史冬趙建玉閆振宇李璽

(南陽(yáng)市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473000)

NF-κB調(diào)節(jié)TNF-α表達(dá)減輕大鼠缺血性腦血管病腦組織損傷

史 冬 趙建玉閆振宇1李 璽

(南陽(yáng)市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473000)

目的 研究缺血性腦血管病(ICVD)核因子 (NF)-κB對(duì)腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)的影響及其對(duì)大鼠腦組織損傷的作用。方法 將48只Wistar大鼠隨機(jī)分成正常組(12只)、模型組(12只)、假手術(shù)組(12只)和吡咯烷二硫基甲酸酯(PDTC)+模型組，每組12只。采用線栓法制成大鼠局部缺血再灌注模型，用Ludmila Belayev 12分評(píng)分法評(píng)估大鼠神經(jīng)功能，氯化-2，3，5-三苯基四氮唑(TTC)染色法觀察腦梗死體積，免疫組化法檢測(cè)腦組織NF-κB表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)腦組織TNF-α含量。結(jié)果 模型組大鼠Ludmila Belayev 12得分明顯高于正常組與假手術(shù)組(P<0.05)，PDTC+模型組得分顯著低于模型組(P<0.01)；模型組大鼠的腦梗死體積顯著多于正常組和假手術(shù)組(P<0.01)，與模型組比較，PDTC+模型組大鼠腦梗死體積顯著減少(P<0.05)；模型組大鼠腦組織NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率顯著高于正常組和假手術(shù)組(P<0.05)，DPTC+模型組NF-κB表達(dá)明顯低于模型組 (P<0.05)；模型組大鼠TNF-α的含量顯著高于正常組和假手術(shù)組(P<0.01)，PDTC+模型組TNF-α含量明顯低于模型組(P<0.05)。結(jié)論 PDTC抑制NF-κB活性可以減少TNF-α含量，降低TNF-α的表達(dá)，所以可通過(guò)NF-κB調(diào)節(jié)TNF-α表達(dá)對(duì)缺血再灌注腦損傷起到保護(hù)作用，可能與其抑制炎癥反應(yīng)作用有關(guān)。

缺血性腦血管病；腦損傷；核因子-κB；腫瘤壞死因子α

腦血管疾病(CVD)是因?yàn)楦鞣N腦血管病變引起的腦部病變，多發(fā)生于中老年人，特別是伴有高血壓、冠心病、腦卒中病史的人群，以缺血性腦血管病(ICVD)為主，容易致殘、致死，威脅患者的生命〔1〕。大腦發(fā)生缺血時(shí)核因子(NF)-κB可被活化，活化的NF-κB可調(diào)控如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β等物質(zhì)表達(dá)增加而引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織損傷。本文旨在探討NF-κB活性對(duì)TNF-α表達(dá)的影響及其對(duì)ICVD腦組織損傷的保護(hù)作用。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)Wistar大鼠48只，雄性，體重(250±10)g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：0045071)，飼養(yǎng)在安靜清潔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度(24±2)℃，自然光照12 h，6只/籠，自由攝水及進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑和儀器 TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)、水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，一抗二抗免疫組化試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，氯化-2，3，5-三苯基四氮唑(TTC) (美國(guó)SIGMA，批號(hào)T8877)，WD-2102A自動(dòng)酶標(biāo)儀(北京六一儀器廠)，MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，BX5/TF顯微鏡(日本Olympus)，大鼠手術(shù)器械包括手術(shù)刀、無(wú)菌鑷、止血夾、眼科剪、縫合針、縫合線等。

1.3 動(dòng)物分組及處理 48只大鼠在籠中飼養(yǎng)5 d以適應(yīng)環(huán)境，隨機(jī)分成正常組、模型組、假手術(shù)組、吡咯烷二硫基甲酸酯(PDTC)+模型組，每組12只。正常組常規(guī)喂養(yǎng)，模型組術(shù)前禁食12 h，按改良后線栓法制作大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，再參照Ludmila Belayev 12分評(píng)分法做行為學(xué)評(píng)分以剔除不符合條件的動(dòng)物，假手術(shù)組除不插入栓線外，其余操作均與模型組相同，PDTC+模型組在造模前15 min給予腹腔注射PDTC 15 mg/kg，150 mg/ml。

