李君風(fēng)，原現(xiàn)軍，董志浩，Seare Tajebe Desta，陳雷，白晰，白云峰，邵濤*

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西藏地區(qū)牦牛瘤胃中兼性厭氧纖維素降解菌的分離鑒定

李君風(fēng)1，原現(xiàn)軍1，董志浩1，Seare Tajebe Desta1，陳雷1，白晰1，白云峰2，邵濤1*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)飼草調(diào)制加工與貯藏研究所，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 南京 210014)

本研究旨在從西藏地區(qū)牦牛瘤胃中分離出具有分解纖維素能力的兼性厭氧菌，為青貯飼料微生物添加劑的研制提供支持。試驗采集了西藏那曲地區(qū)成年牦牛的新鮮瘤胃液，經(jīng)剛果紅染色初篩，濾紙降解復(fù)篩，獲得分解纖維素能力強的菌株，對菌株生長速率及酶活力進(jìn)行測定，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16S rRNA序列分析對菌株進(jìn)行鑒定，并分析了菌株對水稻秸稈的降解效果。試驗分離出一株兼性厭氧纖維素降解菌，屬于腸球菌屬，即糞腸球菌(Enterococcusfaecalis) JF85。菌株JF85在15～55 ℃，pH 3.0～7.0及3.0%和6.5% NaCl培養(yǎng)基中生長良好。接種JF85，36 h后可獲得最大內(nèi)切葡聚糖酶活力(0.41 U/mL)和濾紙酶活力(0.13 U/mL)。在模擬發(fā)酵試驗中，接種菌株JF85，14 d后水稻秸稈干物質(zhì)、纖維素和半纖維素含量與對照組相比顯著降低(P<0.05)；在發(fā)酵第7天，JF85處理組顯示最高的可溶性碳水化合物含量，整個發(fā)酵過程中木質(zhì)素含量變化不顯著(P>0.05)。菌株JF85具有分解纖維素、耐酸、耐鹽特性，在青貯飼料生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用前景。

牦牛；瘤胃液；纖維素降解菌；分離；鑒定；水稻秸稈

我國農(nóng)作物秸稈資源豐富，年總產(chǎn)量達(dá)5.5～5.7億多噸，其中水稻秸稈1.8億t，玉米秸稈1.3億t，小麥秸稈1.3億t；雖然農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量巨大，但利用率低[1]。據(jù)統(tǒng)計目前我國僅有20%～30%的農(nóng)作物秸稈用于家畜的飼料，45%～47%左右的秸稈作為生活燃料，15%在田間被直接焚燒，因此只有少部分過腹還田或直接還田[2]。如何充分合理有效地利用農(nóng)作物秸稈資源，使環(huán)境不受污染，是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中面臨的一個重大研究課題。農(nóng)作物秸稈一般營養(yǎng)價值低、適口性差，其粗蛋白含量僅為3%～6%，干物質(zhì)消化率30%～40%。為了改善農(nóng)作物秸稈的飼用價值，一般采用物理、化學(xué)和生物學(xué)等加工處理方法，其中生物學(xué)處理方法在未來最具有發(fā)展前景。青貯是生物學(xué)處理方法之一，但農(nóng)作物秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)常常不理想，主要原因是其水溶性碳水化合物含量低，不能為乳酸菌提供充足的發(fā)酵底物。近年來隨著生物降解技術(shù)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)利用纖維素降解菌不僅能夠分解農(nóng)作物秸稈的纖維產(chǎn)生水溶性碳水化合物，提高青貯發(fā)酵品質(zhì)，而且還能提高蛋白質(zhì)含量、適口性和消化率[3]。

