楊少華, 常語宸, 何苗苗, 孫 睿, 呂曉琴, 余占海

(蘭州大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

·研究論文·

新型攜載人胰島素樣生長因子-1纖維屏障膜的制備及其理化和生物性能

楊少華, 常語宸, 何苗苗, 孫 睿, 呂曉琴, 余占海*

(蘭州大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

通過同軸靜電紡絲技術(shù)制備攜載人胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的纖維屏障膜(IGF-1/SF/PLLACL)，其結(jié)構(gòu)和性能經(jīng)SEM, TEM和XRD表征。與非載藥同軸靜電紡絲纖維膜在表觀形貌、理化性能、生物學(xué)性能和膜屏障功能等方面進(jìn)行對比，研究了其在引導(dǎo)性骨組織再生中的可應(yīng)用性。結(jié)果顯示：纖維膜呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，IGF-1/SF/PLLACL形成芯殼雙層結(jié)構(gòu)；非載藥纖維膜的接觸角和機(jī)械強(qiáng)度均略高于載藥組纖維，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；載藥組與非載藥組纖維膜的衍射趨勢與聚左旋乳酸聚己內(nèi)酯晶體相似，絲素蛋白和胰島素樣生長因子-1的加入并未改變其相組成。3 d內(nèi)IGF-1突釋現(xiàn)象嚴(yán)重，之后曲線逐漸平緩，呈緩釋狀態(tài)；載藥組細(xì)胞活性和堿性磷酸酶活性較非載藥組高，略低于IGF-1對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而且兩組纖維膜均具有阻擋成纖維細(xì)胞長入的屏障功能。

人胰島素樣生長因子; 同軸靜電紡絲; 屏障膜; 引導(dǎo)性骨組織再生; 制備; 性能

隨著急慢性牙周病患病率的上升，牙周支持組織缺損已成為口腔疾病治療領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)[1]。雖然骨組織具有一定的自愈能力，但軟組織長上皮結(jié)合的形成阻礙了成骨相關(guān)細(xì)胞黏附和生長,不利于骨組織修復(fù)[2]。引導(dǎo)性骨組織再生技術(shù)(GBR)能通過屏障膜阻止軟組織細(xì)胞的黏附，為骨組織生長提供有利空間，是解決這一問題的有效方法[3]，膜的存在是GBR得以實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)[4]。相比同種異體或異種膜材料，以同軸靜電紡絲技術(shù)制造的納米級或亞微米級的纖維膜具有獨(dú)特的芯殼微觀結(jié)構(gòu)，適宜的力學(xué)性能和良好的生物相容性[5]。

以天然生物大分子絲素蛋白(SF)為骨架的生物膜用于GBR，取得了較Bio-Gide膠原膜更好的骨修復(fù)效果。將SF與機(jī)械性能和降解性能良好的聚左旋乳酸聚己內(nèi)酯(PLLACL)結(jié)合用于組織工程，以達(dá)到優(yōu)勢互補(bǔ)的效果，后者是由組織工程常用原材料[6-7]聚左旋乳酸(PLLA)和聚己內(nèi)酯(PCL)開環(huán)聚合而成。

在骨代謝過程中，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)發(fā)揮著重要作用[8]，通過生長激素(GH)-IGF軸，IGF-1受到GH和相關(guān)結(jié)合蛋白的直接或間接作用，調(diào)節(jié)成骨相關(guān)細(xì)胞有絲分裂和骨骺生長板軟骨細(xì)胞的合成代謝，刺激軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)大分子，包括蛋白多糖和膠原，從而影響骨細(xì)胞分化，增加膠原的形成，促進(jìn)骨原細(xì)胞增殖和骨鈣素增加，進(jìn)而影響骨組織的生長和吸收[9-10]。

本研究通過同軸靜電紡絲技術(shù)制備攜載人胰島素樣生長因子-1的纖維屏障膜(IGF-1/SF/PLLACL)，其結(jié)構(gòu)和性能經(jīng)SEM, TEM和XRD表征。與非載藥同軸靜電紡絲纖維膜(SF/PLLACL)在表觀形貌，理化性能，生物學(xué)性能和膜屏障功能等方面進(jìn)行對比，研究了其在引導(dǎo)性骨組織再生中的可應(yīng)用性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

42BYB47-AG26型同軸靜電紡絲儀；MIRA3和S-3400N型掃描電子顯微鏡；TECNAI G2型透射電子顯微鏡；XG-CAMB型接觸角測量儀；TR316型萬能拉伸試驗(yàn)機(jī)；D/Max 2400型X-ray衍射分析儀；ELx800型酶標(biāo)儀；Echo Revolve FL型正倒置一體顯微鏡。

