黃 寰， 陸志鋒， 陳晞明， 張慧敏， 李紀明

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院心內科, 廣東 廣州 510150 2.上海同濟大學附屬東方醫(yī)院心內科, 上海 200000)

miR-145通過下調LRRFIP1抑制血管平滑肌細胞增殖及遷移機制

黃 寰1， 陸志鋒1， 陳晞明1， 張慧敏1， 李紀明2

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院心內科, 廣東 廣州 510150 2.上海同濟大學附屬東方醫(yī)院心內科, 上海 200000)

目的：探究miR-145抑制血管平滑肌增殖和遷移的機制。方法:采用實時定量PCR檢測血管平滑肌細胞miR-145的表達。采用mimics-miR-145轉染血管平滑肌細胞，然后利用熒光素酶檢測和Western blot檢測miR-145在平滑肌細胞的增殖和遷移。結果:體外過表達miR-145，可抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，反之，下調miR-145促進血管平滑肌細胞增殖和遷移。LRRFIP1與miR-145表達負相關，下調LRRFIP1可抑制血管平滑肌細胞增殖及遷移。結論:miR-145可能通過下調LRRFIP1抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移。

血管平滑肌細胞; miR-145; RAF作用蛋白; 增 殖; 遷 移

自體靜脈移植、血管腔內成形術是目前治療閉塞性疾病的有效手段，但是血管成形術后血管早期再狹窄一直是困擾治療效果的一大難題[1～3]。臨床觀察證實，術后1年血管的閉塞率達15%～30%，并且逐年遞增，10年通暢率僅為50%。研究證明，血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells，VSMC)從基質遷移至內膜下并增殖是導致新生內膜形成和血管再狹窄形成的主要原因。血管損傷或血管吻合術后，在多種因素的參與下，早期即出現(xiàn)血管內血栓形成和中晚期的血管內膜增生，這些因素共同導致血管早期的再狹窄。VSMC的增殖和遷移是血管增殖性疾病發(fā)病的核心環(huán)節(jié)，異常的VSMC增殖、遷移是血管再狹窄、硬化閉塞等心血管疾病的主要特征，這已成為諸多科研工作者的共識[4～6]。LRRFIP1(也稱TRAF作用蛋白，TRIP)是腫瘤壞死因子受體超家族的成員之一，包含一個RING手指序列和一個擴展的coiled-coil區(qū)域。miRNAs是小的非編碼RNA分子綁定在靶mRNAs的3’非翻譯區(qū)域，導致翻譯抑制和mRNA退化，在各種各樣的生物學事件比如增殖，進展，分化和細胞凋亡中扮演著重要角色[7～9]。本研究中，我們的目的是確定miR-145在血管平滑肌細胞中的表達和功能，并探討miR-145參與血管平滑肌細胞的發(fā)展機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株：293FT細胞株：慢病毒包裝細胞株293FT購自上海中科院細胞庫。人主動脈血管平滑肌細胞株(VSMC)：購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)

1.2 細胞轉染：miR-145類似物，抑制劑和非特異性miRNA負調控分子是從銳博生物公司購買的。LRRFIP1的小干擾RNA由上海吉瑪制藥技術有限公司設計的。轉染后培養(yǎng)48h，收集細胞做實時熒光定量PCR分析。所有檢測均獨立進行三次。

1.3 細胞增殖試驗：CCK-8試劑盒測定細胞增殖特性，嚴格按照說明指示。細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24、48、72和96h 37℃在箱中5%的CO2。在450nm處的吸光度測定。所有檢測均獨立進行三次。

1.4 細胞侵襲試驗：細胞的侵襲能力的測定采用Transwell侵襲小室(Abcam公司，美國)，嚴格按照說明進行。培養(yǎng)48h后，細胞被轉移到上腔無血清RPMI-1640培養(yǎng)基。下室中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)。所有檢測均獨立進行三次。

