孫雪瑩,劉繼晨,李明,趙學偉,梁峻,孫丕海,馬悅欣(.大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連60;.獐子島集團股份有限公司,遼寧大連600; .大連海洋大學海珍品苗種培育基地,遼寧大連60)

蝦夷扇貝苗種培育水中可培養(yǎng)細菌群落分析

孫雪瑩1,劉繼晨1,李明2,趙學偉2,梁峻2,孫丕海3,馬悅欣1
(1.大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023;2.獐子島集團股份有限公司,遼寧大連116001; 3.大連海洋大學海珍品苗種培育基地,遼寧大連116023)

為研究蝦夷扇貝Patinopecten yessoensisis苗種培育過程中幼體發(fā)育5個時期苗種培育水中(受精卵期水樣W1,擔輪幼蟲期水樣W2,D型幼蟲期水樣W3,殼頂幼蟲期水樣W4,稚貝期水樣W5)可培養(yǎng)細菌的群落組成,采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法,從每個水樣分離細菌30株,通過16S rRNA基因測序分析鑒定細菌。結(jié)果表明:分離的150株細菌可歸為2門、3綱、6目、9科、10屬、22種;在門水平,W1~W5的優(yōu)勢門均為變形菌門,其次為厚壁菌門;在屬水平,假交替單胞菌屬為所有水樣第一優(yōu)勢屬,此外,W1的優(yōu)勢屬依次為交替單胞菌屬、弧菌屬和海桿菌屬,W2的優(yōu)勢屬依次為弧菌屬、交替單胞菌屬和Cobetia,W3的優(yōu)勢屬依次為弧菌屬、交替單胞菌屬和芽孢桿菌屬,W4的優(yōu)勢屬依次為交替單胞菌屬、芽孢桿菌屬和弧菌屬, W5的優(yōu)勢屬依次為弧菌屬、Pseudophaeobacter、芽孢桿菌屬和赤桿菌屬。研究表明,扇貝幼體不同發(fā)育時期苗種培育水中所含可培養(yǎng)細菌種類比較豐富,細菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。

蝦夷扇貝;育苗培育水;16S rRNA基因;細菌群落

水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中,尤其是在敏感的幼體飼養(yǎng)階段,水質(zhì)對健康動物的生長發(fā)育至關(guān)重要。水質(zhì)指標包括物理、化學指標,以及所含細菌的數(shù)量和類型[1]。細菌性疾病是世界范圍內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)的最大限制因素之一,其中弧菌屬細菌是最常報道的病原體[2-4]。

細菌的來源之一是苗種培育過程中使用的海水。Sandaa等[5]研究發(fā)現(xiàn),大扇貝Pecten maximus苗種培育過程中,不同養(yǎng)殖系統(tǒng)(靜態(tài)系統(tǒng)、循環(huán)水系統(tǒng)和經(jīng)過臭氧處理的循環(huán)水系統(tǒng))水中細菌群落結(jié)構(gòu)高度相似。Godoy等[6]研究表明,使用抗生素處理紫扇貝Argopecten purpuratus幼體,其養(yǎng)殖水中可培養(yǎng)細菌的數(shù)量和優(yōu)勢屬與未處理組不同,幼體存活率也不同。在蝦夷扇貝Patinopecten yessoensisis苗種培育過程中,常發(fā)生苗種大量死亡的現(xiàn)象,已證明燦爛弧菌Vibrio splendidus和塔斯馬尼亞弧菌Vibrio tasmaniensis是扇貝幼體死亡的致病菌[4],目前,尚不清楚苗種培育水中細菌是否與幼體疾病相關(guān)。本試驗中,使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和16S rRNA基因序列分析了扇貝幼體不同發(fā)育時期苗種培育水中細菌群落組成,以期為苗種培育生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)控與管理及病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

蝦夷扇貝苗種培育在獐子島海珍品原良種場進行,將經(jīng)過沙濾和沉淀處理后的海水100 L加入塑料桶中,扇貝幼體養(yǎng)殖密度為5~6只/mL,每天7:00~8:00換水1次,每次換水50 L。餌料以叉鞭金藻Dicrateria inornata為主,孵化初期,每天投喂叉鞭金藻3次(8:00、15:00、23:00),每次100 mL[(7~9)伊105cells/mL],至受精后7 d,補充添加10 mL[(2~4)伊106cells/mL]新月菱形藻Nitzschia closterium,隨后每天增加10 mL,至100 mL時不再增加,后續(xù)試驗中每天投喂餌料3次,每次添加叉鞭金藻和新月菱形藻各100 mL。通過氣石充氣,水溫保持在(15依1)益,鹽度為(32依0.5)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集于2014年3—4月在蝦夷扇貝幼體發(fā)育的5個時期,無菌采集苗種培育水樣1 L(3個苗種培育桶各采集500 mL混合),受精卵、擔輪幼蟲、D型幼蟲、殼頂幼蟲和稚貝時期的樣品分別標記為W1、W2、W3、W4和W5。

