李曉芹，金尉，袁小美

(1.蘇州出入境檢驗檢疫局，江蘇 蘇州 215104；2.蘇州世標(biāo)檢測技術(shù)有限公司，江蘇 蘇州 215104)

GC-MS內(nèi)標(biāo)法測定發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的含量

李曉芹1,2，金尉1,2，袁小美1,2

(1.蘇州出入境檢驗檢疫局，江蘇 蘇州 215104；2.蘇州世標(biāo)檢測技術(shù)有限公司，江蘇 蘇州 215104)

建立了發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯含量的氣相色譜-質(zhì)譜測定方法。以氨基甲酸乙酯-D5為內(nèi)標(biāo)，經(jīng)硅藻土柱富集凈化，二氯甲烷洗脫，氣相色譜-質(zhì)譜儀選擇離子模式測定。方法優(yōu)化后，液體樣品檢出限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg；固體樣品檢出限為5 μg/kg，定量限為15 μg/kg，回收率為85%～115%，RSD<6.0。該方法簡單、有效、穩(wěn)定，可應(yīng)用于多種發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的實際檢測分析。

氨基甲酸乙酯；硅藻土柱；內(nèi)標(biāo)法；氣相色譜-質(zhì)譜法

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)天然存在于多種發(fā)酵食品中，如醬油、醋、葡萄酒、黃酒、發(fā)酵乳、發(fā)酵豆制品，是一種水溶性致癌物質(zhì)。美國、加拿大、日本等國都對其最高允許含量做了限制[1]。在中國，EC也已成為目前國內(nèi)食品安全重要監(jiān)測項目之一。但目前我國僅建立了酒和醬油中EC的檢測方法[2]，本文在前者研究的基礎(chǔ)上[3-9]，對EC的分析方法進(jìn)行了驗證和優(yōu)化，將檢測范圍進(jìn)行了擴(kuò)充，采用硅藻土柱富集凈化，氣相色譜-質(zhì)譜儀測定，利用選擇離子監(jiān)測模式和內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定性及定量分析，建立了簡單、有效、穩(wěn)定的多種食品中EC測定的檢測方法。

1 儀器、試劑與材料

1.1 試劑、耗材

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈：Fisher，色譜純；鹽酸、氯化鈉、無水硫酸鈉：國藥試劑，分析純。實驗所用樣品來源于本實驗室送檢樣品。

氨基甲酸乙酯(EC)標(biāo)準(zhǔn)品： Dr. Ehrenstorfer GmbH，純度98.5%；氨基甲酸乙酯-D5(EC-D5)標(biāo)準(zhǔn)品，內(nèi)標(biāo)： Dr. Ehrenstorfer GmbH，純度99%。

硅藻土柱：Agilent Chem Elut 5 mL，P/N:12198006。

1.2 設(shè)備

GC-MS 7890N5975C、電子轟擊源(EI)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 Agilent；H2050R 高速離心機 湖南湘儀；N-EVAP 氮吹儀 Organomation；渦旋混合儀 IKA；AE100 電子天平 Mettler；Milli-Q超純水器 美國。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)0.01 g(精確到0.1 mg)至10 mL容量瓶中，乙腈溶解、定容，配制成1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4 ℃避光保存。再分別移取100 μL至10 mL容量瓶中，乙腈定容，配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃避光保存。標(biāo)準(zhǔn)曲線用乙酸乙酯配制，氨基甲酸乙酯濃度為10,50,100,200,500 μg/L，或根據(jù)需要配制，內(nèi)標(biāo)濃度為100 μg/L。

2 分析步驟

2.1 樣品前處理

2.1.1 液體樣品

移取葡萄酒、醋、醬油等樣品5 g，加入適量內(nèi)標(biāo)，如有沉淀物經(jīng)10000 r/min離心10 min，取上層清液備用。

蒸餾酒：移取樣品5 g，加入適量內(nèi)標(biāo)，氮吹至約3 mL，備用。

發(fā)酵液體乳：移取樣品20 g，加入適量內(nèi)標(biāo)，2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2左右沉淀蛋白，離心取清液，沉淀加入8 mL水，振搖提取，離心后合并清液，定容至20 mL，取5 mL備用。

2.1.2 固體樣品

稱取樣品2 g于刻度離心管中，加入適量內(nèi)標(biāo)，加入飽和氯化鈉溶液8 mL，超聲提取后甲醇定容至10 mL，渦旋，10000 r/min離心10 min，取上層清液5 mL備用。

2.2 凈化

備用液加入硅藻土柱，靜置吸附10 min。20 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液，二氯甲烷洗脫，收集洗脫液20 mL。洗脫液經(jīng)無水硫酸鈉除水后氮吹至近干，加入1 mL乙酸乙酯，過膜后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜檢測。

2.3 色譜條件

2.3.1 氣相條件

色譜柱：Agilent VF-WAXms(0.25 mm×0.25 m，30 μm)；色譜柱溫度：60 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至150 ℃，以25 ℃/min升到230 ℃，保持0 min，230 ℃后運行5 min；載氣：氮氣，1.0 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

2.3.2 質(zhì)譜條件

進(jìn)樣口溫度：220 ℃；接口溫度：240 ℃；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲：14 min；檢測方式：選擇離子檢測方式。

