陳思行，陳 發(fā)，蔡灣灣，吳 燕，廖艷偉，鄧 云，吳秀山，王躍群

(湖南師范大學蛋白質化學及魚類發(fā)育生物學教育部重點實驗室心臟發(fā)育研究中心，中國 長沙 410081 )

CRISPR/Cas9系統(tǒng)對斑馬魚fhl1a基因敲除有效性的研究

陳思行，陳 發(fā)，蔡灣灣，吳 燕，廖艷偉，鄧 云，吳秀山，王躍群

(湖南師范大學蛋白質化學及魚類發(fā)育生物學教育部重點實驗室心臟發(fā)育研究中心，中國 長沙 410081 )

為研究fhl1a基因在心臟發(fā)育中的作用，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除斑馬魚fhl1a基因.在斑馬魚fhl1a基因的三號外顯子處選取打靶位點，構建sgRNA表達載體.將體外轉錄的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分別顯微注射到斑馬魚單細胞期的受精卵中以期實現對目的靶基因fhl1a的敲除.隨后收集部分72 h胚胎進行PCR檢測和產物直接測序，確定有無突變.為進一步驗證突變是否可穩(wěn)定遺傳，選擇具有敲除了的F0與野生型斑馬魚進行外交，對獲得的F1進行逐一剪尾，提取DNA進行PCR和測序分析.結果顯示F1獲得了不同程度的插入、缺失等突變類型.研究結果證明所設計的fhl1a基因CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)能在斑馬魚體內有效地形成基因突變，該突變能穩(wěn)定地遺傳到下一代個體，這為進一步研究fhl1a基因在心臟發(fā)育中的具體調控機制打下了基礎.

CRISPR/Cas9；fhl1a基因；斑馬魚；敲除

斑馬魚因其成年魚個體小、易于飼養(yǎng)、發(fā)育快速、性成熟期短、繁殖力強、體外受精、胚胎在體外發(fā)育并且透明等特點成為研究生物發(fā)育過程非常受青睞的模式生物[1-2].

FHL家族因含有四個半LIM結構域而得名.它們通過LIM結構域與其他蛋白質相互作用，在細胞增殖、腫瘤、骨骼肌疾病以及基因的轉錄調節(jié)中發(fā)揮重要作用，但其是否調控心臟的發(fā)育還有待研究.fhl1a(four and a half LIM domains 1a)基因編碼產物是斑馬魚心臟組織cDNA中的一個LIM結構域蛋白，與人FHL1第五亞型高度同源[3-5]，因此建立fhl1a基因敲除斑馬魚，對于研究fhl1a基因與心臟發(fā)育的關系具有重要意義.

CRISPR/Cas9 是最近發(fā)展起來的一種新型基因定向編輯技術[6-10]，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細菌的一套免疫系統(tǒng)，依據基因的多樣性，CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為1，2和3 型，其中2型來源的Cas9蛋白表現出非常強的DNA裂解活性，可僅在一種非編碼RNA(sgRNA)介導下實現定向基因打靶[11-14].本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對斑馬魚的fhl1a基因進行敲除，從而獲得能穩(wěn)定遺傳的fhl1a敲除個體.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 AB品系斑馬魚購于武漢水生所，飼養(yǎng)在湖南師范大學心臟發(fā)育中心自動循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，光暗周期比為14 h∶10 h.取健康、性成熟的斑馬魚，于飼養(yǎng)系統(tǒng)關燈前將雌雄按1∶1的比例放入產卵缸內.次日給光后拿掉擋板，讓其完成產卵與受精.

1.1.2 實驗質粒 gRNA 骨架載體為p42250；Cas9的質粒為PH-Cas9.

