伊雪佳++黃先菊++余友++陳慧++李梅++周歡

摘 要：目的 探討黃秦艽中活性成分D1對雪上一枝蒿總生物堿（CFA）所致的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 用噻唑藍(lán)（MTT）比色法測定細(xì)胞活力，試劑盒測定乳酸脫氫酶（LDH）活力，蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測Bcl-2表達(dá)水平。結(jié)果 CFA孵育24 h可劑量依賴性降低PC12細(xì)胞存活率。D1（6.25～25 μg/mL） 預(yù)孵育2 h可顯著抑制CFA所致的PC12細(xì)胞損傷和LDH釋放，當(dāng)D1濃度為6.25 μg/mL和25 μg/mL時(shí)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯上升。結(jié)論 D1可通過修復(fù)損傷的線粒體及調(diào)節(jié)相應(yīng)凋亡蛋白表達(dá)保護(hù)CFA所致的PC12損傷。

關(guān)鍵詞：雪上一枝蒿 黃秦艽 神經(jīng)細(xì)胞 毒性 保護(hù)

中圖分類號：R742.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2017）05（a）-0246-02

雪上一枝蒿是毛茛科烏頭屬（Aconitum）植物短柄烏頭的干燥塊根，又名鐵棒錘，臨床上用來治療風(fēng)寒濕痹所致的筋骨和關(guān)節(jié)疼痛、跌打損傷所致的瘀血疼痛等[1]。常見誤用、濫用中毒致死的情況[2]。

龍膽科黃秦艽屬植物黃秦艽（Veratrilla baillonii），是云南地方習(xí)用中草藥，具有清熱解毒功效[3]。該文旨在通過觀察黃秦艽中活性成分D1對雪上一枝蒿總生物堿（CFA）所致的PC12細(xì)胞損傷的影響，初步評價(jià)其對CFA所致神經(jīng)細(xì)胞毒性的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

354型全自動酶標(biāo)儀，上海Thermo公司制造；DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳儀，北京六一公司制造。

1.2 藥物與試劑

龍膽苦苷（批號：20150614）與獐芽菜苷（批號：20150702）標(biāo)準(zhǔn)品購自上海原葉公司；噻唑藍(lán)（MTT，批號：20150321，Sigma公司）；LDH試劑盒（批號：A020-2，南京建成公司）；BCA試劑盒（批號：P0012S，北京普利萊公司）；β-actin（批號：20150610）和Bcl-2抗體（批號：20150522）購自Cell Signal公司；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 活性成分檢測方法

黃秦艽購自云南大理，其活性成分D1由該實(shí)驗(yàn)室制備。供試品及單體對照品用甲醇溶解濾過。檢測條件：Thermo Scientific Syncronis C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為28%乙腈-水，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL /min，檢測結(jié)果顯示，黃秦艽活性成分D1為龍膽苦苷與獐芽菜苷的混合物。

2.1.2 藥物預(yù)處理方法

將PC12細(xì)胞接種于96孔板中。（1）不同濃度（6.25～25 μg/ml）的D1單獨(dú)孵育24 h。（2）CFA 100 μg/mL孵育24 h。（3）不同濃度（6.25～25 μg/mL）的D1預(yù)孵育2 h后，再用CFA 100 μg/mL孵育24 h。

2.1.3 MTT法測定細(xì)胞活力

細(xì)胞加入MTT 使之終濃度為0.5 mg/mL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，加入150 μL DMSO溶解，震蕩后于酶標(biāo)儀570 nm處檢測OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=（給藥組OD570值/空白對照組OD570值）×100%。

2.1.4 LDH活性檢測

藥物處理后，取上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行LDH活性檢測。

2.1.5 Western blot免疫印跡法檢測Bcl-2表達(dá)水平

提取細(xì)胞總蛋白并測定濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜。再用5%脫脂奶粉封閉1 h。洗膜，加入目的一抗置于冰盒搖床震蕩過夜。次日，回收一抗，加入過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG震蕩2 h。洗膜后凝膠成像系統(tǒng)拍照。以β- actin作為內(nèi)參。

2.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以來表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SPSS 18.0軟件，ANOVA法比較組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 結(jié)果

2.2.1 D1對PC12細(xì)胞及染毒PC12細(xì)胞活力的影響

圖1A顯示，CFA孵育24 h后可劑量依賴性降低細(xì)胞存活率，各濃度D1對細(xì)胞存活率則無明顯影響（見圖1B）；D1（6.25～25 μg/mL）預(yù)孵育2 h可減輕CFA所致的細(xì)胞存活率明顯下降（見圖1C）和LDH 釋放增高（見圖1D）。

2.2.2 D1對染毒PC12細(xì)胞表達(dá)Bcl-2的影響

如圖2所示，與空白對照組相比，染毒組中Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯下降；6.25～25 μg/mL 的D1使Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯上升。

3 討論

烏頭類神經(jīng)毒性可能與神經(jīng)遞質(zhì)紊亂有關(guān)。LDH大量存在于神經(jīng)元的胞質(zhì)和線粒體中，當(dāng)腦細(xì)胞缺血缺氧時(shí)，乳酸脫氫酶通過受損的血-腦脊液屏障進(jìn)入血液。Bcl-2基因表達(dá)產(chǎn)物可通過抗氧化，抑制線粒體細(xì)胞色素C釋放，抑制促凋亡基因的作用來抑制細(xì)胞凋亡。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃秦艽中的活性組分D1可降低CFA引起的細(xì)胞凋亡與壞死，其作用機(jī)制與減少細(xì)胞LDH釋放，抑制凋亡相關(guān)基因Bcl-2，進(jìn)而修復(fù)CFA所致的線粒體損傷等有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃先菊，胡超，蘇慧娟，等.鐵棒錘氯仿部位的毒-效關(guān)系研究[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，33（3）：53-56.

[2] 陳芙蓉，鄒大江，閃仁龍，等.近10年含烏頭堿類植物中毒原因及解毒辦法文獻(xiàn)分析[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，23（12）：3116-3118.

[3] 賈敏如，李星煒.中國民族藥志要[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005：182.