于景霞 劉 婷 李沁愷 徐銘益 陸倫根

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科(200080)

特異性抑制JAK/STAT3信號通路對大鼠肝細(xì)胞癌的影響*

于景霞#劉 婷 李沁愷 徐銘益 陸倫根&

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科(200080)

背景：研究表明，異常激活的JAK/STAT3信號通路可促進(jìn)肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生、發(fā)展；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用。目的：探討特異性抑制JAK/STAT3信號通路對HCC的影響以及TGF-β1信號通路在其中的可能作用。方法：30只Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組、HCC組和HCC+AG490組，后兩組以二乙基亞硝胺制作HCC模型，HCC+AG490組造模第1周腹腔內(nèi)注射JAK特異性抑制劑AG490。第16周末處死大鼠，記錄肝內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)的最大直徑，計數(shù)最大直徑>1 cm的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)，以real-time PCR、免疫組化和免疫熒光染色檢測肝組織中STAT3、TGF-β1的表達(dá)和分布。結(jié)果：與對照組相比，HCC組肝組織中STAT3、TGF-β1 mRNA表達(dá)顯著增高(P<0.05)。磷酸化STAT3(p-STAT3)、TGF-β1蛋白在對照組肝組織中呈陰性表達(dá)，在HCC組則分別呈陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)，且兩者有明顯的共表達(dá)區(qū)域。HCC+AG490組STAT3、TGF-β1 mRNA表達(dá)較HCC組顯著降低(P<0.05)，p-STAT3、TGF-β1蛋白呈弱陽性表達(dá)，直徑>1 cm的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和最大直徑均顯著小于HCC組[1.20±1.03和(1.14±0.18) cm 對4.30±1.06和(1.78±0.27) cm，P均<0.05]。結(jié)論：特異性抑制JAK/STAT3信號通路可抑制HCC發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1信號通路有關(guān)。

癌，肝細(xì)胞； STAT3轉(zhuǎn)錄因子； 轉(zhuǎn)化生長因子β1

研究表明，異常激活的Janus蛋白酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白3(JAK/STAT3)信號通路可促進(jìn)肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生、發(fā)展[1-2]。正常肝組織內(nèi)，作為STAT3活化狀態(tài)的磷酸化STAT3(p-STAT3)幾乎不表達(dá)，在HCC組織中的表達(dá)則顯著增強(qiáng)，并與預(yù)后不良相關(guān)，提示阻斷JAK/STAT3信號通路可能作為HCC的治療靶點(diǎn)[2]。AG490是一種人工合成的JAK特異性抑制劑[3]，可特異性地抑制JAK/STAT3信號通路激活。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是一種多能細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡，參與損傷修復(fù)、血管形成、細(xì)胞外基質(zhì)形成[4]，并在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用[5]。本研究旨在探討在大鼠HCC模型中特異性抑制JAK/STAT3信號通路對HCC發(fā)生、發(fā)展的影響，以及TGF-β1信號通路在其中的可能作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑

清潔級健康雄性Wistar大鼠30只，約6周齡，體質(zhì)量140～160 g，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，自由飲水和進(jìn)食。

二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)、AG490(Sigma-Aldrich Co.LLC.)，TRIzol RNA 分離試劑(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific)，real-time PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Bio Inc.)， real-time PCR試劑盒(Promega Corporation)，p-STAT3單克隆抗體、TGF-β1單克隆抗體(Abcam plc.)，GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒[基因科技(上海)股份有限公司]，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔、Cy3標(biāo)記山羊抗鼠熒光二抗(Jackson ImmunoResearch)。

二、動物分組和HCC模型建立

將30只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，對照組實(shí)驗(yàn)過程中飲用滅菌食用水，HCC組飲水中添加濃度為0.05 g/L的致癌物DEN，HCC+AG490組除予DEN干預(yù)外，造模第1周以1 mg·kg-1·d-1的劑量腹腔內(nèi)注射JAK/STAT3信號通路抑制劑AG490。第16周末處死所有大鼠，完整取下肝臟，記錄肝內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)的最大直徑，計數(shù)最大直徑>1 cm的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)，同時留取肝組織行real-time PCR和免疫組化、免疫熒光染色。

三、方法

1.Real-time PCR：以TRIzol試劑提取肝組織總RNA，行RNA定量和電泳鑒定。以Primer Premier 5.0軟件設(shè)計STAT3、TGF-β1引物序列，β-actin作為內(nèi)參(表1)。參照試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以之為模板行real-time PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 Real-time PCR引物序列