目前關(guān)于纖維素降解菌的研究報道較多，集中于研究土壤、動物糞便、堆肥、廢紙漿、溫泉等分離出來的纖維素降解菌，主要有好氧性和厭氧性兩大類纖維素降解菌[4]。由于青貯要經(jīng)歷從有氧期進(jìn)入?yún)捬跗诘倪^程，因此篩選與研究兼性厭氧性纖維素降解菌作為青貯微生物添加劑更具有實際應(yīng)用價值。反芻動物瘤胃具有高效降解纖維素的能力，被喻為豐富的纖維素降解菌資源庫[5]。迄今為止，分離到的瘤胃纖維降解細(xì)菌有白色瘤胃球菌(Rumincoccusalbus)、黃色瘤胃球菌(R.flavefaciens)、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)和溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)等，但這些細(xì)菌需要在嚴(yán)格厭氧和低氧化還原電位下才能生長[6]。王炳曉等[7]從奶牛瘤胃液中分離出具有分解纖維素能力的兼性厭氧細(xì)菌，如蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus) 等，但其僅對致病性和酶活進(jìn)行了研究，而對農(nóng)作物秸稈的降解作用未見報道。國內(nèi)外有關(guān)瘤胃纖維素降解菌的研究大多集中于綿羊、水牛、肉牛和奶牛中，而從牦牛瘤胃中分離兼性厭氧性纖維素降解菌的報道很少。牦牛素有“高原之舟”的美稱，對青藏高原嚴(yán)寒、缺氧、強紫外輻射等惡劣自然條件具有超強的適應(yīng)能力；在青藏高原特殊的生態(tài)環(huán)境和長期的自然選擇下，使牦牛形成了耐粗飼的生態(tài)生理特性[8]，研究發(fā)現(xiàn)，牦牛瘤胃中的纖維素降解菌種類更豐富，纖維素降解能力更強[9]。曹陽春等[10]從牦牛瘤胃中篩選到1株能分泌高活性的纖維降解酶的厭氧真菌Neocallimastixfrontalis，該菌株羧甲基纖維素酶和微晶纖維素酶的酶活性分別達(dá)到83和16 mU/L。雖然瘤胃真菌分泌的纖維素酶活性在所有瘤胃微生物中較高,但是真菌生長過程中會產(chǎn)生大量的孢子,降低飼料的適口性,不宜作為微生物添加劑。因此從牦牛瘤胃中篩選具有纖維素降解能力強的兼性厭氧性細(xì)菌具有重要的理論和實際意義。本研究旨在從西藏地區(qū)牦牛瘤胃中篩選出兼性厭氧纖維素降解菌，為青貯添加劑的研發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本試驗于2014年10月從西藏那曲牦牛屠宰場隨機采集3頭年齡在4～5周歲，體重為250～300 kg的健康牦牛瘤胃液，并將其放入預(yù)先充有氮氣的滅菌瓶內(nèi)，裝入保溫盒中6 h內(nèi)帶到實驗室。牦牛主要以采食天然草地牧草為主，放牧管理。那曲地區(qū)地處西藏北部，位于青藏高原腹地，地理位置為31.47 N，92.1 E，平均海拔4500 m以上，屬高原亞寒帶季風(fēng)半濕潤氣候區(qū)。

1.2 培養(yǎng)基及藥品

富集培養(yǎng)基[11]，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO40.3 g，(NH4)2SO41.4 g，CaCl20.3 g，無細(xì)胞瘤胃液100 mL，痕量營養(yǎng)液1 mL，半胱氨酸1 g，纖維二糖2 g，酵母膏0.5 g，蛋白胨0.5 g，蒸餾水1000 mL。

篩選培養(yǎng)基[12]，CMC-Na 10.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO40.3 g，(NH4)2SO41.4 g，CaCl20.3 g，無細(xì)胞瘤胃液100 mL，痕量營養(yǎng)液1 mL，瓊脂20 g，半胱氨酸1 g，蒸餾水1000 mL。

復(fù)篩培養(yǎng)基，將篩選培養(yǎng)基中的CMC-Na用Whatman NO.1濾紙代替，無瓊脂。濾紙條先用1%稀醋酸浸泡24 h，用碘液檢查是否有淀粉，若已去除完全，則用2%蘇打水沖洗至中性，滅菌后備用。

液體培養(yǎng)基，CMC-Na 10.0 g，酵母膏10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1000 mL。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，CMC-Na 5 g，NH4NO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41.0 g，CaCl20.02 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.05 g，蛋白胨1.0 g，蒸餾水1000 mL。

痕量營養(yǎng)液，F(xiàn)eSO40.2 g，MnSO40.15 g，ZnCl20.3 g，CoCl20.4 g，于1 L容量瓶定容后，封裝4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

鹽液，尿素0.3 g、硫酸銨1.4 g、KH2PO42.0 g、CaCl20.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、酵母膏0.25 g、蛋白胨0.75 g、FeSO4·7H2O 5 mg、CoCl220 mg、MnSO4·7H2O 1.6 mg、ZnSO4·7H2O 1.4 mg、蒸餾水1000 mL，以上培養(yǎng)基pH調(diào)為6.5，均在121 ℃滅菌15 min后使用。水稻秸稈經(jīng)自然風(fēng)干后磨成粉滅菌后使用。

