顧晨雷,周曉旭,劉洋,于海龍,孔德榮,宋堅,仇雪梅,常亞青,王秀利(.大連海洋大學水產與生命學院,遼寧大連6023;2.大連市水產產業(yè)技術創(chuàng)新聯(lián)合會,遼寧大連6023)

刺參4個功能基因的表達分析

顧晨雷1、2,周曉旭1,劉洋1,于海龍1,孔德榮1,宋堅1,仇雪梅1,常亞青1,王秀利1、2
(1.大連海洋大學水產與生命學院,遼寧大連116023;2.大連市水產產業(yè)技術創(chuàng)新聯(lián)合會,遼寧大連116023)

為研究刺參Apostichopus japonicus的生長發(fā)育,采用實時定量PCR方法,對刺參腱生蛋白基因、膠原蛋白琢2基因、整合蛋白琢V基因和整合蛋白茁L基因等4個候選功能基因不同月齡的組織表達進行了分析。結果表明:刺參12、13、14月齡時,腱生蛋白基因在刺參腸、管足、呼吸樹、皮膚、體壁、體腔液細胞、疣足和縱肌等8個組織中均有不同程度的表達,其中在體腔液細胞和呼吸樹組織中的表達量較高(P< 0.05);膠原蛋白琢2基因在刺參管足、呼吸樹、體壁、疣足和縱肌組織中的表達量隨月齡的增加而逐漸增加,其中在呼吸樹組織中表達量最高,在縱肌、疣足、體壁、腸和體腔液細胞等組織中的表達量逐漸降低;整合蛋白琢V基因在縱肌組織中的表達量隨月齡的增加而逐漸增加;整合蛋白茁L基因在皮膚、體壁、疣足和管足組織中的表達量較低。本研究結果為深入研究刺參這4個功能基因提供了參考。

刺參;腱生蛋白基因;膠原蛋白琢2基因;整合蛋白琢V基因;整合蛋白茁L基因;表達分析

刺參Apostichopus japonicus是中國海水養(yǎng)殖單種產值最高的經濟種類之一。多年來,科研工作者對刺參的生物學進行了全方位的研究,包括刺參的消化生理、生態(tài)免疫、行為生態(tài)、夏眠、再生、白化、營養(yǎng)和健康苗種繁育等方面,為刺參養(yǎng)殖、繁育、病害防治等更深入地研究提供了堅實的理論基礎[1]。此外,國內外許多學者利用分子生物學手段對刺參做了大量的研究工作,取得了較大的階段性成果。王秀利等[2]、彭薇[3]、Li等[4]、Li等[5]、Du等[6]、Peng等[7]、Yang等[8]在刺參SSRs、AFLP、SNPs的開發(fā)與應用中進行了研究。Wang等[9]、丁君等[10]和孫國華等[11]對刺參微衛(wèi)星標記與經濟性狀相關性進行了研究,并篩選出連鎖位點。孫文靜[12]進行了刺參生長性狀的QTL分析,并采用復合區(qū)間作圖法在刺參的連鎖群上定位了21個與生長相關性狀(體長、體寬、體質量、體壁質量和出肉率)的QTL。劉進等[13]采用流式細胞術測定刺參基因組大小為(880.20依58.68)Mb,刺參體腔細胞的單倍體基因組含量的C-值為(0.90依0.06)pg。聶鴻濤[14]利用微衛(wèi)星標記構建了刺參遺傳圖譜。杜慧霞[15]構建了刺參遺傳圖譜并對刺參夏眠發(fā)育相關的轉錄組進行了分析。鄢榮歆等[16]、楊愛馥等[17]、王艷玲等[18]、Qiu等[19]、Zhou等[20]對刺參組織蛋白酶L基因、microRNAs、轉鐵蛋白等功能基因進行了克隆與表達研究。Zhao等[21]和Chen等[22]對刺參夏眠時DNA甲基轉移酶、甲基化結合域基因、腸中miRNAs的差異表達進行了分析。Sun等[23]構建了刺參腸道和體壁再生時的大規(guī)模基因表達譜。還有一些學者對刺參Toll樣受體、凝集素、補體、熱激蛋白,以及功能酶、多糖、三萜甙等免疫相關基因的克隆、表達及相關活性物質進行了研究[24-33]。