2.免疫組化染色：肝組織以4%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，切片脫蠟、水化，PBS浸洗，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加入p-STAT3(1∶100)或TGF-β1(1∶100)單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，按試劑盒說明書操作加入A液和B液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

3.免疫熒光染色：切片制作和處理同免疫組化染色，一抗孵育過夜后加入熒光二抗(1∶300)，37 ℃ 孵育30 min，DAPI染核，封片，免疫熒光顯微鏡下觀察、拍照。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、肝組織STAT3、TGF-β1 mRNA表達(dá)

Real-time PCR檢測顯示，與對照組相比，HCC組肝組織中STAT3、TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量顯著增高，分別為2.06±0.24(P=2.62E-5)和3.23±0.36(P=3.44E-4)；HCC+AG490組兩者相對表達(dá)量分別為1.41±0.14和1.57±0.26，均較HCC組顯著降低(P=2.13E-4，P=3.38E-6)。

二、肝組織p-STAT3、TGF-β1蛋白表達(dá)和定位

免疫組化染色顯示，p-STAT3蛋白在對照組肝組織中呈陰性表達(dá)，在HCC組肝組織中呈陽性表達(dá)，在HCC+AG490組肝組織中，表達(dá)強(qiáng)度較HCC組減弱。TGF-β1蛋白在各組肝組織中的表達(dá)趨勢與p-STAT3蛋白一致，在對照組肝組織內(nèi)幾乎不表達(dá)，在HCC組肝組織內(nèi)則呈強(qiáng)陽性表達(dá)，HCC+AG490組表達(dá)強(qiáng)度較HCC組明顯減弱(圖1)。

免疫熒光染色顯示，HCC組肝組織內(nèi)可觀察到p-STAT3蛋白(綠色熒光)和TGF-β1蛋白(紅色熒光)陽性表達(dá)，兩者有明顯的共表達(dá)區(qū)域，HCC+AG490組肝組織內(nèi)兩者表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱，共表達(dá)區(qū)域明顯減少(圖2)。

三、HCC模型腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和最大直徑

對照組大鼠肝組織內(nèi)未見肝癌結(jié)節(jié)，HCC組和HCC+AG490組大鼠肝組織內(nèi)可觀察到大小不等的肝癌結(jié)節(jié)。HCC組直徑>1 cm的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)為4.30±1.06，最大直徑為(1.78±0.27) cm，HCC+AG490組兩組數(shù)據(jù)分別為1.20±1.03和(1.14±0.18) cm，均顯著小于HCC組(P=3.21E-6，P=6.61E-6)。

討 論

生理情況下，胞外細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6(IL-6)、表皮生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)等與膜受體結(jié)合后，可與JAK偶聯(lián)，進(jìn)一步使下游STAT3發(fā)生磷酸化， p-STAT3以二聚體的形式轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，與靶基因特異性結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程[6]。JAK/STAT3信號通路激活的同時，其負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子如含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP)和細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)亦被激活，以確保STAT3在迅速、短暫的激活后被及時滅活[7]。而在腫瘤微環(huán)境中，升高的IL-6、生長因子、活性氧簇(ROS)等可使STAT3持續(xù)激活，擾亂細(xì)胞生理活動，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。在特定組織細(xì)胞中特異性敲除STAT3基因的動物實(shí)驗(yàn)研究表明，STAT3是一個重要的促癌轉(zhuǎn)錄因子，參與了結(jié)腸癌[8]、HCC[1]等惡性腫瘤的發(fā)生，肝細(xì)胞特異性STAT3基因敲除可顯著降低DEN誘導(dǎo)的小鼠HCC模型的腫瘤發(fā)生率，縮小腫瘤體積[1]。

圖1 各組大鼠肝組織p-STAT3、TGF-β1免疫組化染色(×200)

箭頭所示為p-STAT3蛋白與TGF-β1蛋白共表達(dá)區(qū)域

TGF-β1可與細(xì)胞表面跨膜受體TβRⅠ/Ⅱ結(jié)合，通過Smad或非Smad途徑影響基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮多種生物學(xué)功能[4]。研究表明，TGF-β信號通路可介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，增強(qiáng)腫瘤的遷移和侵襲能力[9]；TGF-β1與HCC的腫瘤血管生成亦有密切關(guān)聯(lián)，可為腫瘤生長和進(jìn)展提供有利條件[10-11]；此外，TGF-β介導(dǎo)的EMT還可使腫瘤細(xì)胞去分化而獲得腫瘤干細(xì)胞特性，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[9]。