酶制劑(纖維素酶)，江蘇銳陽生物有限公司產(chǎn)品(纖維素酶酶活：5萬U/g)，添加量參照使用說明。

1.3 試驗方法

1.3.1 纖維素降解菌的篩選 采集西藏地區(qū)牦牛瘤胃液于無菌瓶中厭氧密封并將其放于保溫盒內(nèi)，迅速帶回實驗室，用快速混勻器勻漿10 s，3層紗布過濾去掉殘渣，取濾液1 mL于裝有50 mL富集培養(yǎng)基的血清瓶中密封，39 ℃下厭氧振蕩培養(yǎng)1～3 d后，按2%的接種量，轉(zhuǎn)接至新的富集培養(yǎng)基中進(jìn)行第2次富集培養(yǎng)。將富集培養(yǎng)后的菌液接種到篩選培養(yǎng)基中做平板稀釋涂布法分離，待純化出單菌株，點種在篩選培養(yǎng)基的平板上厭氧培養(yǎng)2～3 d后，用1 mg/mL的剛果紅浸染30 min，傾去染液，再以1 mol/L的氯化鈉水溶液脫色，觀察水解圈大小。挑取透明圈較大的菌落，進(jìn)行多次劃線純化，并再次進(jìn)行點種和剛果紅染色，觀察透明圈的大小，挑取透明圈大的菌株接入到復(fù)篩培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)7 d，觀察濾紙的崩解效果，直至得到穩(wěn)定的具有降解纖維素能力的純菌株[13]。

1.3.2 菌落形態(tài)與染色特征觀察 挑取分離純化后透明圈較大，且能有效降解濾紙的單菌落進(jìn)行形態(tài)觀察，并對培養(yǎng)24～48 h的菌落涂片，革蘭氏染色，油鏡下鏡檢。

1.3.3 菌株的生理生化特性檢測 不同溫度水平生長試驗,將配制好的液體培養(yǎng)基以每試管5 mL的量分裝好，在121 ℃高壓條件下滅菌15 min，將待測菌株培養(yǎng)液，以相同的接種量(0.1 mL)接入液體培養(yǎng)基中搖勻，塞子封口，分別置于15，25，35，45和55 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d后，觀察菌株的生長情況。

不同pH水平生長試驗，用鹽酸或氫氧化鈉將液體培養(yǎng)基pH調(diào)至3.0，4.0，5.0，6.0和7.0五個水平，同上述步驟，將待測菌株培養(yǎng)液以相同的接種量(0.1 mL)接入已滅菌的液體培養(yǎng)基中，置于39 ℃恒溫培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)2 d后，觀察菌株的耐酸堿能力。

不同鹽濃度水平生長試驗，用分析純 NaCl 將液體培養(yǎng)基的鹽濃度調(diào)至3.0%，6.5%和10%三個水平，同上述步驟，將待測菌株培養(yǎng)液以相同的接種量(0.1 mL)接入已滅菌培養(yǎng)液中，置于39 ℃恒溫培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)2 d后，觀察菌株的耐鹽能力。

糖發(fā)酵試驗，使用包含49種不同碳水化合物和一個對照的API 50 CHL進(jìn)行不同糖、醇發(fā)酵鑒定，將菌株在39 ℃條件下培養(yǎng)48 h后制成菌懸液接種于試驗條的每一個管中。培養(yǎng)期間，糖發(fā)酵產(chǎn)酸致使pH下降，以指示劑的顏色變化予以表示。結(jié)果組成該菌株的生化圖譜，并依據(jù)說明書來鑒定或分型。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定 取39 ℃條件下培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)液2 mL，13000 r/min離心10 min，沉淀物用于DNA提取，使用細(xì)胞破碎儀(Biospec公司)，按照Zoetendal描述的酚-氯仿法提取樣品DNA[14]。 PCR反應(yīng)體系包括：2xPCR Master Mix 25 μL，引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)程序為：預(yù)變性，94 ℃，5 min；變性，94 ℃，30 s；退火，55 ℃，30 s；延伸，72 ℃ 2 min，共30個循環(huán)[15]。PCR純化產(chǎn)物送樣測序(上海英濰捷基生物科技有限公司)。用BLAST將所測定菌株的16S rRNA序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌的16S rRNA序列進(jìn)行比對，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種，分析相似性。然后用MEGA6.0中的Clustal W對最近類群的序列進(jìn)行多重比較分析，并通過該軟件的鄰近法(Neighbor Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 酶活力的測定 纖維素酶活力的測定采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法。液體產(chǎn)酶培養(yǎng)條件下，取新鮮培養(yǎng)液10 mL，12000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液[16]。酶活力單位定義：在pH 4.8條件下每min產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為1個酶活力單位(U)。

