張海濤，高峰，李云龍，顧開(kāi)朗

（徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程系，江蘇徐州221006）

資源開(kāi)發(fā)利用

蠅蛆粉替代魚(yú)粉飼料中添加甲殼素酶對(duì)泥鰍生長(zhǎng)性能和非特異性免疫力的影響

張海濤，高峰*，李云龍，顧開(kāi)朗

（徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程系，江蘇徐州221006）

在含有蠅蛆粉的基礎(chǔ)飼料中添加0%、0.025%、0.050%、0.100%、0.200%和0.400%的甲殼素酶，制成6種等氮等能的飼料（分別記為E1、E2、E3、E4、E5、E6組），飼養(yǎng)泥鰍50 d，通過(guò)比較各飼料組泥鰍的生長(zhǎng)性能和形體指標(biāo)，研究蠅蛆粉替代魚(yú)粉飼料中添加甲殼素酶對(duì)泥鰍生長(zhǎng)性能和非特異性免疫力的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：飼料中添加0.025%～0.100%甲殼素酶可提高泥鰍的增重率（WGR）和特定生長(zhǎng)率（SGR）（P＜0.05），降低飼料系數(shù)（FCR）（P＜0.05），其中0.100%組WGR和SGR最高，F(xiàn)CR最低。飼料中添加甲殼素酶對(duì)泥鰍的成活率（SR）、內(nèi)臟指數(shù)（VSI）、肥滿度（CF）和空殼率（DOR）無(wú)顯著影響（P＞0.05）。飼料中添加0.050%～0.100%甲殼素酶可顯著提高泥鰍肝臟和血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性（P＜0.05）；飼料中添加0.025%～0.100%甲殼素酶可顯著降低泥鰍肝臟和血清中丙二醛（MDA）含量。綜上所述，在本試驗(yàn)條件下，考慮生長(zhǎng)性能、形態(tài)學(xué)指標(biāo)和非特異性免疫指標(biāo)，在含有蠅蛆粉的泥鰍飼料中甲殼素酶的適宜添加量為0.100%。

甲殼素酶；蠅蛆粉；泥鰍；生長(zhǎng)；非特異性免疫力

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus），隸屬鯉形目、鰍科、花鰍亞科、泥鰍屬，俗稱(chēng)鋼鰍、鰍魚(yú)、真泥鰍等（劉蟬馨等，1987）。因?yàn)槟圉q肉質(zhì)蛋白含量高、脂肪含量低、營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美，深受廣大消費(fèi)者青睞（林啟訓(xùn)等，2001；Amant等，1969）。近年來(lái)，由于環(huán)境污染、過(guò)度捕撈等原因，泥鰍野生資源呈下降趨勢(shì)，為了滿足市場(chǎng)的巨大需求，泥鰍人工養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大（羅艷萍等，2009）。但是泥鰍配合飼料的研究嚴(yán)重滯后，成為制約泥鰍養(yǎng)殖業(yè)健康快速可持續(xù)性發(fā)展的因素之一，急需加強(qiáng)對(duì)泥鰍配合飼料的研究力度（武迪，2016）。

魚(yú)粉是一種廣泛應(yīng)用與水產(chǎn)飼料中的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)源，但因其產(chǎn)量低、需求量大，魚(yú)粉的價(jià)格一直維持在較高水平，加大了養(yǎng)殖企業(yè)的飼養(yǎng)成本，限制了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，為了降低飼料成本，提高養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益（周歧存等，2005），尋求一種優(yōu)質(zhì)、價(jià)格低廉和供應(yīng)量大的動(dòng)植物蛋白質(zhì)源對(duì)魚(yú)粉進(jìn)行部分或全部替代，逐漸成為水產(chǎn)飼料的重要研究方向之一（張伯文等，2011；Nguyenthingoc等，2009）。

