單 妍

(昆明醫(yī)科大學海源學院，云南 昆明 651700)

香糯竹組培技術研究

單 妍

(昆明醫(yī)科大學海源學院，云南 昆明 651700)

研究不同濃度的6-BA、不同激素種類、不同外植體、不同元素和不同土壤基質對組培試驗的影響。試驗結果表明：2.1mg/L的6-BA的種子發(fā)芽率最高；最適合的香糯竹外植體為半年生播種苗枝條；KH2PO4對于黃化苗的處理效果較顯著，適合采用；移栽適宜的土壤基質為泥炭+紅土+珍珠巖的混合基質。

香糯竹；組織培養(yǎng)；外植體;黃化苗;組培苗；種子發(fā)芽率；土壤基質

香糯竹(CephalostachyumpergracileMunro)產(chǎn)自中國云南及東南亞，在西雙版納州和思茅普洱地區(qū)栽培較廣泛。已經(jīng)有20多個國家引種該竹種。香糯竹稈叢生，直立，高達15 m，直徑5～8 cm，梢端稍下垂，稈籜為光亮的栗褐色，厚革質。節(jié)間長30～45 cm，粉綠色。幼時密被白色貼身小刺毛，節(jié)下被白色柔毛，稈壁較薄，稈環(huán)平[1]。

香糯竹也稱搖錢竹，其竹筒盛裝大米、糯米，經(jīng)蒸煮、烘烤熟后，竹腔內膜包裹在大米、糯米外圍，既美觀，又秀色可口，是上等佳肴。竹稈密集、挺拔、秀麗，是優(yōu)秀的觀賞竹；竹材結構細致，機械性能良好，是優(yōu)秀的材用竹；竹材纖維含量高，篾性好，是優(yōu)秀的造紙、竹纖維、編織原料；其竹片煮水，清香可口，為上等飲品；竹筍亦可食用。每年產(chǎn)值達30萬元/hm2以上。

竹子雖然常見，但是竹子開花并不多見。大多數(shù)竹種開花結實周期較長，且具有十花九不孕的特性，所以其繁殖方式主要為無性繁殖，如母竹分株、竹枝扦插等。但這些方法存在著所需勞動力大，成本高，繁殖系數(shù)低等缺點，不能滿足規(guī)模發(fā)展的需求。相較于傳統(tǒng)的繁殖技術，組培技術具有繁殖系數(shù)大、快速、不受季節(jié)限制等特點，有較高的經(jīng)濟效益。研究表明，叢生竹的1個芽通過組織培養(yǎng)1年內至少可以繁殖10 000叢苗，而1株竹子用節(jié)育苗繁殖1年內只能繁殖5～10叢苗[2]，因此，在竹子繁殖方式上組培技術具極大優(yōu)勢。

1 研究地點

本研究地點為云南珍竹農(nóng)業(yè)科技有限公司，嵩明縣竹子科技園。

2 研究材料

2.1 外植體

外植體為香糯竹種子，香糯竹組培苗，實生苗枝條，成年竹枝條。

2.2 實驗試劑

實驗試劑包括氯化汞(0.05%～0.15%),75%酒精,生長調節(jié)物質(GA3、6-BA、NAA、IBA、IAA),KNO3,NH4NO3,KH2PO4,MgSO4。

3 試驗方法步驟

3.1 試驗材料的選取3.1.1 種子的選取

選取顆粒飽滿的無霉、無蟲害的優(yōu)質香糯竹種子作為試驗種子[3]。

3.1.2 枝條的選取

采取新鮮的不同的香糯竹枝條(半年生播種苗枝條、1年生播種苗枝條、2年生播種苗枝條、無性繁殖苗枝條、母竹枝條)作為組培材料。要求芽較多、無病蟲，在不影響枝條正常生長存活的前提下，盡可能減少枝條的長度，這樣可盡量減少污染，有利于提高存活率。

3.2 培養(yǎng)基的制備

竹類植物的組培試驗所需的培養(yǎng)基通常為MS培養(yǎng)基。在試驗過程中根據(jù)具體需要在培養(yǎng)基中添加不同的生長激素，配制不同濃度的培養(yǎng)基[2]。

MS培養(yǎng)基：大量元素(20 mg/L)，微量元素(5 mg/L)，鐵鹽(5 mg/L)，有機物(2 mg/L)，CaCl2(20 mg/L)，糖(30 g/L)，瓊脂(4.5-5)g/L。

