華金雙，邵伯雍，傅 文

(1.河南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046)

·實驗研究·

逆針灸對慢性疲勞大鼠行為學及IL-1β、IL-6的影響*

華金雙1，邵伯雍2，傅 文2

(1.河南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046)

目的：探討逆針灸對慢性疲勞大鼠IL-1β、IL-6的影響。方法：將40只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組,每組10只。模型對照組先平行飼養(yǎng)，然后通過多因素刺激相結合的辦法，制備慢性疲勞大鼠模型，共44 d。逆針灸1組、逆針灸2組在制備模型前依次先給予大鼠電針刺激10 d、20 d，然后再制備慢性疲勞大鼠模型。正常對照組不予任何處理，平行飼養(yǎng)。觀察大鼠力竭游泳時間，采用酶聯(lián)免疫法檢測各組大鼠血清 IL-1β、IL-6含量。結果：與正常對照組對比，模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠力竭游泳時間明顯縮短，血清IL-1β、IL-6含量明顯增加，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。與模型對照組對比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠力竭游泳時間明顯延長，血清IL-1β、IL-6含量明顯降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。逆針灸1組和逆針灸2組造模后力竭游泳時間、IL-6含量對比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但血清IL-1β含量對比差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論：早期逆針灸干預能抑制慢性疲勞大鼠細胞因子的釋放，調(diào)節(jié)紊亂的免疫功能，發(fā)揮抗疲勞作用，對慢性疲勞大鼠具有一定的防治作用。

慢性疲勞綜合征/針灸療法；逆針灸；IL-1β；IL-6；動物模型；大鼠

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)指以慢性疲勞持續(xù)或反復發(fā)作6個月以上為主要表現(xiàn)，同時伴有低熱、頭痛、咽喉痛、肌痛、神經(jīng)精神癥狀等非特異性癥狀的一組癥候群，臨床檢查多無明顯器質(zhì)性改變。[1]CFS的發(fā)病機制比較復雜，目前比較認同的觀點是應激狀態(tài)下引起的神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)改變，除了下丘腦-垂體-腎上腺軸外，免疫系統(tǒng)中的細胞炎癥因子也參與了應激反應，這些細胞因子可以影響神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)，共同完成應激反應。Pall等[2]認為細胞因子改變所致的表現(xiàn)與CFS患者的臨床癥狀有相似之處,故認為細胞因子與CFS的病理有重要的聯(lián)系。根據(jù)美國疾病控制中心1994年制訂的慢性疲勞綜合征的診斷標準，本病在明確診斷前至少有6個月的潛伏時間。對于尚處于萌芽階段的疾病，若能積極采取預防措施，可能會延緩或防止病情的進一步發(fā)展，促使疾病早期治愈。針灸是重要的治未病手段，能激發(fā)經(jīng)絡之氣，扶助正氣，提高機體抵御各種致病因子的能力，從而達到防止疾病的發(fā)生、減輕隨后疾病的損害的目的，是一種更加注重機體自身潛能激發(fā)與利用的方法[3]。本實驗擬對慢性疲勞大鼠進行超早期的針灸干預，初步揭示逆針灸對慢性疲勞大鼠細胞因子的影響，為慢性疲勞綜合征的超早期防治提供實驗及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量為(180±20)g，清潔級，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。除實驗期間的特殊要求外，其余時間動物均飼養(yǎng)于溫度(18～25 ℃)、濕度(55%±2%)相對恒定的動物飼養(yǎng)室，可以自由進食和飲水。

1.2 儀 器

華佗牌一次性針灸針，蘇州醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品，規(guī)格：直徑0.30 mm，長度25 mm。佳健CMNS6-Ⅰ型電子針灸治療儀，無錫佳健醫(yī)療器械股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組

適應性飼養(yǎng)1周后，將40只大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、逆針灸1組和逆針灸2組，每組10只。

1.4 造模方法

模型對照組和預處理后的逆針灸組采用多因素刺激方法制備慢性疲勞大鼠模型。①冷水游泳：大鼠游泳桶寬40 cm，高50 cm。大鼠游泳時水深40 cm，水溫21 ℃左右，每次游泳30 min。②束縛法：束縛大鼠四肢，每次3 h。③晝夜顛倒1次。第1個2 4 h，無措施。第2個24 h，早8:30用晝夜顛倒鼠籠罩罩住鼠籠，模擬夜晚；晚8:30給予日光燈持續(xù)照明，模擬白晝。每次隨機安排1種，使動物不能預料刺激的發(fā)生，以避免產(chǎn)生適應性。共21 d。