蠅蛆粉因其蛋白質(zhì)含量高、營(yíng)養(yǎng)全面、價(jià)格低廉，已有研究報(bào)告其可以部分替代飼料中的魚(yú)粉（鄧田方等，2012；鄭偉等，2010；Ogunji等，2007）。李賢等（2012）發(fā)現(xiàn)，蠅蛆粉可以替代泥鰍飼料中魚(yú)粉的25%~50%，但隨著替代量的提高，泥鰍的生長(zhǎng)性能逐漸下降，其認(rèn)為是蠅蛆粉中含有較多的甲殼素，具有較高的抗?fàn)I養(yǎng)作用，這與研究凡納濱對(duì)蝦（鄧田方等，2012）、鯽魚(yú)（朱家勇等，2013）、尼羅羅非魚(yú)（Ogunji等，2007）的結(jié)果一致。

甲殼素酶為第三代飼料酶制劑，可以隨機(jī)切斷甲殼素中的β-1，4糖苷鍵，將其降解為水溶性的低聚糖（甲殼素聚糖），進(jìn)而消除其抗?fàn)I養(yǎng)作用（Muzzarelli等，1996）。目前，已有研究者將其應(yīng)用于甲殼素含量較高的水產(chǎn)飼料中，以提高養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)飼料的利用效率。朱家勇等（2013）利用具有甲殼素酶降解活性的酵母菌添加于含有蠅蛆粉的鯽魚(yú)飼料中發(fā)現(xiàn)，甲殼素的抗?fàn)I養(yǎng)作用降低，鯽魚(yú)的生長(zhǎng)性能和非特異性免疫能力提高。Zhang等（2012）在斜帶石斑魚(yú)的飼料中添加甲殼素酶和蝦粉（富含甲殼素）后發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚(yú)的生長(zhǎng)性能和免疫能力得到顯著提高。目前，甲殼素酶在泥鰍飼料中的應(yīng)用研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)在含有蠅蛆粉的泥鰍飼料中添加甲殼素酶，研究其對(duì)泥鰍生長(zhǎng)性能和非特異性免疫能力的影響，分析并確定甲殼素酶在泥鰍飼料中的適宜添加量，旨在為配制優(yōu)質(zhì)價(jià)廉的泥鰍配合飼料提供基礎(chǔ)資料和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)飼料甲殼素酶為飼料級(jí)粉狀酶制劑，購(gòu)自上海陸廣生物科技有限公司，活性為20000 U/g。

試驗(yàn)用蠅蛆粉購(gòu)于江蘇長(zhǎng)江飼料有限公司，粗蛋白質(zhì)含量為53.00%；粗脂肪含量為：13.5%；水分含量為8.2%；粗灰分含量為10.80%；鈣含量為1.00%；總磷含量為1.12%；能量為20.9 MJ/kg。蠅蛆粉粉碎研磨后過(guò)80目網(wǎng)篩，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上，以0、0.025%、0.050%、0.100%、0.200%和0.400%的甲殼素酶替代等量的基礎(chǔ)飼料，制成6種等氮等能試驗(yàn)飼料，分別用E1（對(duì)照組）、E2、E3、E4、E5和E6組表示。所有飼料原料均粉碎并過(guò)60目篩，再制成直徑為2.00 mm的顆粒飼料，自然冷卻后裝入密封袋，置于陰涼干燥處保存?zhèn)溆?。飼料中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分含量的測(cè)定參照AOAC（1995）的方法（張海濤等，2013）。飼料中總能采用氧彈量熱儀（TRHW-6000C）進(jìn)行測(cè)定?；A(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 試驗(yàn)用魚(yú)與飼養(yǎng)管理試驗(yàn)用泥鰍幼魚(yú)，從徐州市七里溝農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)得。試驗(yàn)在徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室的水族箱（120 cm×60 cm×40 cm）中進(jìn)行，開(kāi)始飼喂鯉魚(yú)開(kāi)口料，2周后隨機(jī)分為6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)45尾魚(yú)，初始體重約（2.32±0.01）g。試驗(yàn)開(kāi)始停喂24 h后，于每天8∶00和17∶00各投喂1次，投喂量為泥鰍體重的3%左右，以泥鰍1 h內(nèi)攝食完為宜，根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整投喂量。試驗(yàn)用水為瀑氣后的自來(lái)水，水深15 cm左右，水箱無(wú)土，每隔4 d換水一次，以保證水質(zhì)清潔，加熱棒加熱控制水溫在25~27℃。試驗(yàn)期為50 d。

