韓 旭，李廣云，尹寧寧，許銳偉，王麗萍

（中國礦業(yè)大學(xué) 環(huán)境與測繪學(xué)院，江蘇 徐州 221116）

土壤修復(fù)

Fenton氧化—微生物法降解土壤中石油烴

韓 旭，李廣云，尹寧寧，許銳偉，王麗萍

（中國礦業(yè)大學(xué) 環(huán)境與測繪學(xué)院，江蘇 徐州 221116）

以長期被苯系物污染的活性污泥為菌源，采用液相“誘導(dǎo)物-中間產(chǎn)物-目標(biāo)污染物”馴化模式馴化出專性混合石油降解菌群，并將其用于Fenton氧化—微生物法處理模擬石油污染土壤。高通量測序結(jié)果表明，產(chǎn)黃桿菌屬（Rhodanobacter）、分支桿菌屬（Mycobacterium）和根瘤菌屬（Rhizobiales）為主導(dǎo)菌屬。實驗結(jié)果表明：接種混合菌群后降解50 d，土樣的總石油烴（TPH）去除率較土著菌提高了13.4～20.5百分點；對于TPH含量（w）分別為4%，8%，11%的土樣，F(xiàn)enton氧化的最佳H2O2加入量分別為3，4，4 mol/L（Fe2+加入量0.04 mol/L），TPH總?cè)コ史謩e可達(dá)88.8%，65.0%，47.7%，較單獨Fenton氧化或單獨微生物法均有很大程度的提高，且縮短了降解時間，增加了土壤有機質(zhì)。

專性混合石油降解菌；Fenton氧化；微生物法；石油烴

石油是一種重要的化石能源，伴隨著石油的開采、運輸、分離提純等作業(yè)過程，引發(fā)了不同程度的環(huán)境污染。其中，滯留、富集于土壤或地層中的石油烴污染物具有高毒性、脂溶性、難降解、易生物富集等特點，會破壞生物的正常生活環(huán)境，造成生物機能障礙［1］。

Fenton氧化法被廣泛應(yīng)用于土壤中石油烴的去除。劉其友等［2］對比了Fenton氧化前后土壤中石油烴的紅外光譜，發(fā)現(xiàn)經(jīng)Fenton氧化處理后試樣中的羰基和芳香環(huán)均減少，表明Fenton氧化對土壤中大分子石油烴組分的降解相對明顯；但對于不易化學(xué)降解的石油烴組分，單獨Fenton氧化法難以處理，從而導(dǎo)致礦化不完全，且對土壤有機質(zhì)（SOM）易造成損傷。另一方面，微生物法作為一種環(huán)境友好的處理方法也大量應(yīng)用于土壤中石油烴的降解［3］，但微生物法也存在明顯的缺點，如對于復(fù)雜石油烴以及高濃度、高毒性污染物的降解效果不明顯，且降解周期長，易受溫度、pH、營養(yǎng)元素等因素的影響［4-5］。

本工作以長期被苯系物污染的活性污泥為菌源，采用液相“誘導(dǎo)物-中間產(chǎn)物-目標(biāo)污染物”馴化模式馴化出專性混合石油降解菌群，并將其用于Fenton氧化-微生物法處理模擬石油污染土壤中，考察了土壤中總石油烴（TPH）和SOM的變化，以期為土壤中石油污染物的去除提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑、材料和儀器

30%（w）H2O2溶液：購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；FeSO4·7H2O、無水硫酸鈉：購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石油醚（沸程30～60 ℃）、重鉻酸鉀：購于上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

石油：取自江蘇省徐州市中國石化集團(tuán)管道儲運公司。

活性污泥：取自徐州華裕煤氣有限公司焦化廢水處理廠污泥濃縮池，長期被苯系物污染，MLVSS為6 102 mg/L，有效活菌數(shù)為4.24×108CFU/mL。

原始土樣：采自中國礦業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的表層（0～10 cm）土壤，去除大顆粒物后置于陰涼處風(fēng)干72 h，反復(fù)研磨后過2 mm篩，保存待用。原始土樣的理化性質(zhì)見表1。

表1 原始土樣的理化性質(zhì)

