史經昂，張兵，肖曉琳，馬晶晶，楊向陽，劉建秀

(江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇 南京 210014)

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結縷草肉桂醇脫氫酶基因家族全基因組序列鑒定和表達分析

史經昂，張兵*，肖曉琳，馬晶晶，楊向陽，劉建秀

(江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇 南京 210014)

肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD,EC 1.1.1.195)是植物木質素合成途徑的關鍵酶，通過消耗NADPH，將松柏醛等復雜醛轉化成相應的醇單體，在植物生長發(fā)育過程和逆境應答中起到重要作用。本研究從結縷草基因組中鑒定獲得了16個肉桂醇脫氫酶(ZjCAD)基因，對其進行了系統(tǒng)進化與基因結構的生物信息學分析。半定量PCR分析顯示5個ZjCAD基因在葉片中特異表達，木質素染色結合不同種源材料ZjCAD基因的表達分析進一步表明ZjCAD6的表達與葉片木質素含量正相關，提示ZjCAD6可能為控制結縷草葉片木質素合成的關鍵基因。ZjCAD6基因全長2736 bp，有3個內含子和4個外顯子，開放閱讀框為1074 bp，編碼357個氨基酸。ZjCAD6蛋白含有兩個Zn2+結合位點與一個NADP(H)結合結構域，與已報道的其他植物具催化活性的CAD蛋白特征一致。上述結果為進一步研究結縷草葉片木質素含量及其機械強度等性狀形成的分子機理提供了重要的參考。

結縷草；木質素；肉桂醇脫氫酶；生物信息學分析；基因表達

結縷草(Zoysiajaponica)是一種優(yōu)良的多年生暖季型草坪草，具有發(fā)達的根狀莖和匍匐莖，被廣泛應用于庭院草坪、運動場草坪、保土草坪等各種草坪的建植中。在幾種暖季型草坪草中，結縷草具有優(yōu)良的耐踐踏能力，葉片近革質，其木質素含量顯著高于雜交狗牙根(Cynodondactylonvar.dactylon×C.transvaalensiscv.)和海雀稗(Paspalumvaginatum)[1]。

木質素是高等植物細胞壁的重要組成成分，主要存在于次生細胞壁中，可以提高細胞壁的強度，為植物組織提供機械支撐。木質素還和植物長距離的運輸營養(yǎng)和水分、抵御病蟲害等生理功能密切相關。在被子植物中，木質素主要由松柏醇衍化的愈創(chuàng)木基(G)型單體、芥子醇衍化的紫丁香基(S)單體以及對香豆醇衍化的對羥基苯基(H)單體構成，3種單體通過β-O-4醚鍵、C-C鍵、聯(lián)苯醚鍵聚合成復雜的高分子聚合物[2-4]。

苯丙氨酸途徑是植物木質素生物合成的主要途徑，這個過程中涉及多種酶：苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)[5]、肉桂酸-4-羥基化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase,C4H)[6]、4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase,4CL)[7]、3-羥基肉桂酰轉移酶(p-coumarate 3-hydroxylase,C3H)[8]、咖啡酸-O-甲基轉移酶(caffeic acid O-methyltransferase,COMT)[9]、阿魏酸-5-羥基化酶(ferulate-5-hydroxylase,F5H)[10]、肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)[11-12]等。CAD是木質素生物合成途徑的關鍵限速酶之一，在單體合成反應的最后一步將不同醛單體催化成相應的醇單體[13]。CAD基因以多基因家族形式存在植物體中，自第一個CAD基因從煙草(Nicotianatabacum)莖段中獲得以來[14]，多種植物的CAD基因均被廣泛研究。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)的9個CAD基因中，CAD4、CAD5被發(fā)現(xiàn)是控制木質素生物合成的主要基因[15-16]，AtCAD1則與擬南芥莖延伸過程中的木質化相關[17]。水稻(Oryzasativa) 12個CAD基因中，OsCAD2在木質素合成途徑中起最主要的作用，表達譜分析發(fā)現(xiàn)其在節(jié)間、葉鞘、根中高表達[14]。玉米(Zeamays) bm1突變體中木質素含量和結構都發(fā)生了改變，并使葉脈與莖的厚壁組織變成紅褐色，這一突變最終被定位在CAD基因上[18]。CAD-RNAi導致玉米植株總木質素減少，但并未影響植株的生長發(fā)育[19]。其他多種植物如柳枝稷(Panicumvirgatum)[11]、煙草[2,14]、白楊(Populustomentosa)[20]、高粱(Sorghumbicolor)[21]等的CAD基因和木質素合成的關系也得到了初步的研究。然而，結縷草等暖季型草坪草的CAD基因的研究卻鮮有報道。