1.4 線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型〔2〕10%水合氯醛30 mg/kg經(jīng)腹腔麻醉，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)，頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈并分離出頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，動(dòng)脈夾阻斷頸總動(dòng)脈，于頸外動(dòng)脈殘端剪一開(kāi)口插入栓線，輕緩?fù)苿?dòng)尼龍線尾端，于頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈分叉部沿頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，推入大約18.0 mm至大腦中動(dòng)脈，遇到阻力即止。取出動(dòng)脈夾，結(jié)扎頸總動(dòng)脈分叉處并縫合皮膚。90 min后，再次麻醉大鼠，向外輕拉尼龍線，恢復(fù)大腦中動(dòng)脈血供，完成再灌注。

1.5 Ludmila Belayev 12分評(píng)分法〔3〕(1)提尾懸空試驗(yàn)，即姿勢(shì)反射測(cè)驗(yàn)：0分表示無(wú)明顯神經(jīng)功能缺失，1分表示梗死對(duì)側(cè)肢體屈曲，2分表示側(cè)推試驗(yàn)陽(yáng)性。(2)肢體放置試驗(yàn)：①視覺(jué)亞實(shí)驗(yàn)，即前言刺激實(shí)驗(yàn)：操作者將大鼠握于手中，使其前爪懸空，自桌面上方10厘米處沿斜線緩慢靠近桌面，正常大鼠的反應(yīng)為前爪抓向桌面，損傷的大鼠則出現(xiàn)肢體反應(yīng)遲鈍。0分表示大鼠肢體放置反應(yīng)正常，1分表示反應(yīng)延遲但<2 s，2分表示反應(yīng)延遲并>2 s。側(cè)方刺激實(shí)驗(yàn)：操作者讓大鼠位于桌子側(cè)方，檢測(cè)方法及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)與前方刺激相同。②觸覺(jué)亞實(shí)驗(yàn)，遮住大鼠雙眼，使其前爪懸空，用大鼠前爪背側(cè)輕觸桌面，刺激深度僅限皮膚與毛發(fā)，大鼠反應(yīng)及評(píng)分與視覺(jué)亞實(shí)驗(yàn)相同，觸覺(jué)刺激同樣包括前方和側(cè)方刺激。③本體覺(jué)亞實(shí)驗(yàn)：該實(shí)驗(yàn)操作及評(píng)分與觸覺(jué)亞實(shí)驗(yàn)相同，只是本體覺(jué)亞實(shí)驗(yàn)給予大鼠前爪較大壓力，刺激深達(dá)肌肉和關(guān)節(jié)。該亞實(shí)驗(yàn)只有前方刺激，動(dòng)物前肢放置實(shí)驗(yàn)得分為0～10分。與視覺(jué)亞實(shí)驗(yàn)結(jié)合后兩部分實(shí)驗(yàn)得分范圍為0～12分，大鼠功能損傷越重得分越高。

1.6 大鼠腦梗死體積檢測(cè)〔4〕成功造模24 h后用1%戊巴比妥鈉麻醉狀態(tài)下迅速斷頭取腦，摘除小腦、低位腦干及嗅球，大腦組織于冰箱-20℃保存20 min后取出，連續(xù)冠狀切片6片，厚5 mm，以2%TTC磷酸緩沖液37℃，恒溫避光孵育20 min，期間腦片翻動(dòng)頻率為1次/5 min。TTC染色后，正常大鼠腦組織呈紅色，梗死區(qū)呈白色，將腦片固定于4%多聚甲醛30 min，拍照后用Image-pro plus6.0圖像分析軟件分析，按公式計(jì)算腦梗死體積，結(jié)果以腦梗死體積百分比表示〔5〕，腦梗死體積百分比=腦梗死體積/患側(cè)總體積×100%。