內(nèi)切葡聚糖酶(CMCase)活測定[17]，取0.5 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液于25 mL具塞刻度試管中，加入含1%CMC-Na的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.5 mL(pH 4.8)，混勻后將試管于50 ℃水浴30 min，結(jié)束立即加入1.5 mL DNS溶液以終止酶反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴10 min，冷卻定容后在540 nm波長下測定吸光值(A540)。

濾紙酶活(FPase)測定，將去除淀粉后的Whatman NO.1濾紙(1 cm×6 cm)放進(jìn)25 mL具塞刻度試管，加入0.5 mL粗酶液和1.5 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 4.8)，試管在50 ℃水浴1 h后取出立即向試管中加入1.5 mL DNS溶液以終止酶反應(yīng)，沸水浴10 min，冷卻定容后在540 nm下測定吸光值(A540)。

1.3.6 水稻秸稈纖維降解試驗 將所篩的菌株接種到液體培養(yǎng)基中39 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)2 d后，4200 r/min離心，然后用磷酸緩沖液(PBS)清洗2～3次，最后用PBS溶液調(diào)菌體OD600值為1.0，然后按0.2 mL/g的接種量(活菌數(shù)量為5.2×108cfu/mL)將菌株接種到模擬水稻秸稈發(fā)酵的微型發(fā)酵罐中混合均勻培養(yǎng)。試驗設(shè)對照組、酶制劑處理組(E：按0.02 g/kg添加)和菌株JF85處理組，每個處理組5個重復(fù)，各組加入等量已滅菌的鹽液，室溫條件下厭氧培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)2、7和14 d后開罐取樣分析。將樣品烘干稱重，干物質(zhì)(dry matter，DM)采用AOAC方法測定、水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate,WSC)采用蒽酮—硫酸比色法測定，按照Ververis等[18]的方法，測定不同處理的纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與純化

圖1 菌株JF85剛果紅染色Fig.1 Clearing zone of cellulolytic bacterium JF85 on CMC-Na selective media

經(jīng)富集培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)基平板篩選、多次劃線分離純化及濾紙復(fù)篩后得到1株能以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為唯一碳源生長的菌株JF85，此菌株經(jīng)剛果紅染色后在菌落周圍出現(xiàn)明顯透明圈(圖1)。

2.2 纖維素降解菌JF85的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察及菌株生理生化特性 將培養(yǎng)了48 h的菌落進(jìn)行觀察，菌落特征一致為圓形，邊緣整齊，表面光滑，扁平隆起，凸顯的菌落大小為1～2 mm，乳白色、不透明，表面黏稠濕潤。經(jīng)過革蘭染色并鏡檢，觀察到所分離的菌株為革蘭氏陽性菌，形態(tài)為橢圓球形、呈單個、成對或短鏈狀排列，無鞭毛、無芽胞。將待測菌株JF85通過生理生化測定，其具體試驗結(jié)果見表1和表2。菌株JF85在15～55 ℃，pH 3.0～7.0范圍內(nèi)及3.0%和6.5%NaCl條件下生長良好，表明菌株JF85具有耐酸、耐鹽特性。糖發(fā)酵結(jié)果表明，菌株JF85不能利用赤蘚糖醇，D-阿拉伯糖，D-木糖，蜜二糖，D-棉籽糖和D-松二糖，從利用纖維二糖和水楊苷情況來看，菌株JF85可利用其產(chǎn)酶。

表1 菌株JF85生長和生化的特性Table 1 The physiological characteristics of cellulolytic bacterium (JF85)

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性，“W”表示弱陽性。下同。
Note:“+”means positive;“-”means negative;“W” means weakly positive.The same below.