腱生蛋白(Tenascin)、膠原蛋白(Collagen)和整合蛋白(Integrin)是動物蛋白質中的主要成分。腱生蛋白也稱細胞黏合素,是由一種星形細胞合成并分泌的細胞外基質蛋白,主要功能是加強結締組織,調節(jié)細胞形態(tài)。膠原蛋白是一種生物高分子,是動物結締組織中的主要成分,占蛋白質總量的25%~30%,在某些生物體中膠原蛋白甚至高達80%以上[34]。整合蛋白又稱整合素,是一類普遍存在于動物細胞表面,依賴于Ca2+或Mg2+的異親型細胞黏附分子,介導細胞和細胞間以及細胞和細胞外基質間的相互識別和黏附,具有聯(lián)系細胞外部與細胞內部結構的作用[35]。腱生蛋白基因、膠原蛋白基因和整合蛋白基因的表達對動物生長發(fā)育具有重要的科學意義和實際應用價值,但這3個蛋白基因在刺參生長發(fā)育階段的表達等方面的文獻不多,研究相對零散,還未見系統(tǒng)的研究報道。在前期工作的基礎上[36-37],本研究中利用候選基因策略,對腱生蛋白基因、膠原蛋白琢2基因、整合蛋白琢V基因和整合蛋白茁L基因等4個功能候選基因進行分析,旨在為今后深入研究這4個基因的功能及其在刺參健康養(yǎng)殖和育種上的應用提供參考。

表1 本試驗中采用的qRT-PCR引物序列Tab.1Primer sequences of qRT-PCR used in the experiment

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用刺參為大連灣養(yǎng)殖場的同一群體刺參,并在大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室暫養(yǎng)。在刺參生長至12、13和14月齡時,隨機選擇30頭刺參,分別采集腸、管足、呼吸樹、皮膚、體壁、體腔液、疣足、縱肌等組織,在液氮中保存?zhèn)溆?。每個月齡的刺參個體間的同一種組織樣品量基本相同,用每10頭刺參的相同組織組成1個混合樣品(pool),每個生長階段每種組織均有3個平行的混合樣品(pool)。

rTaq DNA聚合酶、dNTPs、M-MLV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒、SYBR Primix Ex TaqTM域試劑盒、EASY Dilution、RNase free dH2O等均購自大連寶生物有限公司;TransStart襃Top Green Qpcr SuperMix購自全式金生物公司;Trizol試劑購自美國Life公司;其他常規(guī)試劑取自大連海洋大學基因工程實驗室。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取提取刺參3個生長階段(12、13和14月齡)時腸、管足、呼吸樹、皮膚、體壁、體腔液、疣足、縱肌等組織的總RNA,對每個生長階段每種組織的3個混合樣品(pool)分別提取總RNA。按照Trizol總RNA提取試劑說明書方法進行總RNA的提取?？俁NA質量檢測合格后進行下一步試驗。

1.2.2qRT-PCR的引物設計根據本研究的前期工作[35,37],對4個功能基因(腱生蛋白基因、膠原蛋白琢2基因、整合蛋白琢V基因和整合蛋白茁L基因),利用生物學軟件Primer Premier 5.0進行引物設計。內參基因選擇細胞色素B基因,其引物序列參照參考文獻[38]。4個功能基因和內參基因的qRT-PCR引物序列見表1。

1.2.3 反轉錄使用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒進行cDNA第一鏈的合成,反應步驟按試劑盒說明書進行。反轉錄反應體系(共10 m L):5伊PrimeScriptTMBuffer 2 m L,PrimeScriptTMRT Enzyme Mix玉0.5 m L,Oligo dT Primer(50滋mol/L)0.5 m L,Random 6 mers(100滋mol/L)0.5 m L,Total RNA(100 ng/m L)5 m L,RNase free dH2O 1.5 m L。反轉錄反應在ABI2720 PCR儀中進行,反應條件如下:37益下反轉錄反應15 min;85益下滅活5 s,4益下保存。反轉錄完成后使用核酸分析儀測定cDNA模板濃度。

