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        林蛙皮膠原蛋白酸法提取工藝及性質研究

        2017-06-19 18:52:02張鳳春費英敏黃巧莉
        中國林副特產 2017年3期
        關鍵詞:酸法傅立葉林蛙

        張鳳春,費英敏,黃巧莉

        (1.鐵力市四寶生物科技有限公司,黑龍江鐵力152500;2.黑龍江民族職業(yè)學院,哈爾濱150066;3.黑龍江生物科技職業(yè)學院,哈爾濱150025)

        林蛙皮膠原蛋白酸法提取工藝及性質研究

        張鳳春1,費英敏2,黃巧莉3

        (1.鐵力市四寶生物科技有限公司,黑龍江鐵力152500;2.黑龍江民族職業(yè)學院,哈爾濱150066;3.黑龍江生物科技職業(yè)學院,哈爾濱150025)

        以林蛙皮為原料,研究其膠原蛋白的酸法提取工藝條件, 通過單因素試驗及Design Expert軟件分析預測,根據(jù)生產實際優(yōu)化調整提取膠原蛋白最優(yōu)工藝條件為:料液比1∶18,鹽酸濃度為0.16mol/L,浸提時間為5h,膠原蛋白提取最大量為28.20%。同時,對林蛙皮膠原蛋白產品進行傅立葉紅外轉換掃描圖譜顯示,通過酸法提取的膠原蛋白保存有比較完整的螺旋結構。DSC差熱掃描得到酸溶膠原的變性溫度為52.4℃,高于豬皮和牛皮膠原的變性溫度37℃。

        林蛙皮;酸法提取;膠原蛋白

        東北林蛙(RanadybowskiiGuenther)[1-2],俗稱田雞、哈什蟆,屬于兩棲綱(Amphibia)、無尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、林蛙屬(Rana)[3-5],主要分布于我國東北地區(qū)。東北林蛙平均蛋白質占總量的56.3%左右,另外,還含有蛙醇、多糖類、磷脂及多種激素等?,F(xiàn)有研究除有關林蛙油的藥用及食用等功效外,多偏于對林蛙的保健功能的研究。膠原蛋白是一種天然蛋白質,是由3條肽鏈擰成的螺旋型纖維狀蛋白質,是一種糖蛋白,分子含糖及甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等,是體內含量最多的一類蛋白質,在人體中約占總蛋白質含量的四分之一,存在于幾乎所有組織中。酸法提取即利用酸在一定的外界環(huán)境條件下提取膠原蛋白,主要采用低離子濃度酸性條件破壞分子間的鹽鍵,而引起纖維膨脹、溶解,作為溶劑使用的酸,主要有鹽酸、醋酸、檸檬酸和甲酸等,采用酸法提取的膠原蛋白通常稱為酸溶性膠原蛋白。酸溶解法可將沒有交聯(lián)的膠原分子溶解出來,也可溶解含有醛胺類交聯(lián)鍵的膠原纖維。酸法是提取膠原蛋白比較常用和有效的方法[6-11]。

        本研究選取最佳酸種類,通過單因素實驗選取對酸法提取膠原蛋白影響顯著的因素水平,利用響應曲面分析實驗得到林蛙皮酸溶膠原蛋白最佳提取工藝條件。通過紫外掃描、傅立葉紅外掃描、變性溫度和氨基酸組成分析等對原蛋白性質進行研究。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        經過預處理的林蛙皮:實驗室自制;氫氧化鈉、鹽酸、草酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、冰乙酸,均為分析純試劑。HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司;721-型紫外可見分光光度計 756P:spectrum;日立835-50型氨基酸分析儀:日本日立公司;凱氏定氮器:上海安亭科學儀器廠;THZ-82A水浴恒溫振蕩器:江蘇榮華儀器制造有限公司;TDL-80-2B離心機:上海安亭科學儀器廠。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 酸種類的選擇