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 經(jīng)上海英濰捷基生物科技有限公司序列測定，確定擴增的16S rRNA片段長度1457 bp，BLAST序列比較發(fā)現(xiàn)該菌株的16S rRNA序列與多株腸球菌屬細(xì)菌的16S rRNA 相似，故Genbank命名為Enterococcussp.JF85，并與糞腸球菌(E.faecalis)序列相似性為99%。調(diào)出其中已鑒定菌株的16S rRNA，用Clustal W進(jìn)行多重序列對比，并按Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。

2.3 纖維素降解菌JF85的生長曲線和產(chǎn)酶曲線

以2%的接種量將JF85菌液接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，按時間編號取樣測定OD600值，得到JF85的生長曲線，試驗結(jié)果見圖3。從圖3中可以明顯看出，JF85在液體培養(yǎng)基中生長的延滯期(調(diào)節(jié)期)是0～4 h，對數(shù)生長期是4～24 h，24～40 h為穩(wěn)定期。因此在制備此菌株種子液時收集時間應(yīng)控制在12～24 h之間，此段時間菌株的生長速率快、菌體濃度高。對菌株JF85不同培養(yǎng)時間點取樣測定酶活，其內(nèi)切葡聚糖酶活力和濾紙酶活力從6 h開始都呈明顯的上升趨勢，36 h后內(nèi)切葡聚糖酶活力(0.41 U/mL)和濾紙酶活力(0.13 U/mL)都達(dá)到了最大值。從圖3還可以觀察出，JF85的產(chǎn)酶與菌株生長密切相關(guān)。在培養(yǎng)初期營養(yǎng)豐富，菌株大量繁殖并代謝產(chǎn)酶；培養(yǎng)48 h后由于營養(yǎng)的限制，菌株生長受到抑制，酶活出現(xiàn)下降。

表2 菌株JF85糖發(fā)酵特性Table 2 Sugar fermentation profiles of cellulolytic bacterium (JF85)

圖2 纖維素分解菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequences of the cellulolytic bacterium

圖3 纖維素降解菌JF85的生長曲線和產(chǎn)酶曲線Fig.3 Time course profiles of growth and enzyme production by cellulolytic bacterium (JF85) in liquid medium

表3 水稻秸稈的降解動態(tài)Table 3 Dynamics degradation of rice straw

不同大寫字母表示相同處理不同發(fā)酵天數(shù)間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示相同發(fā)酵時間不同處理間差異顯著(P<0.05)；E為商品酶制劑。Values with different capital letters show significant differences among ensiling days in the same treatment (P<0.05);values with different small letters show significant differences among treatment in the same days (P<0.05).E for commercial enzyme preparation.WSC:Water soluble carbohydrate.

2.4 水稻秸稈纖維降解試驗

將所篩選的纖維素降解菌株JF85接種到微型模擬水稻秸稈厭氧發(fā)酵罐中，通過測定不同發(fā)酵時間的干物質(zhì)、可溶性碳水化合物、纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素等參數(shù)，研究菌株JF85對水稻秸稈纖維的降解效果。結(jié)果顯示(表3)，在整個發(fā)酵過程中，各組干物質(zhì)逐漸下降，WSC含量整體上呈逐漸上升后又下降的趨勢，其中發(fā)酵第7天，酶和菌株處理組WSC含量顯著高于對照組(P<0.05)。隨著發(fā)酵時間的延長，各組纖維素和半纖維素含量逐漸降低，其中酶和菌株處理組纖維素含量顯著低于對照組(P<0.05)，發(fā)酵第14天，菌株處理組纖維素含量達(dá)到最低(28.06% DM)。發(fā)酵7～14 d內(nèi)，酶和菌株處理組半纖維素含量均顯著低于發(fā)酵前期(P<0.05)。整個發(fā)酵過程中各組木質(zhì)素含量無顯著變化(P>0.05)。