1.1.3 實驗主要試劑 T4 DNA 連接酶和10 kb Marker購自TaKaRa公司；BsaⅠ及XbaⅠ 內切酶購自Promega 公司; 氨芐青霉素( ampicilin) 及寡核苷酸(oligo)購自上海生工公司; 瓊脂糖購自BBI有限公司; PCR 產物純化試劑盒購自康為世紀有限公司; Gel Extraction kit 和Plasmid Mini Kit 購自Omega公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 基因靶位點的設計 用Esembl(http://www.ensembl.org/index.html)網站獲得斑馬魚目標基因的完整序列、該基因組上的位置、基因的轉錄本、編碼序列、編碼蛋白、功能域和結構域等信息；用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網站對目的基因的信息進行核實與補充.CRISPR/Cas9系統(tǒng)中gRNA靶位點設計需要遵循如下原則：靶位點處以18～20個堿基為最佳；PAM區(qū)其序列必須嚴格要求為NGG(N可以為任意堿基)；所選靶位點位置一定要在該基因編碼蛋白的功能結構域內部或之前的位置所對應的核苷酸序列，或是盡量靠前的位置，一般來講，靶位點要在該基因CDS區(qū)前2/3區(qū)域的外顯子中，起始密碼子之后，同時注意避免首個起始密碼子下游還存在其他擁有相同讀碼框的起始密碼子.如果該基因編碼多種蛋白，所選靶位點應盡量能同時破壞其所有編碼蛋白的結構域.另外，靶位點也可選在外顯子和內含子交界處，也可能破壞基因的剪接.靶位點處的堿基序列最好具有一定的復雜性，沒有過多的連續(xù)重復.符合這些要求的靶位點需要在NCBI中斑馬魚全基因組上進blast, 以確定其單一性和減少脫靶效應.其中PAM區(qū)以及靠近PAM區(qū)部分的序列較為重要，比較不同靶位點各種參數后擇優(yōu)使用.

1.2.2 gRNA的制備 將質粒p42250 通過BsaⅠ進行酶切( 37 ℃水浴2 h).酶切產物經過瓊脂糖凝膠電泳回收后作為PCR的模板.以公司合成的fhl1a-oligo-1，fhl1a-oligo-2引物(見表1)分別作為F端引物，序列(AAGCACCGACTCGGTGCACT)作為R端引物，退火溫度54 ℃，延伸時間30 s，高保真酶進行PCR擴增，之后用試劑盒純化PCR產物作為模板，T7啟動子進行體外轉錄，體外轉錄產物使用RNA純化試劑盒進行純化回收，1%瓊脂糖電泳檢測以及RNA濃度測定之后置于-80 ℃冰箱待用.

1.2.3 Cas9 mRNA的制備 將質粒h-Cas9 通過XbaⅠ進行酶切( 37 ℃水浴2 h)，使之線性化.之后用DNA純化試劑盒進行回收溶于RNase Free 的ddH2O中作為模板，參照T7 Ultra Kit (Ambion，AM1345) 使用說明書進行體外加帽轉錄.體外轉錄產物使用RNA純化試劑盒進行純化回收，1%瓊脂糖電泳檢測以及RNA濃度測定之后置于-80 ℃冰箱待用.

1.2.4 靶位點有效性檢驗 按照約300 pg Cas9 mRNA和30 pg sgRNA劑量混合注射到斑馬魚胚胎一細胞期的單細胞中，注射后的胚胎培養(yǎng)72 h后，收集部分胚胎進行檢測，并用野生型胚胎作為對照組.收集好的胚胎經過裂解提基因組DNA，用引物fhl1a-PCR-F(AATCCACCACTGTTCTGTT)和fh1a-PCR-R(GGAGTACAAGCATAAAGTC)進行PCR擴增，然后T7E1酶進行酶切檢測.

1.2.5 突變個體篩選 待有效性檢測為陽性的那一批斑馬魚長成至三個月后進行單個個體剪尾提取基因組測序.若測序結果顯示有雙峰即表明有堿基的插入或缺失，再將測序有雙峰的樣品與PMD18-T克隆載體進行連接，進行轉化后挑取10個單克隆進行PCR后再測序，根據BLAST結果判斷靶位點具體堿基突變情況.