1.5 實時熒光定量PCR：將miRNA和mRNA逆轉錄為cDNA.逆轉錄是使用逆轉錄試劑盒進行的。實時熒光定量PCR使用SYBR Green PCR 試劑盒在ABI7500快速實時PCR系統(tǒng)進行的，操作過程按照廠家說明書。miR-145的表達均一化到U6，LRRFIP1 mRNA均一化到GAPDH。所有的試驗都重復三次。相關基因的表達用2-△△Ct的方法計算。

1.6 熒光素酶試驗檢測試驗：LRRFIP1的3’非翻譯區(qū)域序列預測與miR-145有關，或者是預測靶點的一個變異序列整合和插入在pGL3的催化劑載體pGL3-LRRFIP1-wt和pGL3-LRRFIP1-mut.細胞是在一個24孔培養(yǎng)皿中培育的，然后分別用miR-145類似物或miRNA控制物，含有螢火蟲熒光素酶的野生型或者突變型pGL3-LRRFIP1質粒，含有海腎熒光素酶的pGL3-LRRFIP1載體轉染。用脂質體2000試劑進行轉染。轉染48h后收集細胞并且用雙熒光素酶報告分析。所有檢測均獨立進行三次。

2 結 果

2.1 miR-145抑制細胞增殖和遷移：CCK-8結果顯示，轉染miR-145 analogue組與Control組比較，24h后，血管平滑肌細胞增殖能力未見明顯差異性變化(miR-145 analogue組為0.26±0.01，Control組為0.25±0.01，P>0.05，無統(tǒng)計學意義)。48h后血管平滑肌增殖能力有差異性變化(miR-145 analogue組為0.73±0.11，Control組為0.95±0.21，P<0.05)。轉染72h后，差異更加明顯(miR-145 analogue組為1.45±0.24，Control組為1.03±0.13，P<0.05)。轉染96h后，差異更加明顯(miR-145 analogue組為3.15±0.54，Control組為2.03±0.33，P<0.01)。轉染miR-145 inhibitor與Control組比較，24h后，血管平滑肌細胞增殖能力未見明顯差異性變化(miR-145 inhibitor為0.24±0.01，Control組為0.25±0.01，P>0.05，無統(tǒng)計學意義)。48h后血管平滑肌細胞增殖能力未見明顯差異性變化(miR-145 inhibitor為0.78±0.01，Control組為0.95±0.21，P>0.05，無統(tǒng)計學意義)。轉染72h后，差異明顯(miR-145 inhibitor組為0.75±0.24，Control組為1.03±0.13，P<0.01)。轉染96h后，差異更加明顯(miR-145 inhibitor組為0.85±0.24，Control組為2.03±0.33，P<0.01),見圖1。

Transwell遷移實驗發(fā)現(xiàn)，與Control組相比較，miR-145 analogue組血管平滑肌細胞遷移穿透小室膜孔的能力明顯下降，miR-145 inhibitor組血管平滑肌細胞遷移穿透小室膜孔的能力明顯上升。Contorl組遷移數(shù)為(50±12)個；miR-145 analogue組(35±6個)；miR-145 inhibitor組(300±20個)(P<0.01)。見圖1。

圖1 miR-145抑制平滑肌細胞的增殖和遷移

A：在miR-145類似物和抑制劑中miR-145的表達量；B：miR-145抑制平滑肌細胞的增殖；C：miR-145抑制平滑肌細胞的遷移。aP<0.05，bP<0.01 vs 對照組。

2.2 LRRFIP1是miR-145的一個直接靶點：LRRFIP1 mRNA的3’非翻譯區(qū)域含有一個miR-145的靶點。為確定LRRFIP1是miR-145的一個直接靶點，進行了熒光素酶檢測試驗。結果表明miR-145明顯抑制野生型而不是變異型LRRFIP1的3’-UTR的熒光素酶活性(P<0.01)。此外，實時熒光定量PCR分析顯示miR-145的過表達顯著降低血管平滑肌細胞LRRFIP1的表達(P<0.01)。見圖2。