1.2.2 細菌的分離、計數(shù)和純化將采集的水樣進行梯度稀釋,取0.1 mL稀釋液涂布于2216E平板上,在15益下培養(yǎng)7 d,計數(shù)。在適當稀釋度的平板上各隨機挑取30個菌落,于2216E平板上分離純化,獲得純培養(yǎng)菌株于冰箱中保存。

1.2.3 細菌DNA的提取、PCR擴增和序列測定將純菌株接種到2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,使用土壤基因組DNA快速提取試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取細菌基因組DNA,提取方法參照試劑盒說明書。細菌16S rRNA基因片段的擴增引物為F27/R1492,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列參照文獻[7]。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參考文獻[4]。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物是否符合目標條帶。由生工生物工程(上海)股份有限公司完成PCR產(chǎn)物的測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將獲得的各菌株序列在EzBioCloud(http:// www.ezbiocloud.net/eztaxon)公共數(shù)據(jù)庫中進行序列同源性比對,從結(jié)果中取第一個相似性最高的序列。將比對后相似性大于97%的菌株作為一個種[8],反之則為兩個。為比較幼體不同發(fā)育時期苗種培育池水細菌群落差異,計算Shannon多樣性指數(shù)[9]、Pielou均勻度指數(shù)[10]和S覬rensen相似性指數(shù)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 扇貝苗種培育水中異養(yǎng)細菌計數(shù)

扇貝苗種培育水中異養(yǎng)細菌計數(shù)結(jié)果如表1所示,W1的細菌數(shù)量最少,W3的細菌數(shù)量最多。

2.2 扇貝苗種培育水中細菌群落組成分析

經(jīng)16S rRNA基因序列比對,150株細菌歸屬于2門,即變形菌門Proteobacteria和厚壁菌門Fir-micutes;3綱,即酌變形菌綱酌-Proteobacteria、琢變形菌綱琢-Proteobacteria和芽孢桿菌綱Bacillus (圖1);6目,即交替單胞菌目Alteromonadales、弧菌目Vibrionales、海洋螺菌目Oceanospirillales、芽孢桿菌目Bacillales、紅桿菌目Rhodobacterales和鞘脂單胞菌目Sphingomonadales;9科,即假交替單胞菌科Pseudoalteromonadaceae、交替單胞菌科Alteromonadaceae、弧菌科Vibrionaceae、Marino-bacter_f、鹽單胞菌科Halomonadaceae、芽孢桿菌科Bacillaceae、希瓦氏菌科Shewanellaceae、紅桿菌科Rhodobacteraceae和赤桿菌科Erythrobacteraceae (圖2);10屬,即假交替單胞菌屬Pseudoaltero-monas、交替單胞菌屬Alteromonas、弧菌屬Vibrio、海桿菌屬Marinobacter、Cobetia、芽孢桿菌屬Bacil-lus、希瓦氏菌屬Shewanella、亞硫酸桿菌屬Sulfito-bacter、Pseudophaeobacter和赤桿菌屬Erythrobacter (圖3)。

表1 扇貝苗種培育水中異養(yǎng)細菌數(shù)量Tab.1Heterotrophic bacterial counts in the water of scal-lop larva rearing tanks

圖1 扇貝苗種培育水中可培養(yǎng)細菌的群落組成(綱水平)Fig.1Culturable bacterial community composition in the water of scallop larva rearing tanks(in class)

從圖1可知,扇貝苗種培育水中酌-變形菌綱為優(yōu)勢綱,除W1外,其余4個時期水樣還含有芽孢桿菌綱,只有W4和W5中含有琢-變形菌綱。

交替單胞菌目為W1~W5中第一優(yōu)勢目,占總數(shù)的比例依次為83.33%、73.33%、73.33%、80.00%和56.67%。其中,弧菌目為W1(13.33%)、W2(16.67%)、W3(20.00%)和W5(16.67%) 4個時期水樣的第二優(yōu)勢目,芽孢桿菌目(10.00%)為W4的第二優(yōu)勢目,W5的優(yōu)勢菌目還有紅桿菌目(13.33%)。