在本研究中，我們首次對結縷草CAD基因家族16個ZjCAD基因的系統(tǒng)進化關系、基因結構和組織表達特異性進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)5個ZjCAD基因在結縷草葉片中優(yōu)勢表達。在不同種源材料中，ZjCAD6基因的表達豐度和木質素含量呈正相關，提示ZjCAD6是決定結縷草葉片木質素含量的關鍵基因。這一研究結果為解析結縷草葉片機械強度和耐踐踏性狀形成的分子機理提供了重要線索。

1 材料與方法

1.1 植物材料

結縷草品種(Zenith,Meyer)，野生種源材料(Z103、Z112)種植于南京中山植物園試驗地(32°02′ N,118°28′ E;海拔30 m)。采用標準的施肥、灌溉、修剪、除蟲等養(yǎng)護措施。取直立枝展開葉第二葉位的葉片用于RNA提取和木質素染色，材料來源見表1。

1.2CAD基因的序列獲取與生物信息學分析

以已報道的擬南芥和水稻CAD基因為探針[18]，通過本地同源BLAST搜索[22]結縷草基因組數據庫(http://zoysia.kazusa.or.jp/)[23]，E值設定為

將獲取的結縷草ZjCAD基因與擬南芥AtCAD基因、水稻OsCAD基因進行生物信息學分析比較。系統(tǒng)進化樹采用Megalign軟件進行、蛋白結構域通過Pfam分析獲得、內含子外顯子分析通過GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進行。

1.3 RNA提取與cDNA合成

使用植物RNA提取試劑盒(Omega,USA)提取結縷草不同組織RNA，提取方法參照試劑盒說明書進行。使用RNase-Free DNase Set(BBI,China)消化基因組DNA。使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara,Japan)逆轉錄合成cDNA。

1.4ZjCAD基因在結縷草不同組織和不同種源材料的表達分析

以cDNA為模板，用特異性引物進行PCR擴增(引物設計見表2),以結縷草肌動蛋白actin基因為內參，分析不同ZjCAD基因在不同組織和不同種源材料的表達情況。

表2 ZjCAD基因表達引物Table 2 Set of primers for ZjCAD genes expression

1.5 木質素組織化學染色

取展開葉第二葉位葉片，于葉基部1 cm處用雙面刀片切取厚度約100 μm的薄片。染色方法采用Wiesner染色法，將超薄切片置于2%間苯三酚(無水乙醇溶解)中染色2 min，置于載玻片上滴加1滴25%鹽酸，立即封片鏡檢。

2 結果與分析

2.1ZjCAD基因家族生物信息學分析

如表3所示，通過本地blast分析和Pfam結構域確認，我們總共在結縷草基因組中發(fā)現(xiàn)了16個CAD基因，其編碼蛋白氨基酸殘基數范圍為196～576個，與玉米ZmCAD2基因相似度在42%～92%之間。為了更好地了解結縷草CAD基因家族的序列變異情況，我們將16個ZjCAD基因與12個水稻OsCAD基因和9個擬南芥AtCAD基因進行了進化樹的分析。如圖1所示，系統(tǒng)進化樹分析結果表明結縷草CAD基因存在高度的重復擴增現(xiàn)象，如AtCAD1基因在水稻中有OsCAD1和OsCAD4兩個同源基因，而在結縷草中其同源基因數量進一步增加至3個。基因結構分析顯示結縷草CAD基因家族不同成員內含子數量差異巨大，所含內含子數量從0到6均有分布。蛋白結構域分析則進一步表明，除ZjCAD3和ZjCAD7外所有ZjCAD基因編碼蛋白均含有1個醇脫氫酶結構域和1個輔分子伴侶結構。

表3 結縷草CAD基因家族信息Table 3 The information of CAD gene family in Z.japonica

2.2ZjCAD基因在不同結縷草種質不同組織中的表達特征

利用RT-PCR方法，我們進一步對結縷草CAD基因家族不同成員的組織表達模式進行了分析，結果如圖2所示。在16個ZjCAD基因中，除ZjCAD3、ZjCAD5、ZjCAD8A和ZjCAD8B 4個基因外，其他12個基因均在一個或多個組織中表達。12個基因中，ZjCAD1B、ZjCAD2B為持家基因，在根、莖、葉中均高表達。ZjCAD8E在根中特異性表達，ZjCAD2A在根和莖中優(yōu)勢表達，而ZjCAD4、ZjCAD6、ZjCAD7、ZjCAD8C、ZjCAD8D則均在葉中有著較高表達。