        1.2.2 林蛙皮膠原蛋白工藝流程。稱取適量經預處理的林蛙皮→恒溫浸酸→打漿→均質→水洗→抽濾→離心→干燥

        1.2.3 操作要點。首先,選擇適量林蛙皮,進行清洗篩選備用。然后,將清選后的林蛙皮加入酸溶液,用保鮮膜封口,在20℃恒溫水浴振蕩48h,在此期間,每間隔12h更換一次酸溶液以保證酸提取效果。將浸酸后的林蛙皮經均質機均質后,經真空抽濾去除蛙組織,即得粗酸提膠原蛋白溶液,將粗酸提膠原蛋白溶液置于燒杯內不斷攪拌,以2.5mol/L NaCl進行鹽析1h,經10000r/min高速離心機離心20min,除去上清液,取沉淀于表面皿中,在50℃條件下烘干12h。最終得到的乳白色固體即為酸溶膠原蛋白。

        1.2.4 料液比對林蛙皮膠原蛋白提取率的影響。稱取適量經預處理的林蛙皮,以不同料液比加入0.1mol/L 的酸溶液,在20℃恒溫水浴振蕩6h,經均質機均質后,進行抽濾,得到粗酸提膠原溶液,以膠原蛋白提取率作為指標確定料液比。

        1.2.5 酸濃度對林蛙殘體膠原蛋白提取率的影響。稱取適量經預處理的林蛙皮,選取不同濃度的酸溶液,在20℃恒溫水浴振蕩6 h,經均質機均質后,進行抽濾,得到粗酸提膠原溶液,以膠原蛋白提取率作為指標確定酸濃度。

        1.2.6 酸提時間對林蛙殘體膠原蛋白提取率的影響。稱取適量經預處理的林蛙皮,在20℃恒溫水浴振蕩不同時間,經均質機均質后,進行抽濾,得到粗酸提膠原溶液,以膠原蛋白提取率作為指標確定提取時間。

        1.2.7 響應曲面試驗分析。應用Design-Expert 7.0.0 Trial軟件,以每組試驗中林蛙皮酸法提取的膠原蛋白提取率為指標,進行響應曲面分析。得到酸法提取林蛙皮膠原蛋白的最佳工藝條件。響應曲面試驗因素水平及編碼表見表1。

        表1 酸法提取林蛙皮膠原蛋白實驗因素水平及編碼表

        1.3 酸法提取林蛙皮膠原蛋白性質研究

        1.3.1 紫外掃描(UV spectra)分析。采用紫外分光光度計在190~400nm進行掃描0.3g/L的膠原乙酸溶液。

        1.3.2 傅立葉紅外光譜(FT-IR)分析。將一定量干燥的KBr和膠原蛋白凍干品至于瑪瑙研缽中,研磨均勻,成粉末狀,裝樣,手動壓片,取出樣品小心放入樣品室。采用Nicolet-SX-170傅立葉紅外光譜儀對樣品在400cm-1~4000cm-1掃描,掃描信號累加200次,分辨率為4cm-1。

        1.3.3 變性溫度的測定。將裝有0.3g/L的膠原乙酸溶液的烏氏粘度計浸入水浴中[7],測定膠原溶液流經毛細管的時間。水浴溫度自15℃上升至188℃,每個測定溫度穩(wěn)定2min。

        相對黏度(Relative viscosity)= ηr= 樣品流動時間 / 空白流動時間

        增比黏度(Specific viscosity)= ηsp= (η-η0) / η0= ηr-1以變性溫度變化對增比黏度作圖,在增比黏度變化曲線上取其變化一半的溫度作為膠原的變性溫度。

        1.3.4 氨基酸組成分析。取適量提取得到的膠原蛋白樣品,在減壓充氮條件下用6mol/L HCl于110℃水解24h。采用日立835-50型氨基酸分析儀對樣品進行檢測,茚三酮顯色,對生成紫色化合物的常規(guī)氨基酸在570nm檢測;對形成黃色產物的脯氨酸和羥脯氨酸在440nm檢出。