2 結果

2.1 gRNA靶位點的確定及打靶載體的構建

按照1.2.1所述方法擇優(yōu)選取兩個靶位點，在設計好的靶位點序列之前加上保護堿基tg和T7啟動子，靶位點之后加上gRNA骨架上游序列作為正向引物，gRNA骨架的下游序列為反向引物進行擴增，fhl1a-PRC-F/R 為鑒定基因型所用擴增引物序列(見表1、圖1A和1B).

表1 引物列表

注：每個序列從5′端開始，F為正向引物，R為反向引物.tg為保護堿基.T7啟子序列為TAATACGACTCACTATA，橫線部分為打靶位點序列，GTTTTAGAGCTAGAAATAGC為gRNA骨架序列上游序列.

按照1.2.3所述方法進行sgRNA的合成，即以p42250質粒經BsaⅠ酶切線性化后的產物為模板，以上述含有靶序列的sgRNA正向引物和反向引物gRNA-R進行PCR擴增，純化回收后再進行體外T7不加帽轉錄、mRNA的合成以及純化，電泳結果見圖1C.

A.Crispr/Cas9 介導fhl1a基因打靶位點;B.fhl1a基因打靶位點sgRNA的PCR擴增結果;C.fhl1a-sgRNA 的T7轉錄結果圖.M為Mark;泳道1為oligo1;泳道2為oligo2.圖1 Crispr/Cas9 介導的fhl1a基因打靶示意圖以及fhl1a-sgRNA制備圖Fig.1 Crispr/Cas9 mediates fhl1a gene target regions and the preparation of fhl1a-sgRNA

2.2 sgRNA活性檢測及突變個體的篩選

按照約300 pg Cas9 mRNA和30 pg sgRNA劑量混合注射到斑馬魚胚胎一細胞期的單細胞中，并對注射情況以及魚卵存活狀態(tài)進行統(tǒng)計分析見表2所示.

表2 斑馬魚fhl1a-Cas9-sgRNA注射情況統(tǒng)計表

注：1，4和6組為酶切陽性結果，說明這些胚胎中fhl1a基因存在錯配位點；2，3以及5組為酶切陰性結果；M為Mark； WT為野生型. 圖2 T7E1酶切檢測fhl1a-Cas9-sgRNA活性結果圖Fig.2 Identified fhl1a-Cas9-sgRNA activity by T7E1 enzyme

待注射胚胎培養(yǎng)到72 h，隨機提取部分斑馬魚全胚胎基因組，5個胚胎為一組，共6組進行打靶位點的有效性檢測.若此打靶位點有效則繼續(xù)讓斑馬魚生長至兩個月大剪尾提取基因組篩選突變個體.

按照1.2.4所述方法將6組注射fhl1a-Cas9-sgRNA的72 h胚胎提取基因組標號為1～6號以及1管野生型胚胎作為對照組，之后用T7E1酶進行酶切，結果見圖2.

將注射后檢測有效的胚胎養(yǎng)至3個月齡左右即可篩選F0代陽性個體，通過剪尾鰭方法進行基因組鑒定(方法見1.2.5)，其中fhl1a-Cas9-sgRNA-oligo1和fhl1a-Cas9-sgRNA-oligo1共注射后長大的成魚46條，分別進行剪尾、提基因組進行擴增，目的條帶大小為651 bp，PCR擴增產物測序，部分測序結果見圖3.

由圖3可知，fhl1a基因F0代胚胎的測序峰圖中靶位點以及之后序列的峰圖出現套峰，說明fhl1a基因的F0代存在突變.再將測序有雙峰的樣品與PMD18-T克隆載體進行連接，轉化后挑取10個單克隆PCR后再測序，根據BLAST結果判斷靶位點具體堿基突變位點，測序結果見圖4.黑框表示為靶點；橫線為缺失片段(-)；N為出現同種突變位點斑馬魚個體數.