家蠶蠶繭,浙江嘉欣絲綢股份有限公司；PLLACL(50 ∶50),濟(jì)南岱罡生物工程有限公司；重組人胰島素樣生長因子(rhIGF-1),以色列Prospec公司；IGF-1酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒,美國R&D公司；24孔細(xì)胞冠(cell-crown),美國Sigma-Aldrich公司；SD大鼠BMMSCs和牙周膜成纖維細(xì)胞,蘭州大學(xué)口腔醫(yī)院;其余所用試劑均為分析純。

1.2 制備

(1) IGF-1/SF/PLLACL的制備

在煮沸的去離子水(3 L)中加入碳酸氫鈉15 g和蠶繭30 g進(jìn)行脫膠；烘干后以 LiBr溶液(100 mL)中可溶解15～20 g絲素的比例溶膠6 h；負(fù)壓過濾后放入去離子水(5 L)中透析，每3 h更換新鮮去離子水；3 d后盛入容器中凍干48 h待用[11]。根據(jù)前期研究結(jié)果[12]，將絲素蛋白0.24 g和PLLACL晶體0.56 g 以30 ∶70的質(zhì)量比溶于六氟異丙醇(10 mL)中，震蕩攪拌12 h，配成濃度為8%的殼層溶液。通過對比不同濃度IGF-1對成骨相關(guān)細(xì)胞的影響效果[13-14]，結(jié)合纖維膜藥物釋放規(guī)律，將IGF-1溶于無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制濃度為10 μg·mL-1的IGF-1作為芯層溶液。利用同軸靜電紡絲裝置(內(nèi)層針頭內(nèi)徑0.8 mm，外徑1.0 mm，外層針頭內(nèi)徑1.8 mm)，按照表1參數(shù)，制備IGF-1/SF/PLLACL和SF/PLLACL兩組纖維膜，紡絲期間溫度控制在22～25℃，濕度控制在40%～60%。最后將制備的纖維膜置于密閉容器中，使用25%戊二醛水溶液蒸汽交聯(lián)72 h后置于真空干燥器中干燥1 w待用。

表1 同軸靜電紡絲參數(shù)Table 1 The parameters forcoaxialelectrospinning

1.3 性能測試

(1) 纖維形貌與結(jié)構(gòu)觀察

制備過程中用銅網(wǎng)收集少量纖維絲，干燥后于120 kV的加速電壓下使用透射電子顯微鏡觀察纖維絲內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)。待纖維膜制備完成后切取1.5 cm×1.5 cm的樣品，噴金60 s，于15 kV加速電壓下，使用掃描電子顯微鏡觀察。使用分析軟件Iamge J 1.49V統(tǒng)計(jì)SEM圖像中不少于100根纖維，計(jì)算其纖維直徑及纖維孔徑。

(2) 纖維膜的理化性能檢測

接觸角(CA)是用來評價(jià)樣品表面潤濕性的手段之一。將去離子水25 μL滴到1.5 cm×1.5 cm的兩組纖維膜樣品上，室溫下通過接觸角測量儀記錄數(shù)值，每組樣品至少測試三次。

拉伸試驗(yàn)(TT)是通過萬能材料試驗(yàn)機(jī)描繪應(yīng)力-應(yīng)變曲線來評估材料的機(jī)械性能。首先將交聯(lián)后兩組纖維膜裁剪成10 mm×50 mm的矩形樣品并測量各樣品兩端及中心的厚度，然后將樣品垂直固定于萬能試驗(yàn)機(jī)上，以5 mm·min-1的拉伸速率測試，每組測試至少3個樣品。

X射線衍射分析是利用X射線在晶體物質(zhì)中的衍射效應(yīng)進(jìn)行物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。將1.0 cm×1.0 cm的兩組纖維膜樣品，凍干的絲素蛋白，PLLACL晶體依次固定于觀察臺上，使用X射線衍射分析儀以6°/min的掃描速率檢測，檢測范圍為5°～60°。

(3) 纖維膜內(nèi)IGF-1的釋放

在培養(yǎng)皿中稱取一定質(zhì)量(約100 mg)的載有IGF-1的纖維膜，加入20 mL無菌PBS后置于恒溫?fù)u床(37 ℃， 5%CO2)中培養(yǎng)12 h, 1 d， 2 d, 3 d, 5 d, 7 d, 14 d, 28 d,每次吸取4 mL浸提體并置換等量無菌PBS。按照說明書使用IGF-1 Elisa試劑盒測試不同時(shí)間點(diǎn)浸提液中IGF-1的含量，并繪制IGF-1體外釋放曲線。