        2 結果與分析

        2.1 酸種類的選擇

        圖1 不同種類酸溶液對林蛙皮膠原蛋白的提取效果比較

        由圖1可知,在上所述操作條件下,鹽酸對林蛙皮中膠原蛋白的提取效果最佳,膠原含量明顯高于其他酸種類,因此,選取鹽酸作為酸法提取林蛙皮膠原蛋白的提取劑。

        2.2 酸法提取林蛙皮膠原蛋白工藝單因素實驗結果

        2.2.1 料液比對林蛙皮膠原提取率的影響

        圖2 不同料液比的林蛙皮膠原蛋白提取率

        從圖2知,當料液比為1∶20時林蛙殘體膠原蛋白提取率最高,隨著料液比的增大,羥脯氨酸含量降低,這是由于料液比越大,溶液中的羥脯氨酸濃度則越低的緣故,并不能說明此時OD值大提取效果就好。應通過計算酸粗提液中的膠原含量,并計算得出該料液比下的膠原蛋白提取率,通過提取率的大小確定1∶20為酸法提取林蛙殘體膠原蛋白的最佳料液比。

        2.2.2 酸濃度對林蛙皮膠原提取率的影響

        圖3 不同酸濃度的林蛙皮膠原蛋白提取率

        從圖3中可知,隨著鹽酸濃度的增加,林蛙皮中膠原蛋白的溶出量明顯增多,從而膠原蛋白的提取率不斷增加,但酸濃度不可過高,否則會影響所提取的膠原蛋白的纖維結構。當鹽酸濃度由0.15mol/L升至0.20mol/L過程中,膠原蛋白提取率明顯增加,繼續(xù)加大濃度,則膠原蛋白提取率增加平緩,因此選取0.20mol/L作為提取林蛙皮膠原蛋白的適宜鹽酸濃度。

        2.2.3 酸提時間對林蛙皮膠原提取率的影響

        圖4 酸提時間的林蛙皮膠原蛋白提取率

        從圖4可知,隨著提取時間的延長,鹽酸溶液對林蛙皮膠原蛋白的提取率明顯遞增,在4~5 h內增加最明顯,5h后,隨著時間的延長,鹽酸溶液對林蛙皮膠原蛋白的提取率繼續(xù)增加,但增加趨勢低于5h,因此,選取5h為鹽酸溶液提取林蛙皮膠原蛋白的適宜時長。

        2.2.4 響應曲面試驗設計及結果分析

        在上述單因素實驗基礎上進行響應曲面實驗設計[12],確定鹽酸提取林蛙皮膠原蛋白最優(yōu)工藝條件。利用Design Expert軟件,采用中心組合實驗Box-Behnken設計方案[13],以料液比、鹽酸濃度、浸提時間對工藝參數(shù)進行優(yōu)化。

        表2 響應曲面分析實驗點安排及實驗結果

        設該模型通過最小二乘法擬合二次多項方程可表達為:

        Y = C0+ C1A + C2B + C3C + C12AB + C13AC + C23BC + C11A2+ C22B2+ C33C2

        (1)

        式中,Y為預測相應值,C0為常數(shù)項,C1、C2、C3分別為線性系數(shù),C12、C13、C23為交互項系數(shù),C11、C22、C33為二次項系數(shù)。為了確立二次多項方程(1),利用Design Expert軟件進行實驗設計和數(shù)據(jù)分析。設計方案及結果見表2。

        利用Design Expert軟件進行多元回歸擬合,獲得酸法提取林蛙皮膠原蛋白提取率對編碼自變量料液比、鹽酸濃度、浸提時間的二次多項回歸方程:

        Y = 27.46-3.52A-2.20B + 0.62C-0.12AB-1.07AC-2.15BC-10.21A2-3.26B2-7.84C2

        表3為二次多項模型方差分析表。

        表3 二次多項模型方差分析表

        其模型的F值為44.14,說明該模型有意義。其中A、B、BC、A2、B2、C2這幾項為顯著性的模型項。而此概率大于0.1即說明該模型項對于模型影響不顯著,可以根據(jù)實際情況進行分析調整。

        失擬項的F值為30.82,說明失擬項相對于誤差項來講不顯著,該失擬項說明模型的擬合性非常好,可以用于模型分析。其中預測系數(shù)為0.7333,相對于校正決定系數(shù)的0.9604而言擬合度好,決定系數(shù)為0.98277,說明該模型的擬合性非常好,可以用于模型分析。本模型的信噪比達到8.99,說明該模型可以用于生產應用當中。