1.5 針刺方法

逆針灸2組：先給予大鼠電針刺激20 d，再制備慢性疲勞大鼠模型。穴位選取百會、足三里、三陰交、太沖。頭部穴位平刺進針，四肢穴位直刺進針，用30號1寸毫針，深度0.5～1 cm，電針頻率2 Hz，電流強度0.6 mA，以大鼠頭部微顫為宜。每次20 min。5 d為1個療程，中間休息1 d，共4個療程。

逆針灸1組：大鼠先平行飼養(yǎng)，再給予電針刺激10 d，然后制備慢性疲勞大鼠模型。針灸操作同逆針灸2組。

模型對照組和正常對照組同逆針灸組平行飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.6 檢測指標

1.6.1 體質(zhì)量

每周稱量動物的體質(zhì)量，對比實驗第1天和最后1天動物的體質(zhì)量。

1.6.2 力竭游泳實驗

分別于實驗第1天和最后1天進行。將各組大鼠分別放入游泳桶(寬40 cm，高50 cm)中，水位稍低于水桶深度，水溫(20±1) ℃，記錄其從入水到力竭(以頭部沉入水中10 s不能浮出水面為力竭標準)的時間。

1.6.3 血清IL-1β、IL-6含量

實驗結束后，稱量大鼠體質(zhì)量并記錄，根據(jù)體質(zhì)量以3 μL/g 選用100 g/L水合氯醛對大鼠進行腹腔麻醉。將麻醉后的大鼠仰臥位平鋪于操作臺上，用手術刀切開腹部，暴露下腔腹主動脈，用注射器抽取5 mL血液，迅速注入試管中，靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min。取上清液血清，注入一次性EP管中，做好標記,放入-70 ℃冰箱中保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清IL-1β、IL-6含量，操作步驟如下：①在酶標包被板上分別設空白孔、標準品孔、待測樣品孔?？瞻讓φ湛咨喜患訕悠泛兔笜嗽噭藴势房字屑尤胂♂尯玫臉藴势?0 μL；待測樣品孔中先加樣品10 μL，再加待測樣品稀釋液40 μL。②標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。③棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次。④每孔加入顯色劑 A、B 各50 μL，振蕩混勻，37 ℃避光孵育15 min。⑤取出酶標板，加入 50 μL 終止液，終止反應。⑥迅速使用酶標儀在 450 nm 波長下測量各孔的吸光度值(OD 值)。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結 果

逆針灸1組、逆針灸2組的大鼠各死亡1只。

2.1 各組大鼠體質(zhì)量對比

實驗前：各組大鼠的進食量、飲水量、體質(zhì)量、活動等情況無明顯差異，說明各組基線情況一致，具有可比性。實驗期間：正常對照組大鼠的進食量、體質(zhì)量均持續(xù)增長，活動良好。模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠體質(zhì)量明顯下降，與正常對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。逆針灸1組大鼠體質(zhì)量下降明顯，與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。逆針灸1組、逆針灸2組大鼠體質(zhì)量比較，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組 別動物數(shù)第1天第44天正常對照組10232.20±13.63327.50±19.67模型對照組10241.70±11.16290.40±33.25***逆針灸1組9234.00±6.25255.33±23.77***##逆針灸2組9240.33±15.44267.33±21.43***△

注：與正常對照組對比，***P<0.01;與模型對照組對比，##P<0.05;與逆針灸1組對比，△P>0.05。

2.2 各組大鼠力竭游泳時間對比

實驗前各組大鼠力竭游泳時間對比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗后：與正常對照組對比，模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠力竭游泳時間明顯縮短，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠力竭游泳時間明顯延長，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。逆針灸1組和2組力竭游泳時間對比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠力竭游泳時間對比±s

注：與正常對照組對比，**P<0.05；與模型對照組對比，###P<0.01;與逆針灸1組對比，△P>0.05。

2.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6含量對比

與正常對照組對比，模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠血清IL-1β、IL-6含量明顯增加，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠血清IL-1β、IL-6含量明顯降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。逆針灸1組、逆針灸2組血清IL-1β對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但兩組間IL-6含量對比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

組 別動物數(shù)IL-1βIL-6正常對照組1015.89±2.2751.86±6.16模型對照組1036.80±4.39***109.70±9.38***逆針灸1組923.63±1.75***###71.86±4.70***###逆針灸2組927.10±1.51***###ΔΔΔ79.65±5.19***###Δ

