張玉然 張曉云 郭蘭英 張海林

（1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院 山東日照 276826 2山東徐旭酒曲有限公司 山東濟(jì)寧 272000）

酸性α－淀粉酶屬于液化酶（α－淀粉酶）的一種，可在低pH值條件下隨機(jī)切斷淀粉分子內(nèi)的α－1，4糖苷鍵，迅速將其降解為糊精、寡糖等小分子［1－2］。 酸性 α－淀粉酶廣泛應(yīng)用于釀酒、制糖、紡織、飼料、造紙等行業(yè)，具有良好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益［3］。

在淀粉質(zhì)原料的水解制糖工藝中，由于α－淀粉酶和糖化酶最適反應(yīng)pH值的差異，淀粉質(zhì)原料液化后進(jìn)入糖化前需加入大量酸試劑調(diào)低pH值。開發(fā)耐酸性的α－淀粉酶，使其最適反應(yīng)pH值與糖化酶相近，可節(jié)省大量酸試劑的消耗，節(jié)約成本［4－5］。

目前，研究者對(duì)黑曲霉和枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)酸性α－淀粉酶的研究較多，并通過(guò)多種方法選育獲得了高產(chǎn)菌株，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、紡織和環(huán)境治理等領(lǐng)域［6－8］。 但在釀酒行業(yè)，由于白酒香味和口感的特殊需求，常利用河內(nèi)白曲霉（Hanoiwhite starter）固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)酸性α－淀粉酶，并將生產(chǎn)出的含酸性α－淀粉酶的固態(tài)白曲直接應(yīng)用于白酒生產(chǎn)。目前研究者對(duì)該菌株的研究較少，固態(tài)發(fā)酵的酸性α－淀粉酶酶活力普遍較低，篩選具有高產(chǎn)酸性α－淀粉酶能力的河內(nèi)白曲霉勢(shì)在必行。

本研究以河內(nèi)白曲霉為出發(fā)菌株，采用不同濃度的DES誘變處理萌發(fā)過(guò)夜的河內(nèi)白曲霉孢子，后根據(jù)透明圈法篩選高產(chǎn)突變株，進(jìn)一步搖瓶復(fù)篩，以期獲得產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好的河內(nèi)白曲霉突變株。

1 材料與方法

1.1 材料

1）菌種。河內(nèi)白曲霉為實(shí)驗(yàn)室保存。

2）培養(yǎng)基。

①改良的PDA培養(yǎng)基：土豆浸出汁 30%，瓊脂 2%，自然pH值。②篩選培養(yǎng)基：玉米淀粉2%，酵母 0.5%，KCl 0.1%，KH2PO40.03%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0002%，瓊脂 2%，pH 6.5～7.0。③固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮12.5 g，自來(lái)水12.5 mL，置于500 mL三角燒瓶。

1.2 菌株的誘變篩選

1.2.1 孢子懸液的制備 于麥芽汁斜面培養(yǎng)基中刮取孢子，加入含25 mL 2 g/L葡萄糖的三角瓶中，混勻打散，稀釋至孢子數(shù)為107CFU/mL，于室溫下靜置萌發(fā)過(guò)夜。

1.2.2 DES誘變及初篩 取5 mL過(guò)夜萌發(fā)的孢子懸液，分別加入DES至終濃度為0%、1%、3%、5%、6%、7%、9%、12%，混勻，30℃，220 r/min 振蕩處理20 min后，各組分別加入等體積的25%Na2S2O3溶液終止反應(yīng)。將誘變處理后的孢子懸液適當(dāng)稀釋，涂布于篩選培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)3～4 d，以未經(jīng)誘變處理的出發(fā)菌株為對(duì)照，計(jì)算致死率。挑選長(zhǎng)勢(shì)良好、透明圈與菌落直徑比值（HC）較大的單菌落進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.3 搖瓶復(fù)篩 挑取2環(huán)孢子，接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)，分別于第 24 h、36 h、48 h各翻曲一次，測(cè)定不同突變株酸性α－淀粉酶的酶活力。