1.2.4 實時熒光定量PCR在qRT-PCR前,每一個生長階段刺參各種組織的cDNA調整至相同的濃度。實時熒光定量采用SYBR Green玉嵌合熒光法,選擇相對定量中的2-吟吟Ct法分析基因的表達水平。

1.2.4.1 實時定量PCR體系及反應條件實時定量PCR總體系為20 m L,其中包括2伊TransStart襃Top Green qPCR SuperMix 10滋L,上、下游引物(10滋mol/L)各0.4滋L,Passive Reference Dye (50伊)(optional)0.4滋L,模板cDNA 1滋L,無Rnase酶水7.8滋L。反應條件為:95益下預變性30 s;95益下變性10 s,60益下退火和延伸25 s,共進行40個循環(huán)。

1.2.4.2 標準曲線的建立采用相對定量2-吟吟Ct法,根據預試驗結果選擇表達量較高(高拷貝數)且均一穩(wěn)定的標準品。內參基因和目的基因分別建立一條標準曲線,標準品初始濃度為50 ng/滋L, 10倍稀釋,5個稀釋點,每個稀釋點重復3次。

1.2.4.3 模板的稀釋根據預試驗結果,最佳模板濃度為12.5 ng/m L。以刺參各組織總RNA反轉錄成的cDNA濃度為50 ng/滋L,所有待測樣品需稀釋4倍以達到最佳濃度,取10滋L濃度為50 ng/滋L的cDNA,加入30滋L EASY Dilution,稀釋好備用。

1.2.4.4 實時定量PCR使用ABISteponePlus熒光定量PCR儀,按照TransStart襃Top Green qPCR SuperMix實時定量試劑盒說明書配制混合試劑,按照軟件程序設定反應條件進行定量PCR。每個反應重復3次,每個基因分別做3個陰性對照。

1.2.4.5 實時定量數據分析實時定量數據分析采用2-吟吟Ct法,功能基因表達的相對濃度計算公式為[38-39]

其中:Ct為熒光信號達到設定域值時經歷的循環(huán)數;CtA為目的基因的Ct值;CtB為內參基因的Ct值;ExA為目的基因的擴增效率;ExB為內參基因的擴增效率。具體計算過程如下:

(1)計算每個個體的吟Ct,吟Ct=CtA-CtB;

(2)計算各組刺參吟Ct平均值,選擇吟Ct平均值最高的一組作為參照組;

(3)計算每個個體的吟吟Ct,公式為

(4)計算每個個體的2-吟吟Ct值,計算結果取平均值和標準偏差。

2 結果與分析

2.1 刺參組織總RNA、內參基因和功能候選基因的標準曲線和溶解曲線

在刺參3個生長階段中,每一種組織均按試驗材料和方法中的步驟進行總RNA的提取?？俁NA經瓊脂糖凝膠電泳檢測以及濃度和純度測定,總RNA的數量和質量滿足后續(xù)試驗的需要。

以細胞色素B基因為內參基因,對所有組織的4個基因建立標準曲線和溶解曲線。標準曲線斜率(slope)為-3.339,擴增效率(Eff)為96.889%,相關系數(R2)為0.972,相關系數大于0.97,顯示了良好的線性關系。溶解曲線峰值單一,未產生非特異性擴增和引物二聚體,反應結果十分理想。腱生蛋白基因、膠原蛋白琢2基因、整合蛋白琢V基因和整合蛋白茁L基因的標準曲線和溶解曲線結果均十分理想。