DHG-9240B型電熱鼓風(fēng)干燥箱：杭州匯銳儀器設(shè)備有限公司；CRY-100B型恒溫培養(yǎng)搖床：上海茸研儀器有限公司；TG16C/TG16型臺式離心機：長沙英泰儀器有限公司；pHS-3CA型精密pH計：上海世羲精密儀器有限公司；HH-3A型恒溫水浴鍋：常州市萬合儀器制造有限公司。

1.2 模擬石油污染土樣的制備

采用均勻混合法制備不同污染強度的土樣：分別稱取19.2，18.4，17.8 g原始土樣于3個250 mL錐形瓶中，向其中分別加入0.8，1.6，2.2 g石油，再分別倒入約50 mL石油醚溶解石油使其均勻分布于土壤中；輕輕振蕩，混合均勻后將錐形瓶置于通風(fēng)櫥，待石油醚完全揮發(fā)后待用。將TPH含量（w）分別為4%，8%，11%的模擬石油污染土樣分別編號為S1，S2，S3。

1.3 石油降解菌的馴化

采用液相“誘導(dǎo)物-中間產(chǎn)物-目標(biāo)污染物”遞進(jìn)式馴化方式?；钚晕勰嘤酶邷販缇蟮纳睇}水稀釋制得菌懸液，置于塑料桶中曝氣48 h，以消耗其中的碳源。然后進(jìn)入液相馴化階段，每天添加無機營養(yǎng)液和底物（添加量50～2 000 mg/L，逐日遞增）。第1周期為期5 d，為誘導(dǎo)階段，每天添加乳化甲苯溶液；第2周期為期5 d，每天添加鄰苯二酚溶液；第3周期為期10 d，為“中間產(chǎn)物-目標(biāo)污染物”雙底物馴化階段，每天添加鄰苯二酚和石油烴；第4周期為期10 d，每天添加石油烴。取第4周期后得到的菌懸液備用，其中的菌群即為本實驗的石油降解菌。

1.4 石油烴的降解實驗

1.4.1 微生物法

將20 g污染土樣置于250 mL錐形瓶中，加入一定量的菌懸液；固定C，N，P的質(zhì)量比為100∶15∶1，在恒溫（25 ℃）搖床中降解一段時間后取樣測定。同時，以未添加菌懸液的土樣進(jìn)行對照實驗。

1.4.2 Fenton氧化法

將20 g污染土樣置于250 mL錐形瓶中，根據(jù)Fenton試劑的配比加入一定量的FeSO4溶液，使Fe2+加入量為0.04 mol/L，攪拌搖勻，調(diào)節(jié)pH至3.5左右，在攪拌下緩慢加入一定量的H2O2溶液，固定水土比為5∶2 mL/g，氧化反應(yīng)120 min后取樣待測。

1.4.3 Fenton氧化—微生物法

將經(jīng)Fenton氧化法處理后的土樣，按1.4.1小節(jié)的方法進(jìn)行微生物處理。

1.5 分析方法

馴化后的微生物群落的總DNA根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）的規(guī)范步驟進(jìn)行提取，提取后委托上海派森諾生物科技股份公司采用Illumina MiSeq平臺的宏基因組進(jìn)行高通量測序分析。

采用重量法［6］測定土樣的TPH含量；采用重鉻酸鉀法［7］測定土樣的SOM含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 石油降解菌的鑒定結(jié)果

石油降解菌在綱、屬水平上的分布見表2，Genbank登錄號SRP083938。由表2可見，從綱水平上講，α-變形菌綱、γ-變形菌綱和放線菌綱為優(yōu)勢菌綱，分別占總菌群的41%、35%和12%。研究表明，α-變形菌綱細(xì)菌在氧氣充足的條件下可以成為降解多環(huán)芳烴的優(yōu)勢菌之一［8］。韓平等［9］從勝利油田灘涂區(qū)土壤中篩選出γ-變形菌綱，該菌對石油烴的降解率大于90%，能降解石油中大部分的石油烷烴。

表2 石油降解菌在綱、屬水平上的分布

由表2還可見，從屬水平上分析，占比34.48%的產(chǎn)黃桿菌屬菌株最多，其次為占比11.77%的分支桿菌屬菌株和占比11.44%的根瘤菌屬菌株。Kanaly等［10］從土壤中分離出的產(chǎn)黃桿菌屬菌株，可有效降解多環(huán)芳烴中的苯并芘，礦化度達(dá)60%以上。分支桿菌屬菌株可高效降解環(huán)境中的多環(huán)芳烴，特別是四環(huán)和五環(huán)以上的芳烴［11］。張帆等［12］從華北某油田污染土壤中篩選出5株具有較強降解能力的石油降解菌，根瘤菌屬菌株作為其中之一經(jīng)過10 d培養(yǎng)后對的石油烴的降解率可達(dá)34.2%。

