酶，使其失去傳遞氧的作用，造成組織缺氧，最終導致機體窒息，甚至死亡[4]。氰化物屬于劇毒物質，人體口服途徑的急性中毒致死劑量為0.48～3.37 mg/kg體重（氰根）[5]，在數分鐘內即出現急性中毒癥狀。因此，盡早發(fā)現、及時干預是有效救治的基本原則，而血液氰化物含量的現場快速檢測是指導中毒救治的首要前提。

目前，針對氰化物中毒生物樣本常用的檢測方法包括目視比色法[6，7]、分光光度法[8]、氣相色譜法[9]、離子色譜法[10]及色譜質譜法[11]等。其中，目視比色法和分光光度法等多利用氰化物和顯色物質間的定量反應，靈敏度在0.01～ 1 mg/L水平，特異性較差； 而色譜（質譜）等方法中，氰化物（氰根或氧化物）自身屬于高極性小分子物質，除需衍生化或選擇特殊類型的色譜柱外，中毒生物樣品前處理過程復雜、耗時，使得上述方法僅適用于實驗室檢測。表面增強拉曼光譜（Surfaceenhanced Raman spectroscopy， SERS）技術具有靈敏度高、指紋譜準確識別、檢測速度快、適用于現場快速檢測等優(yōu)點[12～16]，本課題組前期亦發(fā)展了芥子氣[17]、光氣[18]、百草枯[19]等化學毒劑毒物的SERS現場快速檢測方法。SERS技術在氰化物中毒現場檢測方面具有較大潛力。

本研究基于有孔殼層隔絕納米粒子（Pinhole shellisolated nanoparticles，pinSHINs），結合便攜式拉曼光譜，建立了一種血液氰化物快速SERS檢測新方法。PinSHINs極薄的有孔SiO2殼層能夠有效保護金核，極大地削弱了Au-CN配位形成可溶性復合物Au（CN）所導致的“溶金”效應，使其具有比普通金納米粒子（AuNPs）更優(yōu)越的穩(wěn)定性[20，21]。

但是考慮到與血細胞中細胞色素氧化酶結合的氰化物難以被直接檢測，常用強酸使結合態(tài)氰化物釋放產生HCN，再進行衍生化及分光光度法測定[8，22，23]，較為復雜、耗時。本研究構建了血液中氰化物的在線裂解吹掃捕集方法，以濃H2SO4酸化全血樣品，將結合態(tài)氰化物裂解，并轉化為揮發(fā)性的HCN氣體，經N2吹掃至堿液中形成NaCN，繼而直接對堿液進行SERS檢測，其靈敏度高、特異性強，操作方便快速，檢出限達10 μg/L。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

所有SERS光譜于iRaman型便攜式拉曼光譜儀（美國 B&W TEK公司）上測定（激光波長785 nm，分辨率4.5 cm）。紫外可見吸收光譜（UVVis）于Cary 300型紫外可見分光光度計上（美國Varian公司）獲得。

NaCN（純度為99%，申領于軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所毒劑庫）； Na2SiO3（美國Sigma公司）； NaOH（國藥集團北京化學試劑公司）； 3氨丙基三乙氧基硅烷（ATPMS，美國Alfa Aesar公司）； 消泡劑為本課題組自制（主要成分為脂肪酸酯）； 真空封泥（酒泉祁天特種油品有限公司）； 15 mL離心管及96孔酶標板（美國Corning公司）； 肝素化采血管（江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司）。除特殊說明外，所有化學試劑均為分析純或以上。所有溶液均由超純水（MilliQ A10，美國Millipore公司）配制。雄性SD大鼠（SPF級180～200 g，北京維通利華動物實驗公司，許可證號：SCXK（京）20120001），飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心SPF級動物房。氰化物中毒患者全血樣品由軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院中毒救治科提供。

2.2 實驗方法

2.2.1 殼層隔絕金納米粒子的制備 首先用Frens檸檬酸鈉還原法[24]合成粒徑約為55 nm的金納米粒子（AuNPs），向制備好的55 nm AuNPs中加入1 mmol/L APTMS溶液，攪拌15 min，再加入Na2SiO3溶液 （0.54%， w/w） 并攪拌3 min，使AuNPs表面包覆生成SiO2殼層?？刂芅a2SiO3溶液的pH>11，即可生成1～2 nm厚的有孔SiO2殼層[25]。