3 分析與討論

3.1 色譜條件確定

本標(biāo)準(zhǔn)采用內(nèi)標(biāo)法定量測定，基質(zhì)匹配溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測液和標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子峰保留時間一致(±0.5%)，對應(yīng)質(zhì)譜碎片離子的質(zhì)荷比與標(biāo)準(zhǔn)品一致。EC和EC-D5定性離子和定量離子見表1，色譜結(jié)果見圖1。

表1 EC和EC-D5定量和定性選擇離子表

圖1 EC和EC-D5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇離子色譜圖

注：EC濃度為20 μg/L，保留時間為16.067 min；EC-D5濃度為100 μg/L，保留時間為15.932 min。

3.2 提取方法的選擇

EC極性強，易溶于水和乙醇。對于葡萄酒、醋等樣品可以直接取清液進(jìn)行凈化。對于酒精含量高于15%的酒類產(chǎn)品，需加水稀釋至酒精含量低于15%，或氮吹將易揮發(fā)成分除去后再做凈化。為提高方法靈敏度，選取氮吹方式降低酒精含量影響。

發(fā)酵液體乳制品蛋白含量高，離心后進(jìn)行固相萃取凈化容易出現(xiàn)堵塞，影響方法穩(wěn)定性。采用稀酸調(diào)節(jié)pH沉淀蛋白質(zhì)，離心后取清液再進(jìn)行固相萃取凈化。

對于固體樣品，比較了純水、飽和氯化鈉溶液[10]、乙醇、甲醇的提取效果，結(jié)果表明：采用飽和氯化鈉溶液和甲醇分步提取效果最好。飽和氯化鈉溶液提取可以減弱乳化作用，得到良好的分層效果，加入少量甲醇能夠去除部分雜質(zhì)且不會影響后續(xù)的固相萃取凈化。

3.3 固相萃取條件的選擇

待測液和洗脫液都是依靠重力作用從硅藻土柱中流出。比較了多個廠家的硅藻土柱，結(jié)果表明：硅藻土孔徑及裝填密度影響上樣速度和回收效果。最終選取安捷倫Chem Elut 5 mL硅藻土柱，上樣后待測液自然滲入硅藻土柱且能得到很好保留，淋洗和洗脫后可以得到較好的回收效果。

分別比較了乙酸乙酯、乙醚、5%乙酸乙酯-乙醚溶液、二氯甲烷、10%甲醇-二氯甲烷溶液的洗脫效果，20 mL二氯甲烷洗脫效果最好。實際樣品和加標(biāo)后檢測結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 陳醋樣品加標(biāo)前選擇離子色譜圖

注：a:EC-D5濃度為20 μg/kg， 保留時間為15.948 min；b:EC濃度為6.2 μg/kg， 保留時間為16.078 min。

圖3 陳醋樣品加標(biāo)后選擇離子色譜圖(加標(biāo)量為10 μg/kg)

注：a:EC-D5濃度為20 μg/kg， 保留時間為15.943 min；b:EC濃度為16.8 μg/kg， 保留時間為16.078 min。

3.4 方法檢出限和回收率

根據(jù)樣液中被測物的含量情況，選定濃度與樣液相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中氨基甲酸乙酯的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測線性范圍內(nèi)。在陰性基質(zhì)中進(jìn)行加標(biāo)實驗，按信噪比3∶1確定檢出限，信噪比10∶1確定定量限。液體樣品檢出限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg；固體樣品檢出限為5 μg/kg，定量限為15 μg/kg。

為驗證方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，對葡萄酒、陳醋、白酒、酸奶、腐乳分別進(jìn)行定量限、兩倍定量限和十倍定量限加標(biāo)回收實驗，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明：液體樣品及固體樣品EC的回收率在85%～115%，RSD<6.0。陳醋的加標(biāo)回收實驗結(jié)果見表2。

表2 陳醋樣品中EC加標(biāo)回收率及RSD(n=6)

4 結(jié)論

建立了GC-MS內(nèi)標(biāo)法測定多種發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯殘留量的方法，該方法簡單、有效、穩(wěn)定，對現(xiàn)有檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化并對檢測范圍進(jìn)行了擴(kuò)充，能夠滿足日常檢測需求。

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Determination of Ethyl Carbamate Content in Fermented Food by GC-MS Internal Standard Method

LI Xiao-qin1,2, JIN Wei1,2, YUAN Xiao-mei1,2

(1.Suzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Suzhou 215104,China;2.Suzhou World Standard Testing Technology Co., Ltd.,Suzhou 215104,China)

A method for determination of ethyl carbamate content in fermented food by GC-MS is developed. Ethyl carbamate-D5 is used as internal standard. By means of diatomaceous earth column, ethyl carbamate is enriched and purified. The target substance is eluted by dichloromethane. The identification is performed by GC-MS in selected ion monitoring (SIM) mode. The limited of detection is 2 μg/kg and the limit of quantitation is 5 μg/kg for liquid samples, the limit of detection is 5 μg/kg and the limit of quantitation is 15 μg/kg for solid samples respectively. The recovery rate is 85%～115%，RSD<6.0.The method is easy, effective, stable and can be applied for the detection of ethyl carbamate in fermented food.

ethyl carbamate；diatomaceous earth column；internal standard method；GC-MS

2016-12-16

李曉芹(1987-)，女，江蘇徐州人，工程師，碩士，主要從事食品安全分析。

TS201.5

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.029

1000-9973(2017)06-0135-04