A.野生型斑馬魚基因組測序結果；B.fhl1a基因注射后F0代胚胎測序峰圖，PAM位點下橢圓處為雙峰圖.圖3 Fhl1a F0代CRISPR-Cas9打靶測序結果圖Fig.3 Sequencing results of F0 larval amplicons for fhl1a CRISPR-Cas9 injection lines

圖4 Fhl1a F0代測序比對結果圖Fig.4 The blast of sequence results of fhl1a F0

2.3 穩(wěn)定性遺傳的檢測

為進一步驗證該技術造成的缺失是否可以穩(wěn)定傳代，筆者將這些F0代陽性嵌合體斑馬魚與野生型雄魚雜交得到F1代，并培養(yǎng)至性成熟期.對F1代成魚剪尾鰭，提取基因組DNA，進行PCR擴增測序，測序結果有雙峰的進行TA克隆，將單克隆測序，結果顯示有3種突變類型的斑馬魚獲得了能穩(wěn)定遺傳的突變(見表3).

表3 斑馬魚fhl1a基因突變體F1代比對結果圖

注：Query:測序序列；Sbjct:WT序列.

綜上，本文選擇F1-fhl1a-Cas9-sgRNA的1號缺失7 bp個體，F1-fhl1a-Cas9-sgRNA的2號缺失8 bp個體以及F1-fhl1a-Cas9-sgRNA的3號缺失16 bp的這三種突變F1代來建立穩(wěn)定的純合子敲除品系，并用這三個fhl1a突變品系斑馬魚進行斑馬魚fhl1a基因在心臟發(fā)育中的功能研究.

3 討論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)相較于ZFNs[15]和TALENs[16]兩種更簡單方便，較短的sgRNA序列也避免了超長、高度重復的TALENs編碼載體帶來的并發(fā)癥，而且CRISPRs比TALENs和ZFNs更容易操作，因為每一對TALENs都需要重新合成，而用于 CRISPR的sgRNA只需要替換20個核苷酸就行，因此相較于TALENs和ZFNs具有更好的應用前景.

本研究在sgRNA靶點的篩選中，選擇了位于fhl1a第三號外顯子區(qū)域的位置.筆者選取了兩個fhl1a基因的打靶位點并進行了共注射，目的是希望得到大片段缺失的fhl1a基因的突變體.但是后來檢測中發(fā)現可能只有第二個靶位點發(fā)揮了功能，因為筆者得到的突變體都位于2號靶位點附近，1號靶位點在這里并沒有起作用.

注射fhl1a-Cas9-sgRNA后的斑馬魚F0代屬于嵌合體，這就意味著并不是所有的細胞都發(fā)生了基因突變，若突變沒有發(fā)生在生殖細胞中則不會產生遺傳.因此筆者在F0代中篩選到了4種fhl1a敲除類型，而到F1代中只有3種敲除類型得到了遺傳，說明10個堿基缺失的斑馬魚的生殖細胞并沒有發(fā)生突變.F1代為生殖細胞遺傳，不存在嵌合體現象，為雜合子，所以可用F1代fhl1a-Cas9-sgRNA-1，2，3號三個品系來繼續(xù)建立穩(wěn)定敲除系.fhl1a基因敲除斑馬魚的成功構建為進一步研究fhl1a基因在心臟發(fā)育中的功能提供了研究材料.

[1] 賈順姬，孟安明.中國斑馬魚研究發(fā)展歷程及現狀[J].遺傳，2012，34(9):1082-1088.

[2] GARCIA G R, NOYES P D, TANGUAY R L,etal. Advancements in zebrafish applications for 21st century toxicology[J]. Pharmacol Ther, 2016,161(2):11-21.

[3] PEN A E, NYEGAARD M, FANG M,etal. A novel single nucleotide splice site mutation in FHL1 confirms an Emery-Dreifuss plus phenotype with pulmonary artery hypoplasia and facial dysmorphology[J]. Eur J Med Genet, 2015,58(4):222-229.