2.2 刺參4個功能基因在不同生長階段及不同組織間的差異表達

腱生蛋白基因、膠原蛋白琢2基因、整合蛋白琢V基因和整合蛋白茁L基因分別在刺參12、13、14月齡的差異表達以及在不同組織中的差異表達見圖1和圖2。在3個月的時間點,腱生蛋白基因在腸、管足、呼吸樹、皮膚、體壁、體腔液細胞、疣足和縱肌組織中均有不同程度的表達(圖1-A);其中12月齡時,腱生蛋白基因于在體腔液細胞中表達量最高,且顯著或極顯著高于其他組織(P<0.05或P<0.01),在呼吸樹組織中表達量較高(P< 0.05),在縱肌、皮膚、疣足、體壁和腸等組織中的表達量依次降低;13、14月齡時,腱生蛋白基因在呼吸樹組織中表達量最高,在體腔液細胞、縱肌等組織中的表達量依次降低。膠原蛋白琢2基因在管足、呼吸樹、體壁、疣足和縱肌組織中,隨著刺參月齡的增加其表達量逐漸增加,在其他組織中表達量與月齡之間無明顯的關系;所有組織中,膠原蛋白琢2基因的表達量在呼吸樹組織中最高,且顯著或極顯著高于其他組織(P<0.05或P< 0.01),在縱肌、疣足、體壁、腸、體腔液細胞等組織中的表達量逐漸降低(圖1-B)。12月齡時,整合蛋白琢V基因在體腔液中表達量最高,且顯著或極顯著高于其他組織(P<0.05或P<0.01);而13、14月齡時,整合蛋白琢V基因在腸組織中表達量最高,在體腔液細胞、呼吸樹、縱肌、疣足和體壁組織中的表達量依次降低(圖2-A);整合蛋白琢V基因在縱肌和疣足組織中隨著月齡的增加其表達量逐漸增加,但在腸、呼吸樹、管足、皮膚中,該基因在13月齡時的表達量顯著高于在12和14月齡的表達量(P<0.05)。3個生長階段,整合蛋白茁L基因在體腔液中的表達量顯著高于其他組織(P<0.05),在體壁、管足、疣足中的表達量無顯著性差異(P>0.05);不同生長階段,各組織整合蛋白茁L基因表達量無一致趨勢(圖2-B),但在皮膚、體壁、疣足和管足組織中的表達量較低。

注:相鄰、相隔小寫字母之間分別表示同一生長時期不同組織之間基因表達量存在顯著性差異(P<0.05)和極顯著性差異(P<0.01),相鄰、相隔大寫字母之間分別表示同一組織不同生長時期基因表達量存在顯著性差異(P<0.05)和極顯著性差異(P<0.01),下同Note:Themeanswith adjacentand apart different letters in different organizations in the same growth period are significant difference(P<0.05)and very significant difference(P<0.01)in genesexpression quantity,respectively,and themeanswith adjacentand apart different capital letters in dif-ferent growth period in the same organizations are significant difference(P<0.05)and very significant difference(P<0.01)in genes expression quantity,et sequentia

圖2 整合蛋白琢V基因和整合蛋白茁L基因在刺參不同生長階段不同組織中表達Fig.2Relative expression of the integrin琢V gene and integrin茁L gene in various tissues of different month old sea cu-cumber Apostichopus japonicus

3 討論

目前,盡管對刺參腱生蛋白、膠原蛋白和整合蛋白等基因表達方面的研究較少,但仍有部分報道。Ba等[40]克隆了腱生蛋白基因,并對腱生蛋白基因在刺參再生過程中的表達進行了分析,研究結果表明,腱生蛋白基因表達的最高水平出現在刺參去內臟后第20天的腸和呼吸樹組織中,以及刺參被損傷后45 min(早期再生)時和7 d(晚期再生)時。原位雜交分析表明,腱生蛋白基因在體壁、縱肌、腸和呼吸樹中均有表達,但該研究未分析腱生蛋白基因在管足、皮膚、體腔液和疣足等組織中的表達情況[40]。本研究結果表明,腱生蛋白基因在呼吸樹組織中表達量較高,與Ba等[40]的研究結果一致。此外,腱生蛋白基因在體腔液、呼吸樹組織中高表達,在其他組織中低表達,造成與Ba等[40]的研究結果不一致,其原因可能是經生物信息學分析,本研究中獲得的腱生蛋白基因為腱生蛋白家族一員,但與Ba等[40]克隆的腱生蛋白同源性為50%,故造成表達量及在不同組織表達差別。

