趙 丹，曲勝男，夏正艷，葛姝君，周 雪，孫 晴，劉 林

（臨沂大學(xué)藥學(xué)院 山東臨沂 276005）

茄葉片中蛋白質(zhì)晶體的超微觀察

趙 丹，曲勝男，夏正艷，葛姝君，周 雪，孫 晴，劉 林

（臨沂大學(xué)藥學(xué)院 山東臨沂 276005）

為了解茄葉片內(nèi)蛋白質(zhì)晶體的幾何形狀和切面的超微特征，采用透射電子顯微技術(shù)對茄葉片中的蛋白質(zhì)晶體進(jìn)行了超微觀察。結(jié)果表明，葉片不同類型的細(xì)胞中都含有蛋白質(zhì)晶體，晶體只發(fā)生于過氧化物酶體中，占據(jù)過氧化物酶體絕大部分內(nèi)部空間，晶體大小與過氧化物酶體大小相對應(yīng)。晶體切面呈現(xiàn)規(guī)則的幾何形狀，包括梯形、平行四邊形、長方形、正方形、五邊形和六邊形，這些形狀為平行六面體不同角度切割的結(jié)果；晶體切面具有清晰的條紋，條紋相互平行。由此得出結(jié)論，茄葉片中蛋白質(zhì)晶體呈平行六面體形，具有網(wǎng)格狀超微特征，其發(fā)生沒有組織特異性，但有細(xì)胞內(nèi)部空間特異性，只發(fā)生于過氧化物酶體中。

茄；葉片；蛋白質(zhì)晶體

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度和純度達(dá)到一定程度，且溫度、酸堿度等環(huán)境條件適宜，就可能形成晶體。例如，動(dòng)物細(xì)胞過氧化物酶體中尿酸氧化酶等蛋白質(zhì)會(huì)形成結(jié)晶體，以適應(yīng)該細(xì)胞器的功能，晶體呈多面體形，具網(wǎng)格狀超微特征。很多植物細(xì)胞也含有過氧化物酶體[1]，其所含的蛋白質(zhì)也形成晶體。晶體的形狀因植物種類而變化，晶體的基本組成單位也不同，有顆粒狀，正方體、長方體等平行六面體，等等，因植物種類而不同；切面呈現(xiàn)條紋或方格，或者質(zhì)地均勻而不顯示任何條紋[1-3]。顯然，植物過氧化物酶體的晶體特征具有一定的變化，因植物種類而異。因此，研究作物過氧化物酶體中的晶體具有理論意義，同時(shí)也能為種質(zhì)資源研究提供參考。茄葉過氧化物酶體中的蛋白質(zhì)晶體的形狀、晶體基本組成單位的排列方式、晶體切面特征，均未見報(bào)道。此外，植物體內(nèi)晶體的發(fā)生是否具有組織特異性，是否具有細(xì)胞內(nèi)部空間特異性，亦未見報(bào)道。

針對上述問題，對茄葉片過氧化物酶體中的蛋白質(zhì)晶體進(jìn)行超微觀察，以揭示晶體的幾何形狀及晶體切面的花紋特征。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料為山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育的‘紫陽長茄’，于2014、2015年2月上旬育苗，5月初移栽于臨沂大學(xué)教學(xué)科研實(shí)習(xí)基地，露地種植，6月下旬從3棵植株上取樣，每株取3片幼葉和3片成熟葉。

將所取葉片切成小塊，置于2%戊二醛中于室溫下固定4 h，再用1%（ω）鋨酸于4℃下固定4 h。梯度酒精系列脫水，Epon-812樹脂包埋，玻璃刀切半薄切片，厚1.5 μm，鉆石刀切超薄切片，厚60 nm。半薄切片用甲苯胺藍(lán)染色，光鏡下觀察照相。超薄切片先用5%（ω）醋酸雙氧鈾染色，再用0.1%（ω）檸檬酸鉛復(fù)染，透射電鏡下觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