3 討論

腸球菌(Enterococcus)是一種兼性厭氧型乳酸菌，屬于鏈球菌科腸球菌屬，是人類和動物腸道正常菌群的一部分，在腸黏膜中具有較強的耐受力和定植能力，并且在不利的環(huán)境條件下具有較強的抗逆性如耐酸、耐高溫、耐氧和耐干燥，比較適合作為益生菌在動物生產(chǎn)中應(yīng)用[19]。Nocek等[20-21]報道，圍產(chǎn)期奶牛飼喂含有屎腸球菌的添加劑能夠促進(jìn)飼草料在瘤胃中的消化，提高產(chǎn)奶量。還有研究表明，通過飼喂含有屎腸球菌的飼草料能夠促進(jìn)肉牛適應(yīng)高精料日糧，防止酸中毒[22]。本試驗所篩選的纖維素降解菌，具有較高的纖維素降解能力，經(jīng)生理生化和16S rRNA序列鑒定，為腸球菌屬的一個種，該菌與Enterococcusfaecalis的相似度極高。劉占英等[23]分離鑒定了一株能降解纖維素的糞腸球菌EnterococcusfaecalisCTB374-1，該菌株能以纖維素為底物產(chǎn)生L-乳酸。Nyonyo等[24]從牛瘤胃液中篩出一株具有較高濾紙酶活力的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。Robert等[25]從人的大腸中分離出能降解纖維素的腸球菌，與本研究一致，這說明有些腸球菌存在產(chǎn)纖維素酶的基因，能夠分泌纖維素酶降解纖維素。

青貯過程中添加乳酸菌能夠快速產(chǎn)生乳酸，迅速降低pH值，從而抑制有害微生物的繁殖生長，提高青貯發(fā)酵品質(zhì)。但是乳酸菌通常不具備纖維降解能力，若將纖維素降解菌和乳酸菌組合應(yīng)用于青貯飼料生產(chǎn)中，一方面纖維素降解菌可分解纖維素為乳酸菌提供可利用的單糖，另一方面乳酸菌能加速乳酸發(fā)酵，從而進(jìn)一步提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。一般青貯微生物添加劑應(yīng)具有耐酸性，生長速度快，還能充分利用各種發(fā)酵底物，在較大的溫度范圍內(nèi)以及多種條件下均可生長。本試驗分離到的菌株JF85能在12～24 h內(nèi)快速達(dá)到對數(shù)期，且能在pH 3.0～6.0，15～35 ℃條件下生長，滿足了青貯接種劑的要求。買爾哈巴·艾合買提等[26]從新疆細(xì)毛羊、牛和駱駝瘤胃液中分離出2株高產(chǎn)纖維素降解酶的菌，并將其應(yīng)用到棉花秸稈青貯中，結(jié)果表明，兩株菌株均能降低青貯飼料的中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和半纖維素(HC)的含量，提高水溶性碳水化合物含量，不同程度地提高了棉花秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)。馮懷蓉等[27]在玉米(Zeamays)和苜蓿(Medicagosativa)青貯中添加含有乳酸菌和產(chǎn)纖維素酶的枯草芽抱桿菌，青貯后各項營養(yǎng)指標(biāo)均優(yōu)于對照組，明顯地提高了粗蛋白，降低了粗纖維含量。篩選兼性厭氧纖維素降解菌能適應(yīng)青貯過程中前期有氧，后期無氧的環(huán)境，發(fā)揮其應(yīng)有的功能。

本試驗測定了菌株JF85不同生長期的內(nèi)切葡聚糖酶活力和濾紙酶活力，并分析了其對水稻秸稈天然纖維素的降解效果，結(jié)果表明：在產(chǎn)酶試驗中接種菌株JF85，36 h后可獲得最大內(nèi)切葡聚糖酶活力(0.41 U/mL)和濾紙酶活力(0.13 U/mL)，但僅僅測定了菌株JF85在通用產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶曲線，并沒有優(yōu)化其產(chǎn)酶條件，今后有待進(jìn)一步研究。雖然菌株JF85的內(nèi)切葡聚糖酶活力和濾紙酶活力并非很強，但其可以明顯加速水稻秸稈中纖維素的降解，增加水溶性碳水化合物的含量。在發(fā)酵14 d內(nèi)，菌株JF85處理組纖維素含量降低了19.78%，半纖維素含量降低了17.50%，而酶處理組纖維素含量降低了15.2%。因此，菌株處理組對纖維素的降解程度要優(yōu)于酶制劑處理組。有研究報道從青藏高原野牦牛糞中篩選出3株產(chǎn)纖維素酶活較高的芽孢桿菌屬細(xì)菌，并將其與乳酸菌按一定比例混合添加到全株玉米青貯中，發(fā)酵30 d后，其中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量分別降低了16.63%和15.85%[28]。本試驗菌株對秸稈的降解結(jié)果表明，僅僅以測定纖維素酶活來衡量菌株的纖維分解能力是不全面的，纖維素的降解可能還存在一些其他因素。Glyn等[29]研究指出，多糖單加氧酶(PMO)也是纖維素分解過程中的一個重要的酶系，它可通過從多糖鏈葡萄糖單體的C-4端奪取H原子形成非還原性末端而被氧化成醛酮糖；而Beeson等[30]報道指出，PMO先從多糖鏈葡萄糖單體的C-1端獲取H原子后形成內(nèi)酯糖，接著轉(zhuǎn)化為醛糖酸，被磷酸化后通過磷酸戊糖途徑被代謝，進(jìn)而實現(xiàn)對纖維素的降解。菌株JF85是否存在這些纖維素的分解機制，還有待深入的研究。