以上結(jié)果表明，馴化后所得菌群中的優(yōu)勢菌株可降解石油烴中某些難降解組分，具有一定的專性石油降解能力，為專性混合石油降解菌群。

2.2 石油降解菌的降解性能

當(dāng)菌懸液加入量為0.10 mL/g時，石油降解菌加入前后TPH的去除率對比見圖1。

圖1 石油降解菌加入前后TPH的去除率對比

對于3種污染程度的土樣，10～30 d時TPH均降解迅速，30 d后TPH去除率升勢趨緩。這可能有兩個原因：1）隨著土壤中營養(yǎng)鹽和碳源的消耗，菌類的生命活性受到營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的影響，活性下降［13］；2）降解生成的中間產(chǎn)物很難被菌株再次降解，這與污染物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)［14］，且剩余未降解石油成分也難以被土著菌降解。50 d時：加入石油降解菌前后的TPH去除率均達(dá)測定范圍最大值；引入石油降解菌后土壤修復(fù)效果較單純土著菌修復(fù)效果明顯改善，TPH去除率提升了13.4～20.5百分點，且對較輕污染程度的土壤修復(fù)效果更好?？赡艿脑蚴牵?）污染程度較重土壤毒性較高，對于菌類有毒害作用［15］，導(dǎo)致耐受性差的菌群生命活性下降；2）由于污染土壤中石油黏稠性質(zhì)的影響，土壤的通透性下降，導(dǎo)致菌類呼吸作用受阻［16］，從而影響其生命活性。

2.3 Fenton氧化條件的優(yōu)化

H2O2與Fe2+加入量對芬頓試劑的氧化能力影響很大［17］，投加過多會消耗羥基自由基（·OH），從而影響·OH氧化石油污染物的效果，故需對實驗條件進(jìn)行優(yōu)化。

H2O2加入量對TPH去除率和SOM含量的影響見圖2。由圖2可見：對于S1，隨著H2O2加入量的不斷增加，TPH去除率也逐漸提高；當(dāng)H2O2加入量為3 mol/L時，S1的TPH去除率達(dá)60.0%；但繼續(xù)增加H2O2加入量TPH去除率的提升不明顯。原因可能是當(dāng)H2O2加入量過多時，單位時間內(nèi)產(chǎn)生的·OH處于過量狀態(tài)，·OH間會發(fā)生內(nèi)部反應(yīng)［18］，降低了其與目標(biāo)污染物的接觸概率，且吸附在深層土壤中的石油烴難以解析，作為難溶有機物降低了傳質(zhì)效果，使得總體氧化能力不再繼續(xù)增強。S2和S3與S1的情況類似，但其H2O2加入量的拐點為4 mol/L。

圖2 H2O2加入量對TPH去除率和SOM含量的影響

SOM在菌群生存環(huán)境和有機污染物的吸附過程中都起著重要的作用［19］，鑒于Fenton試劑的強氧化性，·OH能無選擇地與有機物反應(yīng)，同時也能把SOM部分氧化［20］。由圖2可見，土樣S1，S2，S3經(jīng)Fenton氧化處理后，SOM含量均有不同程度的降低，且H2O2加入量越多SOM含量越低，說明高濃度的H2O2對SOM有損壞。因此，為保證土壤的綜合修復(fù)效果，H2O2加入量不宜過多。

綜上所述，對于土樣S1，S2，S3，最佳H2O2加入量分別為3，4，4 mol/L。

2.4 Fenton氧化—微生物法的處理效果

在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行Fenton氧化處理后的土樣再經(jīng)微生物降解20 d后，其處理效果見圖4。由圖4可見，隨著菌懸液加入量的增加，不同污染程度土樣的TPH去除率均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。分析其原因可能是接種的微生物過多時，使菌體過度繁殖，菌體對土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的相互競爭導(dǎo)致營養(yǎng)短缺［21］，致使其新陳代謝和生長速率減緩，影響了菌群對石油烴的吸收降解。通過對SOM含量的測定，發(fā)現(xiàn)菌懸液的加入在一定程度增加了土壤中的有機質(zhì)。