2.2.2 NaCN標準溶液的配制 準確稱量NaCN 10.00 mg，用0.01 mol/L NaOH溶液溶解并定容至10 mL， 得1.00 g/L NaCN對照品溶液，于4℃保存。使用時，以0.01 mol/L NaOH溶液稀釋得到濃度為0.005、0.05、0.5、5和50 mg/L的工作溶液。

2.2.3 血液氰化物在線裂解吹掃捕集裝置的構建 血液氰化物在線裂解吹掃捕集裝置分為揮發(fā)裝置（A）、吸收裝置（B）和尾氣吸收裝置（C）三部分（圖1），3只15 mL離心管經相同孔徑導管相連，導管連接處均經真空泥密封，氣密性檢測表明裝置無漏氣。在裝置（A）中加入濃H2SO4，使結合態(tài)氰化物酸化裂解，生成HCN氣體，經氮氣吹掃至裝置（B），被其中的NaOH溶液充分吸收，形成NaCN，對吸收液進行SERS檢測； 裝置（C）連有一段活性炭管，以吸收多余的尾氣。在優(yōu)化條件下，裝置（A）中添加1 mL待測樣品、4 mL 12 mol/L H2SO4溶液和200 μL消泡劑（快速消除吹掃血樣時產生的大量泡沫，防止堵塞管路），裝置（B）和（C）中均加入1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液。

2.2.4 SERS檢測 取1 mL pinSHINs，5000 r/min離心5 min，去除上清液，與200 μL吸收液混合，移入96孔酶標板，進行SERS檢測。便攜式拉曼光譜儀參數為：激光功率90 mW，積分時間10 s。

2.2.5 NaCN染毒動物實驗 依據口服常用染毒劑量[26]及預實驗數據，按3 mg/kg（50%半數致死劑量LD50）的劑量向插管SD雄性大鼠灌胃染毒NaCN生理鹽水溶液，在注射之前抽取血液，設為“零”時間點。在注射后5 min，15 min， 30 min， 60 min， 2 h， 4 h和6 h各抽取血液500 μL于肝素化采血管中，按2.2.3和2.2.4節(jié)進行檢測。

3 結果與討論

3.1 PinSHINs的表征

以 UVVis 吸收光譜、TEM及 HRTEM 對 pinSHINs 進行表征（圖2）。pinSHINs的最大紫外吸收峰位于536 nm處，半峰寬較窄，說明粒徑分布較均勻，計算得到的粒徑約為60 nm[27]； TEM表征下pinSHINs的粒徑約為55 nm； HRTEM表征下其Au核外包裹了約為1 nm的SiO2 殼層，在此厚度下，殼層中分布有大量孔隙[25]，氰根可通過孔隙與Au核表面直接接觸[21]，保持了對氰根響應信號的良好增強性能。

3.2 血液氰化物在線裂解吹掃捕集與SERS檢測

目前已報道的氰化物SERS檢測方法中，多存在“溶金”效應，檢測信號僅可穩(wěn)定存在5 min[28]； 且目前尚無血液中氰化物的SERS檢測報道。其難點在于，血液中的氰化物大部分與血細胞內細胞色素氧化酶生成結合態(tài)[29]，難以直接檢測。構建的在線裂解吹掃捕集裝置，以濃H2SO4酸化樣品，可將細胞中結合態(tài)氰化物裂解并轉化為揮發(fā)性的HCN氣體，經N2吹掃至堿液中，形成NaCN，無需任何復雜反應，后續(xù)采用pinSHINs為基底，可對堿性吸收液直接進行SERS檢測，即可得到靈敏且穩(wěn)定的氰根指紋譜信號（圖3A）。

經優(yōu)化后確定，濃H2SO4濃度12 mol/L、NaOH吸收液濃度0.1 mol/L、N2吹掃時間20 min為結合態(tài)氰化物裂解捕集最佳條件。將本方法與本課題組已報道的氰化物在線氫化產氣吹掃方法進行比較[19]，捕集效率提高了10倍（約為77%～81%）（圖3B）。

