馬蘇嫻，張銳銳，王蘇，鄧家良，楊祿，袁國躍

(1江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2天益健康科學(xué)研究院)

2型糖尿病患者腸道菌群變化及意義

馬蘇嫻1，張銳銳2，王蘇1，鄧家良1，楊祿2，袁國躍1

(1江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2天益健康科學(xué)研究院)

目的 探討2型糖尿病(T2DM)患者腸道菌群變化的臨床意義。方法 選取8例T2DM患者與10例體檢健康者，提取其糞便基因組DNA，應(yīng)用菌屬16S rRNA V4序列特異性引物，采用高通量測序技術(shù)分析腸道菌群多樣性(以香農(nóng)多樣性指數(shù)表示)及種類(以豐度表示)。觀察不同性別T2DM患者的腸道菌群種類差異，分析T2DM患者腸道優(yōu)勢菌屬與空腹血糖(FPG)、餐后1 h血糖(1 h PG)和餐后2 h血糖(2 h PG)的關(guān)系。結(jié)果 T2DM患者與體檢健康者香農(nóng)多樣性指數(shù)分別為3.70±0.29、3.30±0.20，二者比較P>0.05。門水平下T2DM患者和體檢健康者的腸道共同優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，二者上述4種優(yōu)勢菌門豐度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。屬水平下T2DM患者和體檢健康者的腸道共同優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬和毛螺桿菌科，體檢健康者羅斯氏菌屬豐度高于T2DM患者(P<0.05)。女性T2DM患者擬桿菌屬科豐度高于男性患者，假單胞菌屬豐度低于男性患者(P均<0.05)。T2DM患者柔嫩梭菌屬豐度與2 h PG呈正相關(guān)(r=0.75，P<0.05)，其他腸道優(yōu)勢菌屬與FPG、1 h PG、2 h PG均無關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論 T2DM患者腸道內(nèi)存在菌群失調(diào)，并具有性別差異；柔嫩梭菌屬與血糖水平有關(guān)，可為T2DM的治療提供一種新的思路。

2型糖尿?。荒c道菌群；腸道優(yōu)勢菌屬；豐度；血糖；高通量測序

研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病(T2DM)的發(fā)生不僅與人類基因組差異、飲食結(jié)構(gòu)改變及運(yùn)動量減少有關(guān)，亦與腸道菌群改變有關(guān)[1]。T2DM患者多伴有糖脂代謝紊亂，而腸道菌群與宿主之間在調(diào)節(jié)能量平衡方面聯(lián)系密切。高通量測序技術(shù)多用于檢測腸道菌群的結(jié)構(gòu)及多樣性，具有快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)[2]。本研究采用高通量測序技術(shù)觀察T2DM患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性變化，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年9月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院收治的T2DM患者8例，男4例、女4例，年齡40～70歲?；颊呔蟇HO關(guān)于T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，排除妊娠糖尿病、特殊類型糖尿病以及合并其他系統(tǒng)性疾病者。選擇同期體檢健康者10例，男5例、女5例，年齡40～70歲。研究對象采樣前3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素，近2周內(nèi)未服用益生元、益生菌等制品，近3個(gè)月內(nèi)無腹瀉、便秘、痢疾等胃腸道疾病。

1.2 腸道菌群檢測 采用高通量測序技術(shù)。受試者于環(huán)境溫度不高于10 ℃的條件下，采集潔凈糞便于儲存盒內(nèi)，并進(jìn)行密封。于2級生物安全柜內(nèi)稱取0.25 g糞便樣本，2 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。采用PowerSoil?-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit提取試劑盒(美國MoBio公司)，根據(jù)試劑盒說明書提取糞便基因組DNA，檢測其質(zhì)量合格后于-20 ℃保存。利用帶有barcode的特異性引物擴(kuò)增16S rDNA的V4區(qū)域，并進(jìn)行精確定量和純化回收。構(gòu)建好的文庫經(jīng)過精確定量和Agilent 2200質(zhì)檢合格后，采用Illumina v3 kit(2×300)于MiSeq(美國Illumina公司)上機(jī)檢測腸道菌群。方法如下：采用微生物16S rRNA分析管道(QIIME)將優(yōu)質(zhì)序列聚類成操作分類單元(OTUs)，并對所有樣品的優(yōu)質(zhì)序列按0.97的相似度進(jìn)行OTUs聚類，選取每一類中最長的序列作為其代表序列。采用RDP-classifier對OTUs代表序列進(jìn)行注釋，得到每個(gè)OTUs的分類學(xué)信息。統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品中的OTUs分類數(shù)量，應(yīng)用Mothur軟件(version 1.36.0) 計(jì)算針對單個(gè)樣品物種多樣性分析的香農(nóng)多樣性指數(shù)。香農(nóng)多樣性指數(shù)越大，說明樣品中的物種越豐富[3]。于門水平及屬水平下對OTUs數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，并計(jì)算門水平和屬水平下的菌群豐度(即該菌群在總體菌群中的比例，以百分率表示)。對不同性別T2DM患者的OTUs進(jìn)行分類匯總，計(jì)算腸道菌群豐度。記錄T2DM患者的腸道優(yōu)勢菌屬，分析其豐度與患者空腹血糖(FPG)、餐后1 h血糖(1 h PG)和餐后2 h血糖(2 h PG)的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以四分位數(shù)法表示，結(jié)果比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OTUs分類數(shù)量及多樣性 T2DM患者與體檢健康者OTUs分類數(shù)量分別為447.50±36.78、386.60±15.26，香農(nóng)多樣性指數(shù)分別為3.70±0.29、3.30±0.20，二者比較P均>0.05。