茄葉片由上表皮、下表皮、葉肉及維管組織構(gòu)成（圖1-A）。上、下表皮各含1層細(xì)胞。葉肉組織包括柵欄組織和海綿組織，柵欄組織位于葉片正面，即近軸面，呈柱形，長約90 μm，直徑約10 μm，排列整齊。海綿組織形狀不規(guī)則，排列不整齊。維管組織位于海綿組織內(nèi)，是復(fù)合組織，由不同類型細(xì)胞構(gòu)成，包括維管薄壁細(xì)胞、篩管、伴胞和導(dǎo)管（圖1-B）。

葉肉細(xì)胞、表皮細(xì)胞和維管薄壁細(xì)胞都含有豐富的細(xì)胞器，包括液泡、線粒體、質(zhì)體、核糖體、過氧化物酶體等，葉肉細(xì)胞中最明顯的細(xì)胞器是葉綠體，維管薄壁細(xì)胞和表皮細(xì)胞含葉綠體和未分化的質(zhì)體，這些不同類型的質(zhì)體均不含蛋白質(zhì)晶體（圖1-C～E）。過氧化物酶體存在于各種類型細(xì)胞中，但以葉肉細(xì)胞（圖1-C～D）和維管薄壁細(xì)胞（圖1-E）中最為豐富。過氧化物酶體通常含有一個(gè)電子染色很深的蛋白質(zhì)晶體，晶體占據(jù)過氧化物酶體絕大部分內(nèi)部空間。過氧化物酶體越大，晶體就越大，反之，過氧化物酶體越小，晶體也越小。

在對樣品切片時(shí)，樣品中蛋白質(zhì)晶體被切割的方向是隨機(jī)的，不同方向的切面有不同的形狀，但都是規(guī)則的幾何形狀，包括三角形、四邊形、五邊形和六邊形。四邊形多種多樣，有梯形（圖1-F）、平行四邊形（圖1-G）、長方形（圖1-H）和正方形（圖1-I）。五邊形更具多樣性（圖1-J～P），體現(xiàn)為內(nèi)角和邊長的變化，變化決定于晶體被切割方向和位置的不同。在四邊形和五邊形中，總有一組對邊相互平行。六邊形出現(xiàn)較少，其各組對邊都平行，因而是平行六邊形（圖1-Q）。不同的形狀代表平行六面體不同方向的切面，因而邊數(shù)最多的形狀是六邊形。晶體切面呈現(xiàn)相互平行的條紋，寬約5 nm，間隔以3 nm左右的半透明區(qū)（圖1-R～T），表明晶體屬于晶格型。

圖1 茄葉片光鏡與電鏡照片

3 討 論

茄葉片中的蛋白質(zhì)晶體出現(xiàn)于各種類型細(xì)胞中，表明蛋白質(zhì)晶體的發(fā)生沒有組織特異性，各類細(xì)胞都有制造蛋白質(zhì)晶體的能力。在細(xì)胞的各種內(nèi)部空間中，只有過氧化物酶體含有蛋白質(zhì)晶體，顯示蛋白質(zhì)晶體的發(fā)生具有高度的細(xì)胞內(nèi)部空間特異性，即細(xì)胞器特異性。植物過氧化物酶體具多方面功能，參與多種代謝過程，如脂肪酸氧化[4-6]、光呼吸[7]、過氧化氫代謝[8-9]、植物激素生物合成[10]、細(xì)胞壁發(fā)育[11]和果實(shí)成熟[12]，蛋白質(zhì)晶體可能為某些生物學(xué)過程的發(fā)生提供場所[13]。動(dòng)物細(xì)胞過氧化物酶體中的蛋白質(zhì)晶體含尿酸氧化酶[14-15]，免疫電鏡研究結(jié)果表明，向日葵[2，16]細(xì)胞過氧化物酶體中的蛋白質(zhì)晶體含有過氧化氫酶，但茄葉過氧化物酶體中構(gòu)成晶體的蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)還需進(jìn)一步研究。