圖2 LRRFIP1的直接作用靶點

A：熒光素酶活性檢測；B：LRRFIP1的相對表達量。bP<0.01 vs 對照組

2.3 LRRFIP1對細胞增殖和遷移的影響：CCK-8結果顯示，轉染si-LRRFIP1組與si-SMC Control組比較，24h后，血管平滑肌細胞增殖能力未見明顯差異性變化(si-LRRFIP1組為0.13±0.01，si-SMC Control組為0.14±0.01，P>0.05，無統(tǒng)計學意義)。48h后血管平滑肌增殖能力有差異性變化(si-LRRFIP1組為1.03±0.11，si-SMC Control組為0.35±0.14，P<0.05)。轉染72h后，差異更加明顯(si-LRRFIP1組為1.45±0.34，si-SMC Control組為0.48±0.08，P<0.05)。轉染96h后，差異更加明顯(si-LRRFIP1組為2.15±0.44，si-SMC Control組為0.72±0.31，P<0.01)。見圖3。

Transwell遷移實驗發(fā)現(xiàn)，與si-SMC Control組相比較，si-LRRFIP1組血管平滑肌細胞遷移穿透小室膜孔的能力明顯下降。si-SMC Control組遷移數(shù)為(150±22個)(P<0.01)。見圖3。

圖3 LRRFIP1對細胞增殖和遷移的影響情況

A：si-SMC和si-LRRFIP1中miR-145的相對表達量；B：LRRFIP1對細胞增殖的影響情況；C：LRRFIP1對細胞遷移的影響情況。aP<0.05，bP<0.01 vs si-SMC組。

3 討 論

本研究探究miR-145在血管平滑肌細胞增殖和遷移中作用。結果發(fā)現(xiàn)miR-145過表達明顯抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，相反，miR-145的表達下調促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移。結果表明miR-145可能在血管平滑肌的增殖和遷移中抑制閉塞性疾病。進一步研究了miR-145抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移的分子機制。

TRIP蛋白的N-端的序列與FLI結合蛋白FLAP的N-端序列有著高度同源性，能與DLILRR蛋白結合，因此TRIP也稱LRRFIP1。TRIP位于胞質內，能與雙鏈RNA結合，是腫瘤壞死因子受體超家族成員。我們用生物信息學和實驗確定了在血管平滑肌細胞中LRRFIP1是miR-145的一個直接靶點。發(fā)現(xiàn)LRRFIP1的mRNA的3'非翻譯區(qū)域包含著一個miR-145的補充序列。miR-145的過表達顯著降血管平滑肌細胞LRRFIP1的表達。LRRFIP1基因是轉錄因子的LRRFIP1家族的一個成員，在胚胎發(fā)育，細胞分化和增殖中扮演重要角色[10-13]。此外，大量的研究顯示miRNAs在LRRFIP1的調節(jié)中扮演著重要角色。然而LRRFIP1在血管平滑肌細胞中的表達機制仍然不清楚的。敲除LRRFIP1抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移[11, 12]。

miRNA是一類18～25nt的調控性非編碼單鏈小分子RNA，由一段具有發(fā)夾環(huán)結構的長度為70～80nt的單鏈miRNA前體剪切后生成。它通過與靶mRNA分子作用后發(fā)揮作用，在體內代謝過程中起到多種調控作用[14-17]。研究表明LRRFIP1在血管平滑肌是miR-145的一個功能性靶基因，并且miR-145的過表達與LRRFIP1的低表達相關，抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移[18-22]?？傊琺iR-145通過下調LRRFIP1抑制閉塞性疾病，miR-145可能是閉塞性疾病的潛在治療靶點。

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1006-6233(2017)05-0793-04

2012年國家青年科學基金項目，(編號：81100166)

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.05.026