3.2.1 配制含有不同生長調節(jié)物質的MS培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基：生長調節(jié)物質(GA3、6-BA、NAA、IBA、IAA)，濃度根據(jù)各個培養(yǎng)階段進行調整。

3.2.2 配制含有不同濃度的6-BA的MS培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基：6-BA(1.5 mg/L，1.8 mg/L，2.1 mg/L，2.4 mg/L)。

3.2.3 配制相同濃度的6-BA的MS培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基：一般采用1.5 mg/L的6-BA進行外植體叢芽誘導；2.0 mg/L的6-BA進行叢芽增值。

3.2.4 配制生根培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基：1.0 mg/L的6-BA和0.3 mg/L的NAA相結合。

3.3 培養(yǎng)基的滅菌

滅菌的儀器為立體式自動高壓蒸汽滅菌鍋。在溫度為121℃的條件下，滅菌29 min[4]。滅菌結束后待培養(yǎng)基冷卻凝固后便可使用。滅菌過程不宜過長，否則有機物分解，會失去營養(yǎng)作用，同時也會使培養(yǎng)基變質變色。

3.4 外植體的消毒3.4.1 種子的消毒

將選好的種子剝去外殼(避免損傷胚)，放入水中浸泡0.5 h。隨后濾去水，將種子置于含量為0.1%的升汞中浸泡2～2.5 h。然后用無菌水沖洗種子3次，每次2～3 min。

3.4.2 枝條的消毒

將枝條置于無菌水中浸泡25～30 min，隨后用無菌水沖洗枝條，洗去表面的異物雜質。隨后放入0.1% 的升汞中浸泡10 min，最后用無菌水洗滌3次，每次2～3 min。

3.5 接種3.5.1 種子的接種

1)將種子接種在含有水和瓊脂的培養(yǎng)基上進行初代培養(yǎng)，5～7 d后，待胚開始萌芽，將萌芽的種子轉接入含有不同濃度的6-BA培養(yǎng)基(1.5 mg/L，1.8 mg/L，2.1 mg/L，2.4 mg/L)。

2)在超凈工作臺上進行接種，將消毒好的種子接種到含有相同濃度1.5 mg/L的不同生長調節(jié)物質(GA3、6-BA、NAA、IBA、IAA、對照CK)的培養(yǎng)基上，接種時盡量使種子表面干燥，倒出培養(yǎng)基表面的水，以防種子固定不穩(wěn)。每個培養(yǎng)基接種5顆種子，過程中盡量避免污染。結束后做好標記和觀察記錄。

3.5.2 枝條的接種

在超凈工作臺上，將消毒好的枝條接種到含1.5 mg/L的6-BA的MS培養(yǎng)基上，接種時盡量弄干枝條表面的水。每個培養(yǎng)瓶接種3棵枝條，接種過程中應注意器皿的消毒，減少過程中的污染。結束后做好標記和觀察記錄。

3.6 培養(yǎng)條件

將接種好的種子、枝條放到培養(yǎng)室中。培養(yǎng)階段試驗室的溫度需要控制在25～30℃；每日輔助光照10 h，光照強度約1600 Lx[5]。5～7 d種子、枝條開始萌芽，萌芽期間可初步判斷受到污染的種子和枝條，應及時處理。

3.7 幼苗的轉接3.7.1 種子幼苗的轉接

轉接的條件為當幼苗長出第3片葉子時[6]。在超凈工作臺內進行工作，把根剪去，同時打頂，留下1cm左右的長度，并轉接到分化培養(yǎng)基(2.0 mg/L 6-BA)中，每瓶2～3棵。當種子幼苗長出2個或更多叢芽時，去掉種子。將分化的苗分成2～3株，用2.0 mg/L的6-BA繼續(xù)培養(yǎng)。10～15 d后，由于培養(yǎng)基內的營養(yǎng)物質被消耗，需更換培養(yǎng)基，確保養(yǎng)分充足，植株正常生長[7]。

3.7.2 枝芽的轉接

枝條上的芽在長到3～5 cm時打頂，去除頂端優(yōu)勢，保留1 cm左右長度，隨后更換為2.0 mg/L的6-BA培養(yǎng)基，有利于叢芽的增值。培養(yǎng)20 d左右開始分化，待叢芽長到2～3 cm，去掉枝條，轉接到2.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中，使其繼續(xù)分化。隨后10～15 d轉接一次。