        通過Design Expert軟件分析,得出最優(yōu)條件為:料液比1∶18,鹽酸濃度為0.16mol/L,浸提時間為5~10h,該條件下酸法提取林蛙皮膠原蛋白提取率的預測值為28.20%??紤]實際生產條件,將此條件優(yōu)化為:料液比1∶18,鹽酸濃度為0.16mol/L,浸提時間為5h。

        2.3 林蛙皮酸溶膠原蛋白的性質研究

        2.3.1 傅立葉紅外掃描。林蛙皮酸溶膠原的傅立葉紅外轉換掃描圖譜見圖5~6。酰胺A出現(xiàn)于3400cm-1左右,是N-H伸縮振動的吸收峰,表明氫鍵的存在。酰胺B出現(xiàn)于3080cm-1,這是膠原在掃描中通常出現(xiàn)的波長[17]。酰胺I出現(xiàn)在1640cm-1,酰胺II在1585cm-1,酰胺III在1257cm-1,它們各自表示C=O的伸縮振動,N-H的彎曲振動和 C-H的伸縮振動[18]。酰胺I和蛋白質的二級結構有關,酰胺III證明了螺旋結構的存在[19-20]。因此,傅立葉紅外轉換掃描證明了實驗制取的林蛙皮酸溶膠原保存有比較完整的螺旋結構。

        圖5 酸溶膠原的傅立葉紅外轉換掃描圖譜

        2.3.2 變性溫度的測定。如圖6所示,鹽酸提取林蛙皮中的膠原蛋白的變性溫度為52.40℃,高于豬皮和牛皮膠原變性溫度37℃,這表明提取林蛙油后的剩余林蛙皮具有替代高等陸生脊椎動物作為膠原蛋白來源潛力[21]。

        圖6 酸溶膠原熱變性曲線

        3 結論

        通過單因素試驗及DesignExpert軟件分析,酸法提取林蛙殘體膠原蛋白優(yōu)化條件為:料液比1∶18,鹽酸濃度為0.16mol/L,浸提時間為5h,該條件下膠原蛋白提取最大量為28.20%。

        傅立葉紅外掃描發(fā)現(xiàn)提取得到的膠原中,酰胺I和蛋白質的二級結構有關,酰胺III證明了螺旋結構的存在。因此,傅立葉紅外轉換掃描證明了實驗制取的林蛙殘體酸溶膠原保存有比較完整的螺旋結構。經測定,林蛙殘體的變性溫度為52.40℃,這表明提取林蛙油后的剩余林蛙殘體具有替代高等陸生脊椎動物作為膠原蛋白來源的潛力。

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        Study on Extraction Technology and Properties of Collagen fromRanachensinensis

        Zhang Fengchun1, Fei Yingmin2, Huang Qiaoli3

        (1. Tieli City Sibao Biological Technology Co. LTD., Tieli 152500; 2. Heilongjiang Vocational College for Nationalities,Harbin 150066; 3. Heilongjiang Vocational College Of Biology Science And Technology , Harbin 150025)

        This thesis is to extract collagen from the remainingRanachensinensisskin, and to study the collagen by acid extraction and enzymatic extraction process. Through analyzing and forecasting by the single-factor test and Design Expert software, according to the actual , the optimum process condition of products are: solid-liquid ratio 1∶18, hydrochloric acid concentration of 0.16mol/L, extraction time of 5h , the maximum amount of collagen extraction was 28.2%. Fourier transformation infrared scan patterns showed that acid extraction of the products, the experiments proved the system to take the acid-soluble collagen is the preservation of the original spiral structure completely. DSC scanning results showed that the acid-soluble collagen of original protein denaturation temperature is 52.4℃,which is more than the skin and cowhide collagen denaturation temperature of 37℃.

        Ranachensinensisskin; Acid extraction; Collagen protein

        2017-03-16

        黑龍江省省院科技合作項目(hz201309)

        張鳳春(1972-),男,經濟師,研究方向為林蛙產品的開發(fā)研究,E-mail:tlsibao@126.com。

        S966.3+5;R284.2

        A

        DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.03.001

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