1.2.4 傳代培養(yǎng) 將誘變篩選出的突變株連續(xù)傳代培養(yǎng)，測(cè)定各批次酸性α－淀粉酶酶活力。

1.3 酶活力測(cè)定 方法參照相關(guān)參考文獻(xiàn)［9］進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度DES的致死率 誘變育種是獲得高產(chǎn)菌株的常用方法［10－11］，將誘變致死率控制在75%～85%時(shí)誘變效果較佳，易獲得高產(chǎn)突變菌。利用不同濃度DES處理河內(nèi)白曲霉孢子20 min后的致死率曲線如圖1所示。由圖1可知，使用1%DES誘變處理20 min時(shí)，對(duì)河內(nèi)白曲霉的致死率為84.3%。

圖1 不同濃度DES誘變河內(nèi)白曲霉的致死率

2.2 高產(chǎn)酸性α－淀粉酶突變株的初篩 將1%DES誘變處理20 min的河內(nèi)白曲霉孢子懸液適當(dāng)稀釋涂布，培養(yǎng)觀察并計(jì)算HC比值。從502株突變株中挑選出HC比值較高的突變株列于表1，可知突變株Hanoi white starter 4的HC比值最大，且長(zhǎng)勢(shì)良好。

表1 酸性α-淀粉酶高產(chǎn)突變株的初篩

2.3 高產(chǎn)酸性α－淀粉酶突變株的搖瓶復(fù)篩 對(duì)表1中初篩獲得的突變株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，各突變株發(fā)酵產(chǎn)酸性α－淀粉酶的能力如表2所示?？芍琀anoiwhite starter 4發(fā)酵酶活力最高，達(dá)20.8 U/g，較出發(fā)菌株提高了61.2%，這也與其HC比值最高相對(duì)應(yīng)。

表2 高產(chǎn)酸性α-淀粉酶突變株的復(fù)篩

2.4 突變株Hanoi white starter 4的遺傳穩(wěn)定性將高產(chǎn)酸性α－淀粉酶的突變株Hanoi white starter 4于麩皮固體發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)6次，測(cè)定每批次的酸性α－淀粉酶酶活力，結(jié)果如圖2所示?？芍摼戤a(chǎn)酸性α－淀粉酶的遺傳穩(wěn)定性良好，可用于后續(xù)工業(yè)放大生產(chǎn)。

圖2 高產(chǎn)酸性α-淀粉酶突變株的遺傳穩(wěn)定性

3 結(jié)論

在釀酒行業(yè)，鑒于酒品質(zhì)的高要求，該行業(yè)常使用河內(nèi)白曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)酸性α－淀粉酶，為使淀粉質(zhì)原料水解制糖工藝中α－淀粉酶和糖化酶最適反應(yīng)pH值相近，節(jié)省大量酸試劑的消耗，節(jié)約成本，篩選耐酸性的α－淀粉酶十分必要。本研究以河內(nèi)白曲霉為出發(fā)菌株，采用不同濃度DES誘變處理萌發(fā)的河內(nèi)白曲霉孢子，根據(jù)透明圈大小初篩、搖瓶復(fù)篩高產(chǎn)酸性α－淀粉酶的突變株。研究結(jié)果表明，將萌發(fā)的孢子于1%DES處理20 min后，對(duì)河內(nèi)白曲霉的致死率為84.3%，后經(jīng)涂布篩選獲得一株高產(chǎn)酸性α－淀粉酶的突變株Hanoi white starter 4，發(fā)酵后酶活力達(dá)20.8 U/g，較出發(fā)菌株提高61.2%。該突變株產(chǎn)酸性α－淀粉酶的遺傳穩(wěn)定性良好，可用于后續(xù)工業(yè)放大生產(chǎn)。

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