從圖2可知:假交替單胞菌科是W1~W5中第一優(yōu)勢科;W1和W2的其余優(yōu)勢科依次為交替單胞菌科(23.33%和16.67%)和弧菌科(13.33%和16.67%),W3的其余優(yōu)勢科依次為弧菌科(20.00%)和交替單胞菌科(13.33%), W4的其余優(yōu)勢菌科依次為交替單胞菌科(13.33%)和芽孢桿菌科(10.00%),W5的其余優(yōu)勢菌科依次為弧菌科(16.67%)和紅桿菌科(13.33%)。

圖2 扇貝苗種培育水中可培養(yǎng)細菌的群落組成(科水平)Fig.2Culturable bacterial community composition in the water of scallop larva rearing tanks(in fam ily)

從圖3可知:假交替單胞菌屬為W1~W5中第一優(yōu)勢屬,所占比例依次為53.33%、56.67%、53.33%、66.67%和56.67%;W1的其余優(yōu)勢屬依次為交替單胞菌屬(23.33%)、弧菌屬(13.33%)和海桿菌屬(6.67%);W2的其余優(yōu)勢屬依次為交替單胞菌屬(16.67%)、弧菌屬(16.67%)和Cobetia(6.67%);W3的其余優(yōu)勢屬依次為弧菌屬(20.00%)、交替單胞菌屬(13.33%)和芽孢桿菌屬(6.67%);W4的其余優(yōu)勢屬依次為交替單胞菌屬(13.33%)、芽孢桿菌屬(10.00%)和弧菌屬(6.67%);W5的其余優(yōu)勢屬依次為弧菌屬(16.67%)、Pseudophae-obacter(10.00%)、芽孢桿菌屬(6.67%)和赤桿菌屬(6.67%)。

綜上所述,不同幼體發(fā)育時期苗種培育水中(W1~W5)異養(yǎng)細菌的群落組成存在差異,除各時期第一優(yōu)勢門(變形菌門)、綱(酌-變形菌綱)、目(交替單胞菌目)、科(假交替單胞菌科)和屬(假交替單胞菌屬)一致外,W4中第二優(yōu)勢目發(fā)生改變,W3和W5中第二優(yōu)勢科屬與其他3個水樣不同,W4和W5中第三優(yōu)勢科發(fā)生演替,W3、W4和W5中第三優(yōu)勢屬發(fā)生改變且各不相同。

所有菌株與數(shù)據(jù)庫中相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列相似性為99%。按16S rRNA基因序列相似性大于97%的菌株歸于同一種計[9],150株細菌可歸為22個種。扇貝苗種培育水中種水平細菌群落組成見表2。

從Shannon指數(shù)和Pielou指數(shù)可以看出,幼體不同發(fā)育時期苗種培育水中細菌多樣性稍有變化,細菌種類分布較為均勻(表3)。S覬rensen指數(shù)表明,幼體不同發(fā)育時期苗種培育水中細菌群落存在差異,其中W5與W1、W2、W3和W4,W4與W1細菌群落差異較為明顯(表4)。

圖3 扇貝苗種培育水中可培養(yǎng)細菌的群落組成(屬水平)Fig.3Culturable bacterial community composition in the water of scallop larva rearing tanks(in ge-nus)

3 討論

3.1 扇貝苗種培育水中異養(yǎng)細菌數(shù)量及群落變化

隨著蝦夷扇貝幼體的生長發(fā)育,其苗種培育水中異養(yǎng)細菌數(shù)量不斷變化,受精卵期,水樣中細菌數(shù)量為102CFU/mL,從擔輪幼蟲期到稚貝期水中細菌數(shù)量穩(wěn)定在104CFU/mL。本試驗中所得細菌數(shù)量與紫扇貝幼體養(yǎng)殖水中細菌數(shù)量[6]接近。大扇貝幼體發(fā)育早期階段(4~11 d),靜態(tài)養(yǎng)殖系統(tǒng)水中細菌群落略有波動,DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶數(shù)目只有輕微變化[5]。tRFLP(限制性片段長度多態(tài)性)數(shù)據(jù)表明,太平洋牡蠣Crassostrea gigas苗種培育階段,不同天清潔海水(經(jīng)泡沫分離和過濾處理,加幼體或餌料之前)細菌群落顯著不同[1]。本研究中,蝦夷扇貝幼體不同發(fā)育時期苗種培育水中細菌群落組成存在差異,細菌群落演替的驅(qū)動力之一可能是進水細菌群落的變化[1,5],餌料(叉鞭金藻和新月菱形藻相關(guān)優(yōu)勢菌包括芽孢桿菌屬、希瓦氏菌屬、弧菌屬和假交替單胞菌屬等,未發(fā)表資料)和不同生長階段幼體攜帶細菌的群落變化也可能影響水體細菌群落的演替[12]。