不同濃度NaCN（100～2000 μg/L）染毒全血實驗結果表明，2135 cm處SERS峰強度與NaCN濃度存在良好線性響應（y=17x+4393； R2=0.997）（圖4A），定量下限低于臨床上發(fā)生中毒反應時血液氰化物濃度（200 μg/L）[9]。低、中、高濃度（200、1000和1500 μg/L）下，本方法相對回收率為91%、106%和108%，RSD值為4.9%、7.6%和4.8%，表明方法可靠性和穩(wěn)定性較好。本方法的檢出限為10 μg/L，低于人血液氰化物致死濃度（LD100）1000 μg/L[27]兩個數量級，即可檢測到0.01 LD100，適合于檢測各種程度的氰化物中毒血液樣品。

常用的AuNPs易與氰化物發(fā)生“溶金”效應，且在強堿性條件下會過度團聚，導致檢測信號迅速衰減，而pinSHINs由于其外層包裹的SiO2殼層，有效削弱了“溶金”效應，且能耐受較寬的pH范圍，因此穩(wěn)定性得到了有效改善，SERS檢測信號1 h后依然可保持80%以上，如圖4B所示。5個批次pinSHINs的穩(wěn)定性采用低、中、高（200、1000和1500 μg/L）3個濃度NaCN加標全血樣品進行評估，氰根信號強度的相對標準偏差（RSD）分別為 6.2%、8.1%和7.7%，表明制備的pinSHINs具有良好的重復性。

3.3 染毒大鼠全血及臨床樣品氰化物濃度的檢測應用實例

利用本方法檢測了50% LD50的NaCN灌胃染毒大鼠不同時間點的全血樣品中氰化物濃度。如圖5A所示， NaCN灌胃10 min后，全血氰化物濃度迅速增加至最大值（2613 μg/L），血液中氰化物半衰期為56 min，與文獻＼[24＼]報道基本相符； 10～30 min氰化物在體內的代謝迅速下降； 30～100 min氰化物代謝緩慢降低； 6 h后，氰化物濃度趨于本底值。未染毒大鼠全血中檢測到少量內源性氰化物（經濃縮富集估算約30 μg/L），可通過隨行標準曲線排除其干擾。

將本方法用于臨床快速篩查氰化物中毒。分析了3份氰化物中毒患者全血樣品，一份為口服KAl（CN）4藥片39 h后的采集血樣（1#），另兩份為注射網購含氰化鉀或氯化琥珀膽堿的“捕狗藥”后的采集血樣（2#，3#），患者送醫(yī)時均深度昏迷，多臟器功能損傷，嚴重者呼吸心跳已經停止。按照本方法進行測定，1#和2#測得氰化物的濃度分別為910和530 μg/L，3#未檢出氰化物（考慮為氯化琥珀膽堿）（圖5B）。 為臨床及時救治提供了參考。

4 結 論

基于殼層隔絕納米粒子的強堿耐受性和能夠有效克服“溶金”效應的優(yōu)勢，以及所構建的在線裂解吹掃捕集裝置，建立了一種氰化物快速檢測SERS新方法，實現中毒全血結合態(tài)氰化物的有效解離、揮發(fā)及吸收，達到了快速、高靈敏定量檢測中毒血液中氰化物的目的。本方法已應用于氰化物灌胃染毒大鼠及臨床氰化物中毒血液樣本檢測，且所有SERS檢測均于便攜式拉曼光譜儀上完成，顯示出在氰化物中毒現場快速檢測良好的應用前景。預期除血液樣品外，本方法亦可適用于食品、環(huán)境復雜基質中的氰化物檢測。

References

1 Barillo D J， Goode R， Esch V. J. Burn Care Rehabil.， 1994， 15（1）： 46-57

2 Baud F J， Barriot P， Toffis V， Riou B， Vicaut E， Lecarpentier Y， Bourdon R， Astier A， Bismuth C. N. Engl. J. Med.， 1991， 325（25）： 1761-1766

3 Gleadow R M. Plant Biol.， 2014， 65（65）： 155-185

4 Conn E E. Effects of Poisonous Plants on Livestock. New York： Academic Press， 1978： 301-310

5 Joint F A O. World Health Organization， WHO Expert Committee on Food Additives. Safety Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants： Prepared by the Seventy Fourth Meeting of the Joint FAO＼[R/OL＼]. 2012： 299＼[2011119＼]