3.8 幼苗的生根

分化出一定數(shù)量的苗后就可以將長勢良好、健壯、無污染的苗從培養(yǎng)基中分離出來，轉接到生根培養(yǎng)基(1.0 mg/L的6-BA和0.3 mg/L的NAA)。細胞分裂素促進芽的增值，而生長素對根的生長有促進作用，所以結合使用效果較好[8]。每個培養(yǎng)瓶植株數(shù)量控制在3株，培養(yǎng)12 d左右，培養(yǎng)苗開始長根，記錄根生長情況。

3.9 黃化苗的處理

將剛剛黃化的外植體取出，用無菌水沖洗干凈，用0.1%的升汞消毒，隨后立即放入含有不同營養(yǎng)元素的培養(yǎng)基中，觀察30 d，記錄生長情況。

3.10 組培苗的移栽3.10.1 煉苗

由于竹子組培苗適應外界環(huán)境的能力較弱，必須進行煉苗以提高移栽成活率。將生根的組培苗從培養(yǎng)室取出，移到覆蓋有塑料薄膜和遮蔭網(wǎng)的溫棚內，敞開瓶口煉苗5～7 d，遮光度為80%～90%。每天中午11∶00—16∶00噴霧狀水6次，保持基質和組培苗的濕度。每2 d噴灑一次磷酸二氫鉀、尿素和多菌靈(50 g磷酸二氫鉀+30 g尿素+520 g多菌靈，用15 kg清水稀釋混合液)，同時注意保持基質含水量[9]。

3.10.2 移栽

將試管苗從培養(yǎng)瓶取出，洗去培養(yǎng)基，移栽到已消毒的基質(珍珠巖、蛭石、紅土、黑土、泥炭土、腐殖土、泥炭+紅土+珍珠巖)上，每天觀察生長情況并記錄。

3.10.3 施肥

在組培苗移栽成活后，采用不同的肥料和施肥方法施肥，觀察試管苗的生長情況。采用的肥料有0.1%尿素、0.1%硝酸銨、0.3%NPK復合肥、0.6%過磷酸鈣、0.2%磷酸二氫鉀等，施肥方法有葉面施肥和地面施肥。

4 研究結果與分析

4.1 同種激素不同濃度對種子發(fā)芽率的影響

使用不同濃度的6-BA，探究對種子發(fā)芽率的影響,結果見表1。

表1 6-BA對種子發(fā)芽率的影響Tab.1 Effect of 6-BA on seed germination rate

表1數(shù)據(jù)為不同濃度的6-BA的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)下種子的生長情況。從表中數(shù)據(jù)可以看出，在2.1 mg/L的濃度下種子發(fā)芽率最高，長勢也最好。試驗過程中，1.8 mg/L濃度下污染較為嚴重，導致發(fā)芽率降低。

4.2 不同激素對種子發(fā)芽率的影響

試驗采用5種不同的生長調節(jié)物質，在濃度均為2.1 mg/L、培養(yǎng)條件相同的情況下進行組培試驗，探究對種子發(fā)芽率的影響。記錄結果并計算出不同激素情況下的發(fā)芽時間、產(chǎn)生病菌時間、發(fā)芽率、苗根數(shù)和苗高(表2)。

由實驗數(shù)據(jù)得出，在培養(yǎng)條件相同的情況下，BA處理的種子發(fā)芽率最高，發(fā)芽時間也最短，不易產(chǎn)生病菌，苗長勢最好，所以BA最適合促進種子萌芽。其次是GA3和NAA處理。

表2 不同激素的種子發(fā)芽生長性狀Tab.2 Seed germination and growth traits in different hormone

BA為細胞分裂素，主要促進芽和根的形成，GA3為赤霉素，主要促進植物的生長發(fā)育，也能促進發(fā)芽；NAA是生長素類似物，主要促進植物生根。所以BA對種子的萌芽效果最好。

4.3 不同外植體的組培效果

試驗選取了6種不同的外植體，在相同條件下進行組織培養(yǎng)。記錄結果并計算出不同外植體的污染率、褐化率和成苗率(表3)。

數(shù)據(jù)顯示，成苗率較高的3個外植體依次為半年生播種苗枝條、1年生播種苗枝條和種子。

種子不會發(fā)生褐化，但污染率較其他2種外植體高，也因為種子可能會發(fā)生變異，一般不采用。而半年生播種苗褐化率和污染率相對較低，最適合作為組培材料。母竹枝條發(fā)芽時間長，易污染，褐化率高，成苗率低，不適合用作組培試驗。無性繁殖苗枝條褐化率和污染率也較高，也不適合組培試驗。