4 結(jié)論

本研究采用剛果紅染色初篩，濾紙降解復(fù)篩等方法，從西藏地區(qū)牦牛瘤胃液中分離獲得一株具有較高纖維素酶活力的纖維素降解菌。模擬厭氧發(fā)酵試驗結(jié)果表明菌株JF85對水稻秸稈天然纖維素有一定程度的降解效果，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)青貯飼料添加劑的研發(fā)與應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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Isolation and identification of facultatively anaerobic cellulolytic bacterium in the rumen of Tibetan yaks (Bosgrunniens)

LI Jun-Feng1,YUAN Xian-Jun1,DONG Zhi-Hao1,Seare Tajebe Desta1,CHEN Lei1,BAI Xi1,BAI Yun-Feng2,SHAO Tao1*

1.InstituteofEnsilingandProcessingofGrass,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;2.JiangsuAcademyofAgriculturalScience,Nanjing210014,China

This study aimed to isolate and identify facultatively anaerobic cellulolytic bacterium in the rumen of yaks and to provide a basis for studying new types of silage additives.Fresh ruminal fluid was collected from Tibetan yaks and highly cellulolytic facultatively anaerobic bacteria were screened out by using Congo red staining and liquid secondary screening culture media.Cellulolytic bacteria strains were identified based on their morphological,physiological and biochemical characteristics,as well as by 16S rRNA analysis.Time course profile of growth and enzyme production by strain JF85 was obtained.The degradation efficiency of rice straw was examined by evaluating cellulose,hemicellulose and lignin contents under a range of condition.Strain JF85 was identified asEnterococcusfaecalis.This strain grew well across a wide range of conditions:temperatures of 15-55 ℃,pH levels of 3.0-7.0 and NaCl levels of 3.0% and 6.5%.It exhibited the maximal endoglucanase activity (0.41 U/mL) and filter paper activity (0.13 U/mL) after 36 hours of incubation.In simulated fermentation,compared to the control,adding the JF85 strain significantly decreased the dry matter,cellulose and hemicellulose contents of rice straw after 14 days of inoculation (P<0.05).JF85-treated rice straw showed its highest water soluble carbohydrate content after 7 days of inoculation.However,there were no significant differences in lignin contents among all treatments.Applications of the JF85 strain,with its highly cellulolytic abilities and tolerance of acid and salt,have the potential to significantly improve the production of silage．

yak;ruminal fluid;cellulolytic bacteria;isolation;identification;rice straw

10.11686/cyxb2016315 http://cyxb.lzu.edu.cn

李君風(fēng),原現(xiàn)軍,董志浩,Seare Tajebe Desta,陳雷,白晰,白云峰,邵濤.西藏地區(qū)牦牛瘤胃中兼性厭氧纖維素降解菌的分離鑒定.草業(yè)學(xué)報,2017,26(6):176-184.

LI Jun-Feng,YUAN Xian-Jun,DONG Zhi-Hao,Seare Tajebe Desta,CHEN Lei,BAI Xi,BAI Yun-Feng,SHAO Tao.Isolation and identification of facultatively anaerobic cellulolytic bacterium in the rumen of Tibetan yaks (Bosgrunniens).Acta Prataculturae Sinica,2017,26(6):176-184.

2016-08-19；改回日期：2016-10-09

江蘇省自主創(chuàng)新項目“以秸稈飼料化、基料化利用為核心的技術(shù)方案”和江蘇省自然基金青年基金項目“纖維素酶基因工程乳酸菌的構(gòu)建及青貯表達(dá)效果研究”(BK20130694)資助。

李君風(fēng)(1988-)，女，甘肅臨夏人，在讀博士。E-mail:ljf126ff@126.com

*通信作者Corresponding author.E-mail:taoshaolan@163.com