本研究表明,8種組織中膠原蛋白琢2基因在刺參呼吸樹組織中表達量最高,在疣足組織中表達量相對較低,這與Zhou等[37]的試驗結果一致。但膠原蛋白琢2基因在腸、體壁、體腔液細胞和縱肌等組織也有低表達,在管足和皮膚組織中基本不表達,而Zhou等[37]的研究結果表明,膠原蛋白琢2基因在皮膚組織中有較低的表達。

本研究中,整合蛋白琢V基因和整合蛋白茁L基因在腸、管足、呼吸樹、體腔液細胞和縱肌等組織中均有不同程度的表達,但在同一種組織中不同月齡時的表達量差異較大。同時,這兩個基因在皮膚和疣足組織中表達量較低,該結果與Zhou等[37]的研究結果一致。

本研究中發(fā)現,刺參4個功能基因在各組織中的12、13、14月齡時的表達情況較混亂,但大體趨勢符合刺參的生物學特性。個別基因在不同組織中和不同月齡時表達情況出現的較大差異,需今后深入研究。當然,個別基因在不同組織中和不同月齡時的表達情況與預期的結果有較大出入,可能有以下原因:(1)本研究中所采用的刺參群體盡管來源于同一群體,但是由多雄和多雌的親參繁殖后代組成的群體,可能造成群體中的個體差異較大。(2)每個月齡時采集30頭刺參,可能是樣本量較少造成的誤差。(3)所用刺參群體如果存在近交的情況,也可能造成生長發(fā)育不規(guī)律以及生長勢、適應性和抗逆性下降等衰退現象。本研究結果為今后深入研究這4個功能基因的功能及表達規(guī)律提供了一定參考。

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Expression analysis of four functional genes in sea cucumber Apostichopus japonicas

GU Chen-lei1,2,ZHOU Xiao-xu1,LIU Yang1,YU Hai-long1,KONG De-rong1, SONG Jian1,QIU Xue-mei1,CHANG Ya-qing1,WANG Xiu-li1,2
(1.College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Dalian Fisheries Industry Technology Innovation Associ-ation,Dalian 116023,China)

Tissue expression levels of four candidate genes including tenascin gene,collagen琢2 gene,integrin琢V gene and integrin茁L gene were investigated in differentmonth old sea cucumber Apostichopus japonicus by RTPCT.The results showed that therewere different expression levels of tenascin gene in intestines,tube foot,respir-atory tree,skin,body wall,coelomic fluid,parapodium and longitudinalmuscle of the sea cucumber at age of12, 13,and 14 months,significantly higher in coelomic fluid and respiratory tree than in other tissues(P<0.05).The expression levels of collagen琢2 gene were shown to be increased in tube foot,respiratory tree,body wall,parapo-dium and longitudinalmuscle with increase in month age,themaximal expression in respiratory tree,and gradual decline in longitudinalmuscle,parapodium,body wall,intestines and coelomic fluid.The expression levels of in-tegrin琢V gene were found to be gradually increased in longitudinalmuscle,parapodium and body wallwithmonth age increasing.There were lower expression levels of integrin茁L gene in skin,body wall,parapodium and tube foot.The findings provided foundation for further understanding of the four genes in sea cucumber.

Apostichopus japonicus;tenascin gene;collagen琢2 gene;integrin琢V gene;integrin茁L gene;expres-sion analysis

S917

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.03.002

2095-1388(2017)03-0262-06

2016-05-30

國家自然科學基金資助項目(31572608);遼寧省高等學校優(yōu)秀人才支持計劃項目(LR2014022);大連市科技計劃項目(2012B11NC049)

顧晨雷(1991—),男,碩士研究生。E-mail:nkss@qq.com

王秀利(1964—),男,博士,教授。E-mail:xlwang@dlou.edu.cn