表2 扇貝苗種培育水中可培養(yǎng)細菌的群落組成(種水平)Tab.2Culturable bacterial community com position in the water of scallop larva rearing tanks(in species)

表3 扇貝苗種培育水中細菌群落的Shannon指數(shù)和Pielou指數(shù)Tab.3Shannon and Pielou indices of bacterial community in the water of scallop larva rearing tanks

表4 扇貝苗種培育水中細菌群落的S覬rensen指數(shù)Tab.4S覬rensen index of bacterial community in the wa-ter of scallop larva rearing tanks

3.2 扇貝苗種培育水中細菌群落組成

在綱水平,蝦夷扇貝苗種培育水中優(yōu)勢綱為酌-變形菌綱,該結(jié)果與對大扇貝苗種培育系統(tǒng)水中相關(guān)細菌群落的研究結(jié)果一致[5],酌-變形菌綱也是紫扇貝幼體養(yǎng)殖水中的主要優(yōu)勢菌[6,13]。從蝦夷扇貝苗種培育水中還可分離出屬于芽孢桿菌綱和琢-變形菌綱的細菌,芽孢桿菌綱也存在于紫扇貝幼體養(yǎng)殖水中[6],琢-變形菌綱為太平洋牡蠣苗種培育用清潔海水中第一優(yōu)勢綱[1],也可在大扇貝苗種培育系統(tǒng)進水口水樣中檢測到[5]。在屬水平,共分離到10個屬。其中假交替單胞菌屬、交替單胞菌屬和弧菌屬曾從包括蝦夷扇貝在內(nèi)的魚和貝類養(yǎng)殖場周圍海水中分離出[14]。大扇貝苗種培育系統(tǒng)水中可檢測到假交替單胞菌屬和弧菌屬[5]。從紫扇貝幼體養(yǎng)殖水中可分離出交替單胞菌屬、芽孢桿菌屬和海桿菌屬[6]。地中海牡蠣養(yǎng)殖海水中存在交替單胞菌屬/假交替單胞菌屬/希瓦氏菌屬群[4]。在近岸海水中均可發(fā)現(xiàn)Cobetia、亞硫酸桿菌屬、Pseudophaeobacter和Erythrobacter[15-18]。

已有研究表明,弧菌是扇貝幼體主要的致病菌[4,19-21]。在苗種培育過程中,蝦夷扇貝幼體死亡現(xiàn)象發(fā)生在D形幼蟲到殼頂幼蟲過渡期和整個殼頂幼蟲期。Liu等[4]通過人工感染試驗證實,燦爛弧菌是幼體大量死亡的致病菌。本試驗中,從D形幼蟲期苗種培育水中分離出的燦爛弧菌可能是幼體病原菌的來源,因為同時進行的高通量測序數(shù)據(jù)分析表明,該菌的豐度在擔輪幼蟲和D型幼蟲階段明顯高于受精卵、殼頂幼蟲和稚貝3個階段,而且幼體攜帶該菌的豐度是D型幼蟲和殼頂幼蟲階段,高于其他3個階段[22]。燦爛弧菌也是紫扇貝幼體大量死亡的病原菌[3]。Vibrio neocaledonicus在擔輪幼蟲、D型幼蟲和殼頂幼蟲期出現(xiàn),可能存在潛在致病性,該菌曾從弧菌病暴發(fā)的菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum幼體中分離出[23]。除弧菌外,假交替單胞菌屬的某些菌株也可能是潛在致病菌,如假交替單胞菌LT13菌株在攻毒試驗中會導致10~16 d大扇貝幼體大量死亡[20]。另外,尤其要注意的是從水中分離出與人類病原菌炭疽桿菌Bacillus anthracis相似性為99%的菌株。因此,在扇貝苗種培育過程中應(yīng)十分重視對包括細菌在內(nèi)的水質(zhì)監(jiān)測。