(4) 細(xì)胞接種與活力檢測

將約14 mm直徑的兩組纖維膜樣品進(jìn)行無菌處理后(紫外燈滅菌1 h，無水乙醇消毒30 min，無菌PBS沖洗后自然風(fēng)干)固定在24孔板中，另設(shè)兩組對照組，分別為IGF-1組和空白組，四組培養(yǎng)孔中分別接種2×104/孔SD大鼠BMMSCs，其中膜實(shí)驗(yàn)組和空白組均使用普通低糖DMEM培養(yǎng)液，IGF-1組使用含IGF-1(濃度為10 μg·mL-1)的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)7 d和14 d后，PBS沖洗并吸出孔中培養(yǎng)液，加入100 μL 4-甲基偶氮四唑藍(lán)(MTT)溶液(5 mg·mL-1)，孵育4 h后加入750 μL二甲基亞砜，室溫震蕩15 min后取出150 μL溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中，在490 nm波長下使用酶標(biāo)儀檢測樣品吸光度。

(5) 堿性磷酸酶活性檢測

以同樣方法設(shè)立兩組纖維膜組和兩組對照組，2×104/孔BMMSCs接種于纖維膜樣品和組織培養(yǎng)板上，培養(yǎng)7 d和14 d，無菌PBS沖洗并吸出培養(yǎng)液以去除懸浮細(xì)胞，然后用500 μL的0.1%Triton-X100裂解30 min，收集裂解液至離心管中凍存，在波長520 nm和562 nm處使用ALP測試盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒計(jì)算樣品ALP活性。

(6) 屏障功能檢測

兩組(直徑約為3.0 cm)纖維膜經(jīng)上述無菌處理后固定在細(xì)胞冠上，使膜懸空于24孔板中。先從冠外向孔內(nèi)加入1 mL完全培養(yǎng)液，待膜浸濕后，再從冠內(nèi)小心加入1 mL含有5×104個牙周膜成纖維細(xì)胞的細(xì)胞懸液。孵育72 h后，取出纖維膜，常規(guī)固定，脫水，凍干，噴金后，使用S-4800型SEM和Echo Revolve FL型顯微鏡觀察纖維膜接種面和孔板底部細(xì)胞情況，評估膜屏障功能[15]。

(7) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式統(tǒng)計(jì)，使用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，并采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Studengt-Newman-Keul(SNK)檢驗(yàn)P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 表征

(1) SEM和TEM

圖1為兩組纖維膜的SEM、 TEM和纖維直徑分布圖。

圖1 兩組纖維膜的SEM(a， b), TEM(c， d)和直 徑分布圖(e， f)*Figure 1 SEM(a, b) and TEM (c, d) images of comparison and diameter distribution (e, f)*(a， c， e)表示IGF-1/SF/PLLACL組， (b， d， f)表示SF/PLLACL組

圖 2 IGF-1/SF/PLLACL(a)和SF/PLLACL(b)的接觸角Figure 2 The contact angle results of IGF-1/SF/ PLLACL(a) and SF/PLLACL (b)

由圖1可見，SEM(a，b)中兩組纖維膜均表現(xiàn)出絲狀或交叉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，纖維表面光滑，連續(xù)，無粘連現(xiàn)象。纖維直徑分布圖(e，f)顯示兩組纖維膜內(nèi)直徑較均一，IGF-1/SF/PLLACL組直徑為532±72 nm，孔隙大小為3.56±2.40 μm； SF/PLLACL組直徑為564±64 nm，孔隙大小為3.15±2.10 μm。TEM結(jié)果(c，d)顯示IGF-1/SF/PLLACL組纖維內(nèi)形成芯層結(jié)構(gòu)，且芯殼結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，界限較清晰；SF/PLLACL組纖維內(nèi)呈均勻結(jié)構(gòu)，無芯殼結(jié)構(gòu)形成。

(2) CA

纖維膜的表面潤濕性是液體在固體表面鋪展的能力或傾向性，通過測量液滴與材料平面所形成的角度計(jì)算評估的，由圖2可以看出，IGF-1/SF/PLLACL接觸角為123.8±0.63°， SF/PLLACL接觸角為130.2±0.93°，均大于90°且后者大于前者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。疏水性的膜表面有利于降低軟組織相關(guān)細(xì)胞的黏附，從而降低了屏障膜穿通的可能性，增加其屏障穩(wěn)定性[16]。