2.2 門水平下的腸道菌群結(jié)構(gòu) 門水平下T2DM患者和體檢健康者的腸道共同優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，二者上述4種優(yōu)勢菌門豐度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 T2DM患者和體檢健康者門水平下的腸道優(yōu)勢菌門豐度[M(P25,P75)]

2.3 屬水平下的腸道菌群結(jié)構(gòu) 屬水平下T2DM患者的腸道優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬、毛螺桿菌科、瘤胃球菌科和埃希氏菌屬等，體檢健康者的腸道優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬、擬桿菌屬、毛螺桿菌科和Blautia等。擬桿菌屬和毛螺桿菌科是T2DM患者和體檢健康者的腸道共同優(yōu)勢菌屬，體檢健康者羅斯氏菌屬豐度高于T2DM患者(P<0.05)。見表2。

2.4 不同性別T2DM患者的腸道菌群結(jié)構(gòu) 男性T2DM患者的腸道優(yōu)勢菌群為擬桿菌屬、瘤胃球菌科、毛螺桿菌科、埃希氏菌屬、梭菌目、普雷沃氏菌屬等，女性患者的腸道優(yōu)勢菌群為擬桿菌屬、毛螺桿菌科、埃希氏菌屬等。擬桿菌屬、毛螺桿菌科和埃希氏菌屬為男女性T2DM患者的腸道共同優(yōu)勢菌群。女性T2DM患者擬桿菌屬豐度高于男性患者，假單胞菌屬豐度低于男性患者(P<0.05)。見表3。

2.5 T2DM患者血糖與腸道優(yōu)勢菌屬豐度的關(guān)系 T2DM患者柔嫩梭菌屬豐度與2 h PG呈正相關(guān)(r=0.75，P<0.05)，與FPG、1 h PG均無關(guān)(P均>0.05)。T2DM患者其他腸道優(yōu)勢菌屬豐度與FPG、1 h PG、2 h PG均無關(guān)(P均>0.05)。見表4。

表2 T2DM患者和體檢健康者屬水平下的腸道優(yōu)勢菌屬豐度比較[M(P25,P75)]

表3 不同性別T2DM患者的腸道菌群豐度比較[M(P25,P75)]

3 討論

腸道菌群是人體微環(huán)境的重要組成部分， 也是最大、最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，其多樣性可能是宿主和腸道菌群之間強(qiáng)烈選擇和協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果[4]。腸道中的正常菌群能夠?yàn)樗拗魈峁┗蚝铣梢恍I養(yǎng)要素，如B族維生素、葉酸、生物素等[5]。隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，腸道菌群不僅與營養(yǎng)相關(guān)，也與人體健康和疾病發(fā)生有著極為密切的聯(lián)系。腸道正常菌群與腸黏膜緊密結(jié)合，構(gòu)成腸道的生物屏障，能夠通過營養(yǎng)競爭、占位效應(yīng)及其代謝產(chǎn)物等抑制條件致病菌的過度生長和外來致病菌的入侵，從而維持腸道菌群平衡[6]。研究表明，腸道菌群與肥胖[7，8]、糖尿病[9]、心腦血管疾病[10，11]和腫瘤[12]等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

表4 T2DM患者血糖相關(guān)指標(biāo)與腸道優(yōu)勢菌屬豐度的關(guān)系

注：*P<0.05。

目前臨床采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法培養(yǎng)的細(xì)菌僅占腸道菌群的1%～10%，并不能反映菌群的多樣性[13]；變性梯度凝膠電泳、熒光定量PCR技術(shù)也只能檢測出一定豐度以上的細(xì)菌或特定微生物[14，15]。高通量測序技術(shù)又稱下一代測序技術(shù)，是在第一代Sanger測序基礎(chǔ)上發(fā)展而來的新興測序技術(shù)，能夠一次性對高達(dá)數(shù)百萬條的DNA序列進(jìn)行測定，使得對菌群進(jìn)行全面細(xì)致的分析成為可能。以Illumina為測序平臺的測序技術(shù)在研究人類腸道宏基因組方面發(fā)揮重要作用[5，16]。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和變性梯度凝膠電泳等分子生物學(xué)方法不同，高通量測序技術(shù)能更全面地反映微生物群體的物種組成、分布及豐度信息。