1.3 樣品采集與分析試驗(yàn)結(jié)束后停喂24 h，分別稱(chēng)量各組泥鰍的終末體重，統(tǒng)計(jì)泥鰍的尾數(shù)，計(jì)算平均終末體重、增重率、特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)、成活率、肥滿度等指標(biāo)，參照李?lèi)?ài)杰（1996）和劉永堅(jiān)（2002）的方法測(cè)定。取泥鰍血，經(jīng)離心后，吸出血清待測(cè)；取血后再取出泥鰍的內(nèi)臟，分離出肝臟，并準(zhǔn)確稱(chēng)取內(nèi)臟、肝臟重量，計(jì)算空殼率和內(nèi)臟指數(shù)等指標(biāo)。將肝臟和血清放人-80℃超低溫冰箱中，待測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量。

增重率/%=（終末體重-初始體重）/初體重× 100；

特定生長(zhǎng)率/（%/d）=（ln終末體重-ln初始體重）/試驗(yàn)天數(shù)×100；

飼料系數(shù)=投飼總量/（終末體重+死亡體重-初始體重）；

存活率/%=終末尾數(shù)/初始尾數(shù)×100；

空殼率/%=（體重-內(nèi)臟重）/體重×100；

肥滿度/（g/cm）=體重/體長(zhǎng)3×100；

內(nèi)臟指數(shù)/%=內(nèi)臟重/體重×100。

肝臟和全腸道中SOD活性和MDA含量測(cè)定均采用南京建成生物有限公司生產(chǎn)的試劑盒，操作步驟按試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用SPSS 17.0 for Windows對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析（ANOVA），若差異顯著，則進(jìn)行Tukey多重比較，顯著水平為P＜0.05。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 蠅蛆粉替代魚(yú)粉飼料中添加甲殼素酶對(duì)泥鰍生長(zhǎng)性能的影響由表2可知，各試驗(yàn)組終末體重隨著甲殼素酶添加量的增加先上升后下降，其中E4組最高，為4.39 g，顯著高于其他各組（P＜0.05）；E2和E3組差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于對(duì)照組、E5和E6組（P＜0.05）；對(duì)照組、E5和E6組差異不顯著（P＞0.05）。E4組泥鰍的WGR最高，為78.00%，隨后依次是E3、E2、E6、E5、E1組，E1組最低，為40.33%；E4組顯著高于E1、E2、E5、E6組（P＜0.05），與E3組差異不顯著（P＞0.05）；E1、E5和E6組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。各組泥鰍SGR的順序?yàn)镋4＞E3＞E2＞E6＞E5＞E1組，E4組顯著高于其他各組（P＜0.05）；E2、E3和E4組與E1組差異顯著（P＜0.05），而E5、E6組與E1組差異不顯著（P＞0.05）。各組飼料FC在1.40~1.51，其中E4組最低，為1.40，顯著高于E1、E2、E5、E6組（P＜0.05），與E3組差異不顯著（P＞0.05）；E2、E5、E6組與E1組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。飼料中添加不同劑量的甲殼素酶對(duì)泥鰍的存活率無(wú)顯著影響（P＞0.05），但E4組泥鰍的SR最高，為95.56%。

表2 蠅蛆粉替代魚(yú)粉飼料中添加甲殼素酶對(duì)泥鰍生長(zhǎng)性能的影響

2.2 蠅蛆粉替代魚(yú)粉飼料中添加甲殼素酶對(duì)泥鰍形體指標(biāo)的影響由表3可知，泥鰍的內(nèi)臟指數(shù)、肥滿度、空殼率各組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但隨著飼料中甲殼素酶添加量的增加，內(nèi)臟指數(shù)有先降低后上升的趨勢(shì)，E4組最低，肥滿度和空殼率有先上升后下降的趨勢(shì)，E4組最高。