2.3 不同結縷草種源材料葉片木質素含量與CAD基因表達相關性

使用 winser 染色法，我們對4份結縷草種源材料的葉片進行了木質素的組織化學染色分析，如圖3所示，4份種源材料中，Z103與Zenith染色較深，Z112與Meyer染色較淺，且染色面積較小，說明Z103與Zenith木質素含量高于Z112與Meyer。如圖4所示，對上述分析發(fā)現(xiàn)的5個葉片中高表達的CAD基因進行RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，僅ZjCAD6的表達模式和木質素染色結果一致，即Z103與Zenith兩份種源材料的表達量高于Z112與Meyer，而其余4個CAD基因的表達則無這種相關性。這一結果提示ZjCAD6基因可能是決定不同結縷草種源材料葉片木質素含量的關鍵基因。

圖1 結縷草ZjCAD基因家族進化樹，基因結構和保守結構域分析Fig.1 Phylogenetic tree,gene structure and conserved motif analysis of ZjCAD genes

圖2 ZjCAD基因在不同組織中的表達情況Fig.2 The expression pattern of ZjCAD genes in different tissues

圖3 木質素組織化學染色Fig.3 Histochemical analysis of ligninA:Z103;B:Z112;C:Zenith;D:Meyer.Scale bar=50 μm.

圖4 5個ZjCAD基因在4份材料中的差異表達Fig.4 Expression analysis of 5 ZjCAD genes in 4 zoysiagrassesA：代表性半定量RT-PCR電泳結果Representative electrophoresis result of RT-PCR;B：3次重復實驗統(tǒng)計學分析Statistical analysis of 3 replicate experiments.

圖5 ZjCAD6基因與其他物種CAD基因氨基酸序列一致性比對Fig.5 Alignment of amino acid sequence of ZjCAD6 with CADs from other plant species

2.4 ZjCAD6蛋白序列保守性分析

ZjCAD6基因編碼蛋白ZjCAD6為有催化活性的功能蛋白。為了進一步確定ZjCAD6基因與結縷草葉片木質素合成的相關性，我們將ZjCAD6蛋白與其他植物具催化活性的CAD蛋白進行了氨基酸序列比對分析。如圖5所示，所有具催化活性的CAD蛋白均含一個與Zn2+催化相關的GHE(X)2G(X)5G(X)2V結構域，一個與Zn2+結合的GD(X)10C(X)2C(X)2C(X)7C結構域和一個與NADP(H)結合相關的富含甘氨酸的GLGGV(L)G保守結構域[25]。這3個結構域在ZjCAD6蛋白中均同樣存在，提示ZjCAD6基因編碼蛋白ZjCAD6為有催化活性的功能蛋白。

3 討論

肉桂醇脫氫酶以基因家族的形式存在于多個植物中，在擬南芥中有9個CAD基因，水稻中有12個CAD基因，二穗短柄草(Brachypodiumdistachyum)和楊樹(Populustrichocarpa)中則分別有7和15個CAD基因[20,26]。在結縷草中，我們共發(fā)現(xiàn)了16個CAD基因。這16個CAD基因具有非常大的序列和基因結構差異，最短的ZjCAD8F僅849 bp，最長的ZjCAD7則長達8093 bp，ZjCAD8F無內含子，而ZjCAD3、ZjCAD4、ZjCAD8A則擁有多達6個的內含子。這一結果和擬南芥、水稻中CAD基因家族不同成員的序列差異度是不同的[27]，說明結縷草CAD基因家族的不同成員具有較大的基因序列差異性[26]。擬南芥中，AtCAD4(AtCAD-D)、AtCAD5(AtCAD-C)為控制木質素合成的主效基因，AtCAD4在花和根中高表達。AtCAD5在木質的根中高表達[28]。在二穗短柄草中，BdCAD5則在根和莖中高表達。本研究同樣發(fā)現(xiàn)不同結縷草CAD基因具有不同的組織表達特異性，值得一提的是ZjCAD4、ZjCAD6、ZjCAD7、ZjCAD8C、ZjCAD8D5個基因在葉片中均高表達，提示這5個CAD基因參與了結縷草葉片木質素的合成。然而，在擬南芥中，AtCAD1、AtCAD7、AtCAD8等基因也被證明與木質素的合成相關[17,20,28]，說明CAD基因家族不同成員可能存在功能冗余的現(xiàn)象。因此，葉片中高表達的5個ZjCAD基因的具體功能作用尚需進一步探究和驗證。

Wiesner反應利用間苯三酚在酸性條件下與肉桂醛基團發(fā)生顯色反應獲得紅色或粉色的化合物，是檢測植物木質素含量的最直觀、高效的方法[29]。本研究中，Z103與Zenith兩份結縷草種源材料Wiesner染色強度高于Z112與Meyer，說明Z103與Zenith葉片木質素含量和木質化程度較高，提示不同種源材料機械強度和耐踐踏能力差異可能與其木質化程度密切相關。