6 Chaudhary M T， Sarwar M， Tahir A M， Tahir M A， Mustafa G， Wattoo S A， Imran M， Subhani A. Australian J. Forensic Sci.， 2015， 48（1）： 42-49

7 XU Hong， SONG YinSheng， CAO WenTing， ZHANG ChunLing. Chin J Health Lab Tec， 2015， 25（11）： 1705-1707

徐 虹， 宋寅生， 曹文婷， 張春玲. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2015， 25（11）： 1705-1707

8 Lundquist P， Srbo B. Clin. Chem.， 1989， 35（4）： 617-619

9 Calafat A M. Stanfill S B. J. Chromatogr. B， 2002， 772（1）： 131-137

10 Chinaka S， Takayama N， Michigami Y， Ueda K. J. Chromatogr. B， 1998， 713（2）： 353-359

11 Lacroix C， Saussereau E， Boulanger F， Goullé J P. J. Anal. Toxicol.， 2011， 35（3）： 143-147

12 Zhu Q X， Cao Y B， Cao Y Y， Chai Y F， Lu F. Anal. Bioanal.Chem.， 2014， 406（7）： 1877-1884

13 LUO ZhiXun， FANG Yan. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2006， 26（2）： 358-364

駱智訓， 方 炎. 光譜學與光譜分析， 2006， 26（2）： 358-364

14 LIU JiangMei， LIU WenHan， TENG YuanJie， YUAN RongHui. Chin. J. Lumin， 2015， 36（12）： 1477-1484

劉江美， 劉文涵， 滕淵潔， 袁榮輝. 發(fā)光學報， 2015， 36（12）： 1477-1484

15 ZUO Qi， CHEN Yao， SHI CaiXia， CHEN ZengPing. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（11）： 1656-1663

左 奇， 陳 瑤， 石彩霞， 陳增萍. 分析化學， 2015， 43（11）： 1656-1663

16 Shi Y E， Wang W S， Zhan J H. Nano Res.， 2016， 9（8）： 2487-2497

17 GAO Jing， WU JianFeng， GAO HaiYue， GUO Lei， XIE JianWei. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（10）： 1465-1470

高 敬， 吳劍峰， 高海月， 郭 磊， 謝劍煒. 分析化學， 2014， 42（10）： 1465-1470

18 Gao H Y， Wu J F， Zhu Y J， Guo L， Xie J W. J. Raman. Spectrosc.， 2015， 47（2）： 233-239

19 Zhu Y J， Wu J F， Gao H Y， Liu G K， Tian Z Q， Feng J L， Guo L， Xie J W. RSC Adv.， 2016， 6（65）： 59919-59926

20 Li J F， Huang Y F， Ding Y， Yang Z L， Li S B， Zhou X S， Fan F R， Zhang W， Zhou Z Y， Ren B. Nature， 2010， 464（7287）： 392-395

21 Gao J， Guo L， Wu J F， Feng J L， Wang S M， Lai F L， Xie J W， Tian Z Q. J. Raman. Spectrosc.， 2014， 45（8）： 619-626

22 Lundquist P， Rosling H， Srbo B. Clin. Chem.， 1985， 31（4）： 591-595

23 Hughes C， Lehner F， Dirikolu L， Harkins D， Boyles J， McDowell K， Tobin T， Crutchfield J， Sebastian M， Harrison L. Toxicol. Mechanisms Method， 2008， 13（2）： 129-138

24 Frens G. Nature， 1973， 241（105）： 20-22

25 Li J F， Tian X D， Li S B， Anema J R， Yang Z L， Ding Y， Wu Y F， Zeng Y M， Chen Q Z， Ren B. Nat. Protoc.， 2013， 8（1）： 52-65

26 Sousa A B， Manzano H， Sotoblanco B， Górniak S L. Arch. Toxicol.， 2003， 77（6）： 330-334

27 Haiss W， Thanh N T K， Aveyard J， Fernig D G. Anal. Chem.， 2007， 79（11）： 4215-4221

28 Senapati D， Dasary S S R， Signh A K， Senapati T， Yu H， Ray P C. Chem. Eur J.， 2001， 17（30）： 8445-8451

29 Vesey C J， Wilson J. J. Pharm. Pharmac.， 1978， 30（1）： 20-26