表3 蠅蛆粉替代魚(yú)粉飼料中添加甲殼素酶對(duì)泥鰍形體指標(biāo)的影響%

2.3 蠅蛆粉替代魚(yú)粉飼料中添加甲殼素酶對(duì)泥鰍各組織中SOD活性和MDA含量的影響由表4可見(jiàn)，肝臟和血清中SOD活性均隨著飼料中甲殼素酶添加量的增加先上升后降低，均在E4組最高，分別為153.96、113.63 U/mL，且均顯著高于其他各組（P＜0.05）。E2、E4和E5組泥鰍肝臟中SOD活性無(wú)顯著差異（P＞0.05），但顯著高于E1組（P＜0.05）；E6和E1組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。E3和E5組泥鰍血清中SOD活性差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于E1組（P＜0.05）；E2、E6和E1組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表4 蠅蛆粉替代魚(yú)粉飼料中添加甲殼素酶對(duì)泥鰍各組織中SOD活性的影響U/mL

由表5可見(jiàn)，肝臟和血清中MDA含量均隨著飼料中甲殼素酶添加量的增加先降低后上升，均在E4組最低，分別為10.67、10.90 nmol/mL。E2、E3和E4組肝臟MDA含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），但顯著低于E1和E6組（P＜0.05）；E5和E6組與E1組差異不顯著（P＞0.05）。E2、E3、E4和E5組泥鰍血清MDA含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），但顯著高于E1組（P＜0.05）；E1和E6組差異不顯著（P＞0.05）。

表5 蠅蛆粉替代魚(yú)粉飼料中添加甲殼素酶對(duì)泥鰍各組織中MDA含量的影響nmol/mL

3 討論

蠅蛆粉是一種生物蛋白飼料原料，蛋白質(zhì)含量與魚(yú)粉相差無(wú)幾，同時(shí)含有多種生物活性物質(zhì)，如抗菌肽、甲殼素等。由于不具有內(nèi)源性甲殼素酶，動(dòng)物很難降解蠅蛆粉中的甲殼素，某些情況下可能會(huì)對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)造成負(fù)面影響（Ogunji等，2008；K?prücü等，2005）。Chatzifotis等（2009）和Khempaka等（2011）在研究蝦粉中甲殼素對(duì)鯛魚(yú)和肉雞生長(zhǎng)性能的影響時(shí)，也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)。

飼料中添加外源性甲殼素酶，能有效降低甲殼素對(duì)動(dòng)物消化和吸收的負(fù)面影響，消除其抗?fàn)I養(yǎng)作用。甲殼素聚糖為甲殼素酶降解甲殼素的產(chǎn)物，有研究表明，相較于水不溶性的甲殼素，其具有抗氧化作用，能激活動(dòng)物的免疫機(jī)能，具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性（Park等，2010；Ngo等，2009、2008）。

本研究中，在飼料中添加0.025%～0.100%的甲殼素酶能提高泥鰍的增重率和特定生長(zhǎng)率，降低飼料系數(shù)。因此在含有蠅蛆粉的泥鰍飼料中添加甲殼素酶，能有效促進(jìn)泥鰍的生長(zhǎng)，提高飼料利用率，其中，以添加量為0.100%效果最顯著。這與Zhang等（2012）在石斑魚(yú)上的研究結(jié)果類(lèi)似，該研究發(fā)現(xiàn)添加甲殼素酶到含有2%蝦粉的斜帶石斑魚(yú)飼料中，能顯著提高斜帶石斑魚(yú)的生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)甲殼素酶添加量為0.200%和0.400%時(shí)，泥鰍的增重率、特定生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，原因可能是外源性酶過(guò)多的添加會(huì)抑制內(nèi)源性酶的分泌，出現(xiàn)的酶活性飽和現(xiàn)象，進(jìn)而影響泥鰍的生長(zhǎng)性能。