注：與正常對照組對比，***P<0.01；與模型對照組對比，###P<0.01；與逆針灸1組對比，ΔP>0.05,ΔΔΔP<0.01 。

3 討 論

研究表明：慢性疲勞綜合征患者存在免疫功能異常，其中細胞因子與CFS癥狀的出現(xiàn)關系密切，認為慢性免疫激活狀態(tài)可導致細胞因子的釋放增多，從而擾亂神經(jīng)遞質(zhì)的功能，導致CFS的一系列征狀出現(xiàn)[4]。IL-1β和IL-6是其中最重要的細胞因子，在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)應激反應的雙向調(diào)節(jié)中具有重要作用。IL-1β在應激反應中一方面調(diào)節(jié)下丘腦中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的分泌，從而影響垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素；另一方面可以直接作用于垂體，促使其分泌促腎上腺皮質(zhì)激素。反之糖皮質(zhì)激素亦能反向控制IL-1β的分泌[5]。有報道認為：大鼠大強度運動加心理應激后IL-1β水平呈持續(xù)升高趨勢，提示應激后機體免疫調(diào)節(jié)功能下降[6]。IL-6被認為是疲勞誘導細胞因子。體外實驗[7]發(fā)現(xiàn)：在運動過程中IL-6分泌增加，如給予 hrIL-6可使健康者的疲勞感增加，相反若給予抗 IL-6 受體的抗體則慢性疲勞癥狀減弱，提示 IL-6參與了CFS發(fā)生發(fā)展的過程，影響人體的情緒反應，使人變得淡漠、抑郁、焦慮等，出現(xiàn)不良的心理情緒反應。研究發(fā)現(xiàn)：IL-6在應激反應中不僅通過剌激淋巴細胞分化，促進急性期的應激反應；還可以促進促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的分泌，進而影響腎上腺皮質(zhì)激素的分泌[5]。大量實驗研究表明:針灸對慢性疲勞大鼠細胞因子有良性調(diào)節(jié)作用[8-10]，提示針灸可能通過影響細胞因子，提高免疫力，從而達到治療CFS的目的。

逆針灸首見于明代高武的《針灸聚英》[11]，其載：“無病而先針灸曰逆。逆,未至而迎之也?！?指在機體健康無病、疾病即將發(fā)生之前或疾病輕淺之時預先應用針灸方法激發(fā)經(jīng)絡之氣，提高正氣，平衡陰陽，防止疾病發(fā)生，以減輕疾病損害的程度。研究[12-13]發(fā)現(xiàn)：對未病機體預先給予針灸刺激，正是激發(fā)機體產(chǎn)生良性應激的有效手段，可以啟動機體內(nèi)源性保護機制，對機體進行調(diào)整，減輕或抵抗隨后疾病的損害，提高機體的抵抗與應變能力，說明逆針灸確實對機體具有預防保護作用?；卺樉膶FS的良好的調(diào)節(jié)作用，本實驗提出了在CFS的萌芽階段，給予逆針灸干預，探討逆針灸對慢性疲勞大鼠可能的作用機制，為CFS超早期防治提供實驗及理論依據(jù)。

本研究結果顯示：模型對照組大鼠造模后力竭游泳時間明顯縮短，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠造模后力竭游泳時間比模型對照組明顯延長，說明經(jīng)過21 d的多因素應激刺激后，各組大鼠均有軀體和心理疲勞，但早期的逆針灸干預能明顯減輕大鼠疲勞絕望狀態(tài)，對其具有良性的調(diào)整作用。本研究結果還顯示：模型對照組大鼠血清IL-1β、IL-6明顯增加(P<0.01)，提示IL-1β、IL-6參與了慢性應激反應，長期慢性應激導致大鼠免疫功能發(fā)生紊亂，細胞因子釋放明顯增多；逆針灸1組、逆針灸2組與模型對照組對比，血清IL-1β、IL-6顯著降低(P<0.01)，提示逆針灸作為一種良性應激的有效手段，能調(diào)節(jié)大鼠紊亂的免疫功能，抑制細胞因子的釋放，減輕慢性疲勞大鼠細胞免疫功能的損害，從而發(fā)揮防治作用，這可能是逆針灸干預慢性疲勞綜合征的機制之一。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)04-0073-04

R245.3

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.04.31

華金雙(1974-)，女(漢族)，黑龍江大慶人，副教授，博士，研究方向：針灸防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎研究。

河南省高等學校重點科研項目(15A360023)；國家中醫(yī)藥管理局河南邵氏針灸流派傳承工作室建設項目(國中醫(yī)藥人教函〔2012〕228號)

2017-01-19；

2017-03-02