本研究中,從扇貝苗種培育水中分離出的若干交替單胞菌、芽孢桿菌、弧菌、假交替單胞菌和Pseudophaeobacter arcticus,可能對扇貝幼體產(chǎn)生有益的影響。Douillet等[24]研究表明,交替單胞菌CA2菌株可提高太平洋牡蠣Crassostrea gigas幼體的存活率和生長率。麥氏交替單胞菌0444菌株可顯著提高新西蘭綠唇貽貝Perna canaliculus幼體的存活率,并增強其對病原菌弧菌DO1菌株的抵抗力[25],該菌株和Phaeobacter gallaeciensis可保護大扇貝幼體免受病原菌燦爛弧菌和Vibrio coralliilyticus的感染,保護歐洲牡蠣Ostrea edulis幼體免受V.coralliilyticus和Vibrio pectenicida的感染[26]。Phaeobacter sp.S4或短小芽孢桿菌Bacillus pumilus RI06-95可以保護美洲牡蠣Crassostrea virginica幼體免受病原菌Vibrio tubiashii RE22和Roseovarius crassostreae CV919-312T攻毒導致的死亡[27]。含弧菌C33菌株、假單胞菌11菌株和芽孢桿菌B2菌株的混合菌能夠提高紫扇貝幼體存活率,使其在不使用抗生素的情況下順利度過浮游幼體階段[28]?；【鶲Y15菌株可使美洲牡蠣幼體經(jīng)病原菌弧菌B183菌株攻毒后48 h存活率提高[29],并且無論是否用B183菌株攻毒,該菌株也能顯著提高美洲牡蠣在幼體變態(tài)過程中的存活率[30]。假交替單胞菌D41菌株可增強大扇貝幼體對燦爛弧菌感染的抵抗力,該菌株和P.gallaeciensis能保護太平洋牡蠣幼體免受V.coralliilyticus的感染[25]。本試驗中分離的屬于交替單胞菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬和假交替單胞菌屬和P.arcticus的菌株是否可作為益生菌應(yīng)用在蝦夷扇貝苗種培育中有待進一步研究。

本研究表明,扇貝幼體不同發(fā)育時期苗種培育水中可培養(yǎng)細菌種類比較豐富,細菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。

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[28]Riquelme C E,Jorquera M A,Rojas A I,et al.Addition of inhibi-tor-producing bacteria to mass cultures of Argopecten purpuratus larvae(Lamarck,1819)[J].Aquaculture,2001,192(2-4): 111-119.

[29]Lim H J,Kapareiko D,Schott E J,et al.Isolation and evaluation of new,probiotic bacteria for use in shellfish hatcheries:I.isola-tion and screening for bioactivity[J].Journal of Shellfish Re-search,2011,30(3):609-615.

[30]Kapareiko D,Lim H J,Schott E J,et al.Isolation and evaluation of new probiotic bacteria for use in shellfish hatcheries:II.effects of a Vibrio sp.probiotic candidate upon survival of oyster larvae (Crassostrea virginica)in pilot-scale trials[J].Journal of Shell-fish Research,2011,30(3):617-625.

Characterization of culturable bacterial diversity in the water of Yesso scallop Patinopecten yessoensisis larva rearing tanks

SUN Xue-ying1,LIU Ji-chen1,LIMing2,ZHAO Xue-wei2,LIANG Jun2,SUN Pi-hai3,MA Yue-xin1
(1.Key Laboratory ofMariculture and Stock Enhancement in North China蒺s Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,Chi-na;2.Zhangzidao Island Group Company Limited,Dalian 116001,China;3.Seafood Seedling Breeding Base,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

This study was aimed to examine the culturable bacterial community in the water of larva rearing tanks during Yesso scallop Patinopecten yessoensisis larval development stages(fertilized egg W1,trochophora W2,D-shaped larvaeW3,umbo larvaeW4,and juvenile scallop W5).Thirty strainswere isolated from each water sample by Zobell2216E,and 150 bacterial strainswere identified by polymerase chain reaction and partial16S rRNA gene sequencing.Results showed thatall isolateswere found to be in 2 phyla,3 classes,6 orders,9 families,10 genera and 22 species.At phylum level,Proteobacteria was themost dominant phylum in 5 water samples.At genus lev-el,the first dominantgenus in all sampleswas Pseudoalteromonas,followed by Alteromonas,Vibrio and Marinobact-er atW1 stage,Vibrio,Alteromonas and Cobetia atW2 stage,Vibrio,Alteromonas and Bacillus atW3 stage,Altero-monas,Bacillus and Vibrio atW4 stage,and Vibrio,Bacillus,Pseudophaeobacter and Erythrobacter at W5 stage. The findings show that there are abundant bacterial species and different community structure in the water of larva rearing tanks across different larval development stages.

Patinopecten yessoensisis;water in a larva rearing tank;16S rRNA gene;bacterial community

S917.1

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.03.011

2095-1388(2017)03-0323-06

2016-06-02

國家科技支撐計劃項目(2013BAD23B01);獐子島集團資助項目(99801214)

孫雪瑩(1989—),女,碩士研究生。E-mail:sunxueying1109@163.com

馬悅欣(1963—),女,博士,教授。E-mail:mayuexin@dlou.edu.cn