本研究中，各添加甲殼素酶組的泥鰍內(nèi)臟指數(shù)、肥滿度和空殼率與對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說(shuō)明添加甲殼素酶對(duì)泥鰍的形體指標(biāo)無(wú)不良影響。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中甲殼素酶添加量的增加，內(nèi)臟指數(shù)有先降低后上升的趨勢(shì)，E4組最低，肥滿度和空殼率有先上升后下降的趨勢(shì)，E4組最高。原因可能與飼料中的脂類(lèi)含量和氧化程度以及碳水化合物的含量有關(guān)，YE等（2011）、Lee等（2002）、Rueda-Jasso等（2004）發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)動(dòng)物的肝體比與飼料中脂肪和碳水化合物含量有關(guān)。曹俊明等（2012）在研究凡納濱對(duì)蝦時(shí)發(fā)現(xiàn)，蠅蛆粉高比例替代魚(yú)粉會(huì)顯著提高肝胰指數(shù)，這可能與蠅蛆粉脂質(zhì)被氧化程度有關(guān)。

抗氧化系統(tǒng)在動(dòng)物體免疫防御機(jī)制中起著重要作用，是一種防御過(guò)氧化反應(yīng)傷害的主動(dòng)防御系統(tǒng)（唐雪蓮等，2012）；SOD活性是衡量機(jī)體抗氧化能力和非特異性免疫能力的重要指標(biāo)；MDA是脂質(zhì)在自由基作用下發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，通過(guò)測(cè)定其含量，能間接評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化的能力（Slater等，1979）。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)添加甲殼素酶對(duì)泥鰍的SOD活性有顯著增強(qiáng)作用；MDA含量顯著降低。說(shuō)明在含有蠅蛆粉的飼料中添加甲殼素酶可在一定程度上有效增強(qiáng)泥鰍的抗氧化能力。數(shù)據(jù)分析表明，甲殼素酶添加量為0.100%效果最佳。這與斜帶石斑魚(yú)的研究結(jié)果相似。Zhang等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，添加甲殼素酶到含有2%蝦粉的斜帶石斑魚(yú)飼料中，能顯著提高石斑魚(yú)SOD的mRNA表達(dá)，其認(rèn)為甲殼素酶能有效提高斜帶石斑魚(yú)的抗氧化能力和非特異性免疫機(jī)能。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，甲殼素酶添加于含有蠅蛆粉的飼料中，可降低蠅蛆中甲殼素對(duì)泥鰍的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高泥鰍生長(zhǎng)性能和對(duì)飼料的消化吸收率，增強(qiáng)其抗氧化力和非特異性免疫力，提高了蠅蛆粉在泥鰍飼料中的應(yīng)用價(jià)值?；诒驹囼?yàn)的研究結(jié)果和分析，考慮生長(zhǎng)性能、形態(tài)學(xué)指標(biāo)和非特異性免疫指標(biāo)，在含有蠅蛆粉的泥鰍飼料中甲殼素酶的適宜添加量為0.100%。

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This experiment was conducted to investigate the effect of dietary chitinase addition in fish meal reduction diet on growth performance and non-specific immunity of loach（Misgurnus anguillicaudatus）.Loach were fed with 6 isonitrogenous and isoenergetic experimental diets supplemented with 0%，0.025%，0.050%，0.100%，0.200%and 0.400% chitinase for 50 days，which were named groups E1，E2，E3，E4，E5 and E6，respectively.The results showed as follows：Supplementation of 0.025%to 0.100%chitinase could significantly enhance the weight gain rate（WGR）and the specific growth rate（SGR）（P＜0.05），and significantly reduce the feed conversion ratio（FCR）（P＜0.05）.The highest WGR，SGR and lowest FCR of loach were both found in 0.100%group.No significant difference was observed between physical indexes among all groups（P＞0.05）.Supplementation of 0.050%to 0.100%chitimase could significantly enhance the activities of superoxide dismutase（SOD）in liver and serum of loach（P＜0.05）.Meanwhile，supplementation of 0.025%to 0.100% chitimase could significantly reduce malonaldehyde（MDA）contents in liver and serum of loach（P＜0.05）.So，considering the growth and non-specific immune indexes in the condition of this experiment，the optimal supplemental level of chitimase in fish meal reduction diet of loach is 0.100%.

chitinase；maggot meal；loach；growth；non-specific immunity

S963

A

1004-3314（2017）11-0039-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171109

徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級(jí)課題（2014B07）

*通訊作者