Tensile strain/%圖3 IGF-1/SF/PLLACL和SF/PLLACL的應(yīng)力- 應(yīng)變曲線Figure 3 The stress-strain curves of IGF-1/SF /PLLACL and SF/PLLACL

(3) TT

纖維膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖3所示，兩組纖維膜均先發(fā)生短暫的彈性形變后轉(zhuǎn)為塑形形變，達(dá)到最大應(yīng)力后斷裂。詳細(xì)參數(shù)如表2所示，SF/PLLACL組纖維的最大應(yīng)力，彈性模量和最大斷裂伸長率均大于IGF/SF/PLLACL組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其原因可能是具有良好機(jī)械強(qiáng)度的PLLACL均勻分布在前者纖維中[17]，而后者內(nèi)部的中空結(jié)構(gòu)降低了材料的抗拉伸性能。

(4) XRD

兩組纖維膜及其原材料的XRD圖如圖4所示，水平方向上，兩組纖維膜的較強(qiáng)衍射峰均集中在2θ約為16.7°， 18.9°， 22.4°處，這與PLLACL晶體[18]的衍射趨勢基本相同。衍射峰16.7°主要是由PLLA鏈段造成的，衍射峰18.9°和22.4°則主要源自PCL的鏈段[19]，而SF的衍射曲線呈寬大波浪形波峰，無明顯衍射高尖峰，與其他研究一致[18,20]。因此SF和IGF-1的加入對纖維膜的相組成未造成明顯改變。

表2 兩組纖維膜機(jī)械性能參數(shù)比較Table 2 Mechanical performance parameters of the fibrous mats

2θ/(°)圖4 兩組纖維膜及其原材料的XRD圖Figure 4 X-ray diffraction patterns of two fiber membranes and their raw materials

Time/d圖 5 28 d內(nèi)IGF-1/SF/PLLACL中IGF-1的釋放曲線Figure 5 IGF-1 release profile in IGF-1/SF /PLLACL over a 28 day period

2.2 IGF-1的釋放曲線

IGF-1/SF/PLLACL內(nèi)IGF-1的體外釋放情況如圖5所示，藥物突釋階段主要集中在前5 d，以12 h最為嚴(yán)重，達(dá)到23.56±1.43%， 5 d后釋放曲線逐漸變緩，進(jìn)入藥物緩釋階段，直至第28 d，IGF-1的累積釋放百分比為70.97±2.02%。從釋藥曲線的趨勢推測28 d后IGF-1仍能緩慢持續(xù)的釋放，而造成芯層藥物緩釋的原因與殼層結(jié)構(gòu)的包繞，有效阻止芯層溶液的突釋有關(guān)。

2.3 細(xì)胞活力檢測

圖6為細(xì)胞接種14 d的MTT結(jié)果。如圖6所示，7 d時(shí)纖維膜組和對照組的BMMSCs數(shù)量均隨時(shí)間增長而增長，IGF-1組明顯大于兩組纖維膜組和空白對照組，說明材料具有良好的生物相容性，而IGF-1能有效地促進(jìn)細(xì)胞黏附和繁殖；14 d時(shí)，IGF-1/SF/PLLACL組增長較快，而SF/PLLACL和空白對照組仍處于較低水平，后者明顯低于前者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這可能與7 d以后IGF-1/SF/PLLACL組仍能緩慢釋放IGF-1刺激細(xì)胞生長有關(guān)。

Time/d圖 6 14 d內(nèi)纖維膜組與對照組細(xì)胞活性的比較*Figure 6 Comparison of cell viability between two fibrous membranes and two control groups within 14 days*表示P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 堿性磷酸酶檢測

ALP活性可在一定程度上反映成骨相關(guān)細(xì)胞的分化情況，是評價(jià)早期成骨的有效方法之一。圖7為14 d內(nèi)纖維膜組與對照組ALP活性的比較圖。如圖7所示，7 d和14 d內(nèi)各樣品中ALP活性呈上升趨勢，IGF-1/SF/PLLACL組明顯大于SF/PLLACL組和空白對照組，而低于IGF-1組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，這與細(xì)胞換液后減少了IGF-1的濃度，降低了IGF-1刺激細(xì)胞成骨分化的作用有關(guān)。