[4] DOMENIGHETTI A A, CHU P H, WU T,etal. Loss of FHL1 induces an age-dependent skeletal muscle myopathy associated with myofibrillar and intermyofibrillar disorganization in mice[J]. Hum Mol Genet, 2014,23(1):209-225.

[5] MALFATTI E L, OLIVM, TARATUTO A L,etal. Skeletal muscle biopsy analysis in reducing body myopathy and other FHL1-related disorders[J]. Neuropathol Exp Neurol, 2013,72(9):833-845.

[6] CONG L, RAN F A, COX D,etal. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science, 2013,339(6121):819-823.

[7] GASIUNAS G, BARRANGOU R, HORVATH P,etal. Cas9-crRNAribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria[J]. Proc Natl Acad Sci, 2012,109(39):E2579-86.

[8] JINEK M, CHYLINSKI K, FONFARA I,etal. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptivebacterial immunity[J]. Science, 2012,337(6096):816-821.

[9] MALI P, YANG L, ESVELT K M,etal. RNA-guided human genome engineering via Cas9[J]. Science, 2013,339(6121):823-826.

[10] GAGNON J A, VALEN E, THYME S B,etal. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs[J]. PLoS One, 2014,9(5):e98186.

[11] BOLOTIN A, QUINQUIS B, SOROKIN A,etal. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin[J]. Microbiology, 2005,151(8):2551-2561.

[12] MOJICA F J, DIEZ-VILLASENOR C, GARCIA-MARTINEZ J,etal. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements[J]. J Mol Evol, 2005,60(2):174-182.

[13] POURCEL C, SALVIGNOL G, VERGNAUD G. CRISPR elements inYersiniapestisacquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies[J]. Microbiology, 2005,151(3):653-663.

[14] BARRANGOU R, FREMAUX C, DEVEAU H,etal. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science, 2007,315(5819):1709-1712.

[15] CADE L, REYOND D, HWANG W Y,etal. Highly efficient generation of heritable zebrafish gene mutations using homoand heterodimeric TALENs[J]. Nucl Acids Res，2012,40(16):8001-8010.

[16] ZU Y, TONG X J, WANG Z X,etal. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish[J].Nat Methods, 2013, 10(4):329-331.

(編輯 WJ)

The Validation Study of ZebrafishFhl1aGene Knockout by CRISPR/Cas9 System

CHENSi-xing,CHENFa,CAIWan-wan,WUYan,LIAOYan-wei,DENGYun,WUXiu-shan,WANGYue-qun*
(The Center for Heart Development, Key lab of MOE for Department Biology and Protein Chemistry, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

To study the function of thefhl1agene in heart development, we generated thefhl1agene knockout zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. At first, we constructed the sgRNA expression vector targeting zebrafishfhl1agene at the third exon. After in vitro transcription of sgRNA and Cas9 vectors, we co-injected them into single-cell fertilized zebrafish eggs to generate zebrafish with the targeted mutation. After 72 h of injection, embryos were collected, the genome DNA was extracted, PCR and sequencing were then performed. To further verify the stability of genetic mutations, we selected mutated founder to outcross with wild type zebrafish. The first generation (F1) was then analyzed by PCR and sequencing of the caudal fin. Our results confirmed that insertion and deletion mutations were able to be introduced intoF1using this method. Our study demonstrated that CRISPR/Cas9-inducedfhl1agene mutations can be successfully transmitted through the gremline, which lays the foundation for future studies on genefhl1a’s specific regulatory mechanism during heart development.

CRISPR/Cas9；fhl1agene；zebrafish；knockout

2016-07-27

國家自然科學基金資助項目(31272396，31572349);湖南省生物發(fā)育工程及新產品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目(2013-448-6)

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.03.004

Q812

A

1000-2537(2017)03-0021-06

*通訊作者,E-mail：yuequnwang@hunnu.edu.cn