不同結縷草種源材料中ZjCAD6基因的表達和葉片木質素含量正相關，提示其為決定結縷草葉片木質素含量的關鍵CAD基因。在幾種模式植物中，AtCAD4、AtCAD5[16]、ZmCAD2[18]、OsCAD2[13]基因分別為控制擬南芥、玉米、水稻木質素合成的主效基因，序列分析發(fā)現(xiàn)ZjCAD6基因與這些具催化活性的CAD基因具有46%～47%的序列相似性，尤其是與催化活性相關的酶結構域高度保守，說明ZjCAD6蛋白是具有CAD酶活性的活性蛋白。在進化樹的比對中，ZjCAD6與OsCAD6相似度最高，盡管OsCAD6未被證明直接參與木質素的合成過程，但其特有的過氧化物酶結合位點揭示其可能參與了其他代謝途徑。而且，OsCAD6與楊樹中芥子醇脫氫酶(sinapyl alcohol dehydrogenase，SAD)有59.4%的相似度，SAD表現(xiàn)出對底物芥子醛特異的親和性[27]。因此，在今后的研究中，可進一步對ZjCAD6基因進行表達、純化與活性測定，分析其催化特征和調控機制，從而可以更深入的解析結縷草葉片木質素合成的分子機理。

4 結論

本研究首次獲得了結縷草16個CAD基因家族成員。16個結縷草CAD基因中，有12個基因在根、莖、葉不同組織中表達，5個基因在葉片中優(yōu)勢表達。5個基因中，僅ZjCAD6基因的表達與不同結縷草種源材料木質素含量正相關，提示ZjCAD6基因是控制結縷草葉片木質素合成的關鍵基因。本研究結果為解析結縷草機械強度和耐踐踏的分子機理提供了重要信息。

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Genome-wide identification and characterization of the cinnamyl alcohol dehydrogenase gene family inZoysiajaponica

SHI Jing-Ang,ZHANG Bing*,XIAO Xiao-Lin,MA Jing-Jing,YANG Xiang-Yang,LIU Jian-Xiu

InstituteofBotany,JiangsuProvinceandChineseAcademyofSciences,Nanjing210014,China

Cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD,EC1.1.1.195) is a key enzyme in the lignin biosynthesis pathway.By using NADPH as a cofactor,CAD catalyzes cinnamyl aldehydes to alcohols and plays an important role in plant development and stress responses.This study identified 16 CAD genes inZoysiajaponica.Phylogenetic and structural analyses of these genes were conducted.Semi-quantitative RT-PCR indicated that 5ZjCADgenes were specifically expressed in leaves.Lignin histochemical staining and expression analyses ofZjCADgenes in different cultivars and a wild accession further showed that the expression pattern ofZjCAD6 was positively correlated with leaf lignin contents.These results indicate thatZjCAD6 may be the key gene that regulates lignin biosynthesis in the leaves ofZ.japonica.The full length of theZjCAD6 gene is 2736 bp,and is comprised of three introns and four exons.The 1074 bp open reading frame ofZjCAD6 encodes 357 amino acids.ZjCAD6 protein contains two Zn2+-binding motifs and a NADP(H)-binding motif,which is vital for its catalytic activity.Our results provide an important reference for further study of both lignin content's molecular mechanisms and the tensile strength ofZ.japonicaleaves.

Zoysiajaponica;lignin;cinnamyl alcohol dehydrogenase;bioinformatics analysis;gene expression

10.11686/cyxb2016442 http://cyxb.lzu.edu.cn

史經昂，張兵，肖曉琳，馬晶晶，楊向陽，劉建秀.結縷草肉桂醇脫氫酶基因家族全基因組序列鑒定和表達分析.草業(yè)學報,2017,26(6):111-119.

SHI Jing-Ang,ZHANG Bing,XIAO Xiao-Lin,MA Jing-Jing,YANG Xiang-Yang,LIU Jian-Xiu.Genome-wide identification and characterization of the cinnamyl alcohol dehydrogenase gene family inZoysiajaponica.Acta Prataculturae Sinica,2017,26(6):111-119.

2016-11-19；改回日期：2017-02-14

江蘇省公益院所能力提升項目-草坪種質創(chuàng)新(BM2015019-1)，江蘇省體育產業(yè)引導項目“江蘇省運動草坪研究中心建設暨運動草坪標準化項目”和江蘇省體育產業(yè)引導項目“天然草坪耐踐踏性關鍵技術體系研發(fā)與集成示范”資助。

史經昂(1992-)，男，江蘇徐州人，在讀碩士。E-mail：shion1992@outlook.com

*通信作者Corresponding author.E-mail：bingkeith@gmail.com