Time/d圖7 14 d內(nèi)纖維膜組與對照組ALP活性的比較*Figure 7 The ALP activities of two fibrous membranes and two control groups within 14 days*表示P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖8 IGF-1/SF/PLLACL(a， c)和SF/PLLACL(b， d) 細(xì)胞接種面SEM圖與孔板底部顯微鏡圖Figure 8 SEM images of cell seeded surface and plate bottom micrograph of IGF-1/SF/PLLACL(a, c) and SF/ PLLACL(b, d)

2.5 膜屏障功能

圖8為牙周膜成纖維細(xì)胞接種后，細(xì)胞接種面SEM圖與孔板底面顯微鏡圖。由圖8(a, b)可見，牙周膜成纖維細(xì)胞均可以有效地黏附在兩組纖維膜表面，細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與纖維粘連，生長狀態(tài)良好，與MTT結(jié)果一致佐證了纖維膜的良好生物相容性。而在圖8(c，d)中僅見極少量牙周膜成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)和少量雜質(zhì)，提示纖維膜阻止了大部分細(xì)胞的穿通，這可能是因?yàn)槔w維膜內(nèi)的孔徑(分別為3.56±2.40 μm和3.15±2.10 μm)明顯小于成纖維細(xì)胞的直徑(約10～15 μm)[21]，從而具備良好的屏障功能，有效阻止牙周膜成纖維細(xì)胞的穿通和長入。

通過同軸靜電紡絲技術(shù)制備攜載人胰島素樣生長因子-1的SF/PLLACL纖維屏障膜，與非載藥同軸靜電紡絲纖維膜SF/PLLACL在表觀形貌，理化性能，生物學(xué)性能和膜屏障功能等方面進(jìn)行對比，研究了其在引導(dǎo)性骨組織再生中的可應(yīng)用性。結(jié)果顯示：纖維膜呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，IGF-1/SF/PLLACL形成芯殼雙層結(jié)構(gòu)；非載藥纖維膜的接觸角和機(jī)械強(qiáng)度均略高于載藥組纖維，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；載藥組與非載藥組纖維膜的衍射趨勢與聚左旋乳酸聚己內(nèi)酯晶體相似，絲素蛋白和胰島素樣生長因子-1的加入未改變其相組成。IGF-1/SF/PLLACL能夠有效地滿足GBR生物膜的屏障要求，同時(shí)其內(nèi)部緩釋的IGF-1能夠有效地促進(jìn)大鼠BMMSCs的增殖和早期成骨分化，有望作為新型屏障膜材料應(yīng)用于GBR技術(shù)中。

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The Physicochemical and Biological Properties of Fabricated Novel Insulin-like Growth Factor-1 Loaded Fiber Barrier Membrane

YANG Shao-hua, CHANG Yu-chen, HE Miao-miao,SUN Rui, Lü Xiao-qin, YU Zhan-hai*

(School of Stomatology, Lanzhou University， Lanzhou 730000， China)

The fibrous barrier membrane(IGF-1/SF/PLLACL) with the human insulin-like growth factor-1(IGF-I) were synthesized by coaxial electrospinning. The structures and properties were characterized by SEM, TEM and XRD. To evaluate its applicability in guided bone regeneration, drug loaded membrane was compared with the non-drug loaded coaxial electrospun fiber membrane in the aspect of morphology, physicochemical properties, biological properties and barrier function. The results showed that the fibrous membrane had reticular structure and IGF-1/SF/PLLACL formed a core-shell double layer structure. The contact angle and mechanical strength of the non-drug loaded fiber membrane was slightly higher than those of the drug loaded group, and the difference was statistically significant(P<0.05). The X-ray diffraction trend of fibrous membrane in drug-loaded group and non-drug-loaded group was similar to that of PLLACL crystal, and the addition of silk fibroin and insulin-like growth factor-1 did not change their phase composition. The burst release of IGF-1 was severe in 3 days, then the curve was gradual and tuned sustained release. The cell activity and alkaline phosphatase in the drug loaded group was much higher than that of the non-drug-loaded group and the IGF-1 control group(P<0.05), and both of the membranes had the barrier function to block the growth of fibroblasts.

human insulin-like growth factor-1； coaxial electrospinning； barrier membrane； guided bone regeneration； preparation； property

2016-12-26；

2017-03-27

蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(2014-RC-79)

楊少華(1988-)，男，漢族，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事生物材料的研究。E-mail: zzyangshaohua@163.com

余占海，博士，教授， Tel.0931-8915062, E-mail: yuzhanhai@lzu.edu.cn

O63； R318.08

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.06.16328