圖4 Fenton氧化—微生物法的處理效果

由圖4還可見：對于低污染程度的土樣S1，該方法的TPH去除率最高達(dá)88.8%（菌懸液加入量0.10 mL/g），S2和S3的最高TPH去除率分別為65.0%和47.7%（菌懸液加入量0.20 mL/g）；對于3種污染程度的土樣，其最高TPH去除率較單獨Fenton氧化法提高9.6～28.8百分點。與劉其友等［2］單獨使用Fenton氧化法處理8%（w）稠油污染土壤中石油烴的效果相比，本實驗的聯(lián)合處理效果有明顯改善。另一方面，由于S3污染程度較大，TPH去除率最高僅為47.7%，土壤中的石油烴約一半還未降解，可見對于高濃度石油烴污染，該方法未能達(dá)到很好的降解效果。Fenton氧化—微生物法20 d時對S1的TPH去除率達(dá)到88.8%，而單獨微生物法50 d時對S1的TPH去除率僅為44.0%，說明Fenton氧化—微生物法不僅提升了降解效果，而且縮短了降解時間，體現(xiàn)了其高效性；同時，F(xiàn)enton氧化—微生物法還增加了SOM，是一種環(huán)境友好的方法。

3 結(jié)論

a）以長期被苯系物污染的活性污泥為菌源，采用液相“誘導(dǎo)物-中間產(chǎn)物-目標(biāo)污染物”馴化模式馴化出專性混合石油降解菌群，高通量測序結(jié)果表明：產(chǎn)黃桿菌屬（Rhodanobacter sp.）、分支桿菌屬（Mycobacterium sp.）和根瘤菌屬（Rhizobiales sp.）為主導(dǎo)菌屬。

b）向3種不同污染程度土壤中加入0.10 mL/g菌懸液后降解50 d，TPH去除率較土著菌提高了13.4～20.5百分點。

c）對于土樣S1，S2，S3，F(xiàn)enton氧化的最佳H2O2加入量分別為3，4，4 mol/L。

d）Fenton氧化—微生物法對土樣S1，S2，S3的TPH去除率分別可達(dá)88.8%，65.0%，47.7%，較單獨Fenton氧化或單獨微生物法均有很大程度的提升，且縮短了降解時間，增加了SOM。

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（編輯 魏京華）

Degradation of petroleum hydrocarbons in soil by Fenton oxidation-microbial method

Han Xu，Li Guangyun，Yin Ningning，Xu Ruiwei，Wang Liping
（School of Environment Science and Spatial Informatics，China University of Ming and Technology，Xuzhou Jiangsu 221116，China）

Using the activated sludge which was long-term polluted by benzene as bacteria source，the specifi c mixed petroleum-degrading bacteria were acclimated in liquid phase by the model of “inducer-intermediate product-target pollutant”，and used for treatment of simulated petroleum contaminated soil by Fenton oxidation-microbial method. The high-throughput sequencing results showed that Rhodanobacter sp.，Mycobacterium sp. and Rhizobiales sp. were the dominant bacteria. The experimental results indicated that：After 50 d of degradation，the removal rate of total petroleum hydrocarbon（TPH）in the soil samples by mixed bacteria was 13.4-20.5 percentage points higher than that by native bacteria；When the TPH content（w）were 4%，8%，11%，the optimum H2O2concentration for Fenton oxidation were 3，4，4 mol/L respectively（with 0.04 mol/L of Fe2+concentration），the total removal rate of TPH were 88.8%，65.0%，47.7% respectively，which were much higher than those by single Fenton oxidation or single microbial method. The degradation time was shortened and organic matters in soil were increased by the combined process.

specific mixed petroleum-degrading bacteria；Fenton oxidation；microbial method；petroleum hydrocarbon

X53

A

1006-1878（2017）02-0237-06

10.3969/j.issn.1006-1878.2017.02.020

2016 - 06 - 16；

2016 - 11 - 24。

韓旭（1992—），男，山東省棗莊市人，碩士生，電話 18613655180，電郵 hanxu920608@cumt.edu.cn。聯(lián)系人：王麗萍，電話 13952118180，電郵 wlpcumt@126.com。

國家自然科學(xué)基金項目（41472223）。