表3 不同外植體的組培效果Tab.3 Effect of tissue culture in different explants

注：試驗采用MS培養(yǎng)基(2.0mg/L 6-BA)。

種子、半年生枝條和1年生枝條由于較為幼嫩，全能性較高，較容易分化，且含病菌少，不易被污染，所以成苗率高。而母竹枝條已經(jīng)多次分化，老年成分較高，繼代培養(yǎng)難以繼續(xù)分化。無性繁殖苗的根系通常不夠發(fā)達，抗逆性較差，培養(yǎng)過程中容易被污染。

4.4 不同營養(yǎng)元素對黃化苗外植體的處理效果

培養(yǎng)過程中出現(xiàn)了黃化苗，將剛剛黃化的外植體消毒后放入含有不同營養(yǎng)元素的培養(yǎng)基中，觀察30 d，其結果見表4。

表4 不同營養(yǎng)元素對黃化苗外植體的處理效果Tab.4 Effect of different nutrient element on etiolated seedling explants

表4中的數(shù)據(jù)顯示，2.3 g /L的KNO3對黃化苗的處理效果最好，還綠率與成活率都達到最高。NH4NO3在濃度為1.9 g/L時，還綠率和成活率達51.3%和45.2%。所以，NH4NO3對于黃化苗的處理效果也較顯著，可以采用。

植物中葉綠素含量減少，類胡蘿卜素增加，使植物呈現(xiàn)出黃色的現(xiàn)象叫做黃化。培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)基中含鐵量不足，營養(yǎng)耗盡與分布不均勻等原因使得組培苗發(fā)生黃化。K元素能夠促進植物生長健壯，保障各種代謝活動的順利進行。N元素是組成植物體內葉綠素的主要成分，使葉生長茂盛，顏色濃綠。所以，KNO3處理下的黃化苗還綠率較高，效果顯著。

4.5 不同土壤基質對組培苗的影響

組培苗經(jīng)過煉苗等處理后，移入到溫室大棚中，在不同的土壤基質上種植2個月,結果見表5。

表5 不同土壤基質對組培苗的作用效果Tab.5 Effect of different soil substrates on seedling

注：移栽苗為種子培養(yǎng)分化成的苗。

表5顯示不同土壤基質對組培效果的影響，數(shù)據(jù)顯示,基質為泥炭+紅土+珍珠巖的移栽苗生長狀況最好，成活率最高。珍珠巖基質組培苗的成活率最低。而單有泥炭土，成活率也較高，株高也與混合土的差不多。所以，在有條件的情況下可選擇泥炭+紅土+珍珠巖的混合土，也可以選擇泥炭土。

5 結論

1)MS培養(yǎng)基中添加2.1 mg/L的6-BA，發(fā)芽率較高，達66.7%。

2)6-BA處理的種子發(fā)芽率最高，發(fā)芽時間也最短，不易產(chǎn)生病菌，苗長勢最好。其次是GA3和NAA。

3)成苗率較高的3個外植體依次為半年生播種苗枝條、1年生播種苗枝條和種子。半年生播種苗褐化率和污染率相對較低，最適合作為組培材料。

4)KNO3在濃度為2.3 g/L時，還綠率和成活率達64.2%和57.3%，對于黃化苗的處理效果較顯著，適合采用。

5)基質為泥炭+紅土+珍珠巖的移栽苗生長狀況最好，成活率最高。泥炭土成活率也較高，株高也與混合土的差不多。

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Culture Technology ofCephalostachyumpergracile

SHAN Yan

(Haiyuan College, Kunming Medical University, Kunming 651700, China )

In this paper, the effects of different concentrations of 6-BA and hormones, different explants, different elements and different soil matrixes on the tissue culture experiment were studied. The test results show that 2.1mg/L 6-BA has the highest germination rate; fragrant glutinous bamboo explants was the most suitable for the half year seedlings of branches; the effect of KH2PO4treatment on etiolated seedlings was significantly, suitable soil matrix for transplanting was mixed peat+perlite+clay.

Cephalostachyumpergracile; tissue culture; explants; etiolated seedlings; tissue culture seedlings; seed germination rate; soil matrix

10.3969/j.issn.1671-3168.2017.02.017

2017-02-05.

意大利ONLYMOSO公司(2015002)；云南珍竹農(nóng)業(yè)科技有限公司(2015003)資助項目.

單 妍(1981-)，女，碩士研究生，講師.研究方向為生物工程.Email:41513075@qq.com

S795；S723.133

A

1671-3168(2017)02-0071-05