Karlsson等[17]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者腸道菌群的結(jié)構(gòu)、功能與血糖、糖耐量異常均有關(guān)。 Larsen等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，T2DM患者糞便中β-變形菌豐度明顯升高，擬桿菌門與硬壁菌門的比值以及普氏擬桿菌與腸球菌的比值與血糖水平呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者與健康人群門水平的4種優(yōu)勢菌門豐度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但T2DM患者屬水平腸道菌群的豐度與健康人群存在一定的差異，尤其是可以產(chǎn)生丁酸的羅斯氏菌屬豐度顯著低于健康人群。丁酸是腸道上皮細(xì)胞重要的能量來源，菌羅斯氏菌、Blautia屬、假丁酸弧菌屬和柔嫩梭菌都是人腸道內(nèi)重要的丁酸產(chǎn)生菌。Qin等[19]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸產(chǎn)生菌是區(qū)別健康人群與T2DM患者的重要菌群。本研究還發(fā)現(xiàn)，T2DM患者柔嫩梭菌屬豐度與2 h PG呈正相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。本研究女性T2DM患者腸道中的優(yōu)勢菌屬明顯少于男性患者，擬桿菌屬豐度高于男性患者，假單胞菌屬豐度低于男性患者，說明男女性T2DM患者的腸道菌群存在差異。以上結(jié)果均提示，腸道菌群在T2DM的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用，但是具體機(jī)制尚不清楚；雖然男女性T2DM患者血糖均升高，但其升高的機(jī)制可能存在差異。本研究T2DM患者門水平下變形菌門豐度有高于健康人群的趨勢，屬水平下Blautia和假丁酸弧菌屬豐度有低于健康人群的趨勢，擬桿菌屬和埃希氏菌屬豐度有高于健康人群的趨勢，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與本研究納入例數(shù)較少有關(guān)，仍需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，T2DM患者腸道內(nèi)存在菌群失調(diào)，并具有性別差異；柔嫩梭菌屬與血糖水平有關(guān)，可為T2DM的治療提供一種新的思路。

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Variation of intestinal flora in patients with type 2 diabetes mellitus and the significance

MASuxian1,ZHANGRuirui,WANGSu,DENGJialiang,YANGLu,YUANGuoyue

(1AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China)

Objective To detect the variation of intestinal flora in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and the clinical significance. Methods The fecal samples were collected from 8 T2DM patients and 10 healthy participants. Total DNA was extracted from stool samples and submitted to high-throughput sequencing with primers targeting V4 region of the 16s rRNA gene. High-throughput sequencing was used to analyze the abundance and diversity of fecal microbiota. The difference of intestinal flora in patients with different gender, and the relationship between the dominant bacteria in the T2DM patients and fasting plasma glucose (FPG), 1 hour postprandial blood glucose (1h PG) and 2 hour postprandial blood glucose (2h PG) were investigated. Results The Shannon diversity index of T2DM patients and healthy subjects was 3.70±0.29 and 3.30±0.20, respectively, and there was no significant difference between the two groups (P>0.05). The dominant bacteria in the two groups were Firmicutes, Bacteroides, Proteobacteria, Actinobacteria at phylum level, and there was no significant difference in the abundance between the two groups (allP>0.05). In addition, the dominant bacteria were Bacteroides and Lachnospiraceae in the two groups at genus level. Compared with healthy subjects, the abundance of Roseburia was significantly reduced in the T2DM patients (P<0.05). The abundance of the Bacteroides in the female T2DM patients was much higher than that of the male patients, while the abundance of Peptostreptococcaceae was much lower than that of the male patients (P<0.05). The abundance of Faecalibacterium was positively correlated with 2 h PG (r=0.75,P<0.05), and the other dominant bacteria were not correlated with FPG, 1 h PG, 2 h PG (allP>0.05). Conclusion T2DM patients show intestinal flora imbalance with gender differences, and the abundance of Faecalibacterium in T2DM patients is related to blood glucose, which may provide a new therapeutic approach for T2DM.

type 2 diabetes mellitus; intestinal flora; intestinal dominant fungi; abundance; blood glucose; high-throughput sequencing

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81570721、81370965)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20151331)；“六大人才高峰”第十二批高層次人才項(xiàng)目(2015-WSN-006)；鎮(zhèn)江市科技支撐-社會發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目(SH2015028)。

馬蘇嫻(1991-)，女，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)閮?nèi)分泌代謝性疾病的診斷與治療。E-mail: 839282375@qq.com

袁國躍(1971-)，男，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)閮?nèi)分泌代謝性疾病的診斷與治療。E-mail: yuanguoyue@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.006

R587.1

A

1002-266X(2017)16-0020-04

2016-07-15)