植物過氧化物酶體中蛋白質(zhì)晶體具有不同的形狀，但同一植物中的晶體具有相似的形狀。不同植物過氧化物酶體中晶體形狀有正方體、長方體等平行六面體[1-2]。本研究結(jié)果顯示，晶體切面有多種形狀，包括三角形、四邊形、五邊形和六邊形，這是對晶體從不同方向切割產(chǎn)生的結(jié)果，對茄葉組織切片時(shí)，葉內(nèi)過氧化物酶體被切割的方向是隨機(jī)的，因而電鏡下觀察到多種形狀。除三角形外，其他多邊形總有一組對邊是平行的，而六邊形的各組對邊都相互平行，是平行六邊形，綜合這些形狀，推測蛋白質(zhì)晶體的三維圖像是平行六面體。向日葵[13]過氧化物酶體中蛋白質(zhì)晶體的切面形狀也有多樣性，包括三角形、四邊形、五邊形和六邊形，晶體三維圖像也為平行六面體。由此推測，平行六面體可能是植物過氧化物酶體蛋白質(zhì)晶體比較普遍的形狀。

晶體是由更微小的基本結(jié)構(gòu)單位規(guī)則排列而形成的，基本結(jié)構(gòu)單位的形狀和排列方式?jīng)Q定晶體切面的特征。馬鈴薯塊莖過氧化物酶體中構(gòu)成蛋白質(zhì)晶體的基本結(jié)構(gòu)單位是顆粒，這些顆粒均勻排列形成晶體，這樣的晶體無論從哪個(gè)方向切割，切面都不顯示任何花紋[13]。由細(xì)微顆粒為基本單位組成的晶體，其切面質(zhì)地均勻，這樣的晶體屬于顆粒型晶體。向日葵子葉中蛋白質(zhì)晶體的基本結(jié)構(gòu)單位是平行六面體，這些結(jié)構(gòu)單位按照一定的間距規(guī)則排列形成平行六面體形狀的晶體，顯示基本結(jié)構(gòu)單位的形狀與晶體的形狀密切相關(guān)[13]。具有規(guī)則形狀的基本結(jié)構(gòu)單位規(guī)則排列，所產(chǎn)生的晶體為晶格型晶體。茄葉片中的蛋白質(zhì)晶體切面具條紋，直徑5 nm，間隔3 nm，顯然，與由顆粒組成的晶體形成鮮明對比，因此茄葉中的蛋白質(zhì)晶體為晶格型，與向日葵中的蛋白質(zhì)晶體一致。

[1]SMITH J J，AITCHISON J D．Peroxisomes take shape[J]．Nature Reviews Molecular Cell Biology，2013，14（12）：803-817.

[2]TENBERGE K B，EISING R．Immunogold labeling indicates high catalase concentrations in amorphous and crystalline inclusions of sunflower（Helianthus annuusL.）peroxisomes[J].Histochemistry Journal，1995，27（3）：184-195.

[3]王連敏，王春艷．植物細(xì)胞的過氧化物酶體[J]．蘇聯(lián)科學(xué)與技術(shù)，1990（1）:38-40.

[4]王教瑜，吳小燕，杜新法，等．植物病原真菌過氧化物酶體的發(fā)生機(jī)制及功能[J]．微生物學(xué)報(bào)，2008，148（12）：1681-1686.

[5]HAYASHI M，TORIYAMA K，KONDO M，et al．2,4-Dichloro?phenoxybutyric acid-resistant mutants of Arabidopsis have de?fects in glyoxysomal fatty acid b-oxidation[J]．Plant Cell，1998，10（2）：183-195.