本研究以大鼠HCC模型為研究對象，觀察以AG490特異性抑制JAK/STAT3信號通路對HCC以及TGF-β1信號通路的影響，結(jié)果顯示HCC組和HCC+AG490組大鼠肝組織中STAT3 基因表達(dá)和蛋白磷酸化水平差異顯著。HCC組大鼠肝組織中p-STAT3呈陽性表達(dá)，提示HCC發(fā)生過程中存在STAT3過度激活，而AG490可有效抑制STAT3基因表達(dá)和蛋白磷酸化。在HCC組和HCC+AG490組大鼠肝組織中，STAT3、TGF-β1基因和蛋白表達(dá)的變化趨勢具有一致性，且免疫熒光染色證實(shí)兩者在HCC組織中呈共表達(dá)。JAK/STAT3信號通路抑制后，模型大鼠肝癌結(jié)節(jié)的數(shù)量和體積均顯著減小，表明HCC生長受抑。上述發(fā)現(xiàn)提示JAK/STAT3和TGF-β1信號通路在HCC的發(fā)生、發(fā)展中存在密切聯(lián)系。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在HCC的發(fā)生、發(fā)展過程中存在JAK/STAT3信號通路過度激活，伴隨TGF-β1信號通路活化；特異性抑制JAK/STAT3信號通路可抑制HCC發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1信號通路有關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)為HCC的防治提供了新的靶點(diǎn)和思路。

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(2016-10-22收稿；2016-12-25修回)

Effect of Specific Inhibition of JAK/STAT3 Signaling Pathway on Hepatocellular Carcinoma in Rats

YUJingxia,LIUTing,LIQinkai,XUMingyi,LULungen.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiGeneralHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai(200080)

LU Lungen,Email:lungenlu1965@163.com

Carcinoma,Hepatocellular; STAT3 Transcription Factor; Transforming Growth Factor beta1

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.05.004

國家科技部“十二五”國家科技重大專項(xiàng)(2013ZX10002004-002-003)；國家自然科學(xué)基金(81570547)

#Email:yujingxia9535@163.com

&本文通信作者，Email:lungenlu1965@163.com

Background:Studies showed that aberrant activation of JAK/STAT3 signaling pathway promoted the tumorigenesis and progression of hepatocellular carcinoma (HCC),and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) has either tumor-suppressing or tumor-promoting effect in regulation of tumor progression.Aims:To investigate the effect of specific inhibition of JAK/STAT3 signaling pathway on HCC and whether TGF-β1 signaling pathway is involved in this process or not.Methods:Thirty Wistar rats were randomly divided into three groups:control group,HCC group,and HCC+AG490 group.In the latter two groups,diethylnitrosamine was administered in drinking water to induce HCC model,and in HCC+AG490 group,AG490,a specific inhibitor of JAK was injected intraperitoneally in the first week of model establishment.At the end of the 16th week,all rats were sacrificed.The maximum diameter of tumor nodules in the liver was recorded and the number of tumors with maximum diameter greater than 1 cm was counted.Expression and distribution of STAT3 and TGF-β1 in liver tissue were determined by real-time PCR,immunohistochemistry,and immunofluorescence.Results:Compared with the control group,expressions of STAT3 and TGF-β1 mRNA in liver tissue were significantly increased in HCC group (P<0.05).Phosphorylated STAT3 (p-STAT3) and TGF-β1 proteins were absent in liver tissue in control group,and both were up-regulated and co-expressed in HCC group.While in HCC+AG490 group,expressions of STAT3 and TGF-β1 mRNA were significantly lower than those in HCC group (P<0.05);the liver tissue was weakly positive for p-STAT3 and TGF-β1 proteins,and the number of tumor nodules greater than 1 cm and the maximum diameter were markedly reduced when compared with the HCC group [1.20±1.03 and (1.14±0.18) cmvs.4.30±1.06 and (1.78±0.27) cm,Pall<0.05].Conclusions:Specific inhibition of JAK/STAT3 signaling pathway may restrain the tumorigenesis and progression of HCC partially by interfering TGF-β1 signaling pathway.