[6]HAYASHI M，NITO K，TAKEI-HOSHI R，et al．Ped3p is a peroxisomal ATP-binding cassette transporter that might supply substrates for fatty acid β-oxidation[J]．Plant Cell Physiology，2002，43（1）：1-11．

[7]LIEPMAN A H，OLSEN L J．Alanine aminotransferase homo?logs catalyze the glutamate:glyoxylate aminotransferase reaction in peroxisomes of Arabidopsis[J]．Plant Physiology，2003，131（1）：215-227.

[8]MULLEN R T，TRELEASE R N．The sorting signals for peroxi?somal membrane-bound ascorbate peroxidase are within its C-terminal tail[J]．Journal of Biological Chemistry，2000，275（21）：16337-16344.

[9]HAYASHI M，NISHIMURA M．Entering a new era of research on plant peroxisomes[J]．Current Opinion in Plant Biology，2003，6（6）：577-582.

[10]PAPKE I，GERHARDT B．Demonstration of citrate synthase in non-glyoxysomal peroxisomes[J]．Plant Science，1996，116（2）：131-140.

[11]殷亞方，姜笑梅．細(xì)胞壁中過氧化物酶的分布對楊樹木質(zhì)化過程的影響[J]．電子顯微學(xué)報(bào)，2007，26（1）：49-54.

[12]GABALDóN T．Peroxisome diversity and evolution[J]．Philo?sophical Transaction of the Royal Society B，2010，365（1541）：765-773.

[13]TENBERGE K B，RUHOLL C，HEINZE M，et al．Purification and immuno-electron microscopical characterization of crystal?line inclusions from plant peroxisomes[J]．Protoplasma，1997，196（3/4）：142-154.

[14]褚少游，湯雪明．大鼠白細(xì)胞的電鏡髓過氧化物酶反應(yīng)[J]．電子顯微學(xué)報(bào)，1984，3（3）：142.

[15]SCHRADER M，F(xiàn)AHIMI H D．The peroxisome:still a mysterious organelle[J]．Histochemistry and Cell Biology，2008，129（4）：421-444.

[16]EISING R，TRELEASE R N，NI W．Biogenesis of catalase in glyoxysomes and leaf-type peroxisomes of sunflower cotyledons [J]．Archives of Biochemistry and Biophysics，1990，278（1）：258-264.

Ultramicroscopic observation of protein crystals in leaf bades of Solanum melongena

ZHAO Dan，QU Shengnan，XIA Zhengyan，GE Shujun，ZHOU Xue，SUN Qing，LIU Lin
(College of Pharmacy，Linyi University，Linyi 276005，Shandong，China)

Transmission electron microscopy was applied to characterize protein crystals in leaf blades ofSolanum melongena，with the aim to understand whether the occurrence of protein crystals has tissue and intracellular compartment specificity and what shape the crystals take.It was demonstrated that protein crystals occurred in all types of cells.Protein crystals were present only in peroxisomes and occupied most of their volume，and no protein crystals were found in other intracellular compartments.Protein crystals had varied sizes，dependent upon the size of peroxisomes where they were located.The 2-D images of protein crystals were trapezoid，parallelogram，rectangle，square，pentagon，and parallelepiped.These 2-D images suggested a parallelepiped 3-D images of protein crystals.The sections of the crystals revealed a striped pattern.In conclu?sion，the occurrence of protein crystals inSolanum melongenaleaf blades did not have tissue but intracellular compartment specificity，and the crystals took a parallelepiped shape and their sections had a striped ultrastructural pattern.

Solanum melongena；Leaf blade；Protein crystal

2016-03-22；

2017-01-20

山東省自然科學(xué)基金（ZR2015HL115）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610452025）

趙 丹，女，在讀本科生，研究方向?yàn)樗幱弥参镔Y源學(xué)。E-mail:zhaodan9405@163.com

劉 林，男，博士，教授，研究方向?yàn)橹参锇l(fā)育與細(xì)胞生物學(xué)。E-mail:liulin@lyu.edu.cn