1.7 免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織NF-κB表達(dá)〔6〕取腦組織固定于4%多聚甲醛60 min，脫水，蠟塊包埋，切片，置于58℃烤箱1 h抗原熱修復(fù)，脫蠟、水化，3%雙氧水孵育10 min，洗片3次，試劑A于室溫下孵育10～15 min，倒除工作液，一抗用PBS 1∶80稀釋后滴于切片，濕盒中37℃孵育2～3 h，再置于室溫30 min，PBS浸洗3次，每次3 min，滴加試劑B和試劑C，室溫孵育15 min，PBS浸洗3次，每次3 min，DAB顯色，沖洗，蘇木素復(fù)染，沖洗，脫水，風(fēng)干，樹(shù)膠封片，于BX5/TF顯微鏡下觀察并拍照(10×40倍)，每個(gè)切片取5個(gè)視野，以MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)定量分析，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率(%)=陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 ELISA法測(cè)腦組織TNF-α含量 取腦方法同前，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，加入相應(yīng)體積裂解液并勻漿，離心30 min后取上清檢測(cè)，計(jì)算平均OD值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS12.0軟件行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠缺血再灌注后Ludmila Belayev 12評(píng)分結(jié)果、腦梗死體積百分比 線栓法制作大鼠缺血再灌注模型后，模型組大鼠Ludmila Belayev 12得分〔(6.61±0.53)分〕明顯高于正常組與假手術(shù)組(均為0分)(P<0.05)，PDTC+模型組得分〔(2.20±0.61)分〕顯著低于模型組(P<0.01)；模型組大鼠的腦梗死體積〔(69.12±4.18)%〕顯著多于正常組和假手術(shù)組(均為0)(P<0.01)，與模型組比較，PDTC+模型組大鼠腦梗死體積〔(27.25±1.43)%〕顯著減少(P<0.05)。

2.2 大鼠腦組織NF-κB表達(dá)和TNF-α含量 激活的NF-κB從胞質(zhì)進(jìn)入胞核內(nèi)呈棕黃色，模型組大鼠腦組織NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率〔(56.27±1.08)%〕顯著高于正常組〔(6.01±0.51)%〕和假手術(shù)組〔(10.13±0.32)%〕(P<0.05)，PDTC+模型組NF-ΚB表達(dá)〔(28.86±0.19)%〕明顯低于模型組(P<0.05)。ELISA法顯示：模型組大鼠TNF-α的含量(58.61±1.59)顯著高于正常組(31.06±1.42)和假手術(shù)組(24.95±1.34)(P<0.01)，PDTC+模型組TNF-α含量(35.20±1.63)明顯低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織NF-κB表達(dá)(×400)

3 討 論

ICVD指腦動(dòng)脈狹窄或閉塞引起相應(yīng)部位腦組織缺血缺氧甚至壞死，腦缺血將誘發(fā)膜脂質(zhì)降解、氧化應(yīng)激、離子超載、炎癥反應(yīng)、DNA損傷等病理生理改變并發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔7〕，造成神經(jīng)損傷〔8〕。本研究選用對(duì)生理指標(biāo)影響不大的線栓法建立缺血性腦血管病大鼠模型，結(jié)果顯示大腦中動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致大鼠腦組織缺血、功能受損，表現(xiàn)出預(yù)期的行為學(xué)癥狀和病理學(xué)改變，提示模型建立成功。

現(xiàn)有資料表明，腦細(xì)胞代謝障礙、炎癥反應(yīng)、自由基損傷等是ICVD的重要損傷機(jī)制〔9〕，炎癥細(xì)胞和炎癥因子在腦缺血損傷過(guò)程中地位和作用越來(lái)越受到重視。NF-κB對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，可能通過(guò)以下方式〔10〕：①促進(jìn)神經(jīng)元凋亡抑制蛋白(IAP)表達(dá)，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)鈣結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄，保護(hù)神經(jīng)元；②抑制谷氨酸受體亞單位表達(dá)；③誘導(dǎo)超氧化物歧化酶轉(zhuǎn)錄；④參與TNF-α抗凋亡作用，TNF-α通過(guò)NF-κB活化從而調(diào)控Bcl-2和Bcl-x的表達(dá)實(shí)現(xiàn)抗凋亡。但細(xì)胞受到氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子、內(nèi)毒素等刺激時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)NF-κB活化，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)可激活多種促炎基因的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)TNF-α、白細(xì)胞介素(IL)-8、黏附分子(ICAM)-1等多種炎癥因子的表達(dá)，作為腦缺血后炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)因素調(diào)控著炎癥反應(yīng)的發(fā)生與進(jìn)展〔11，12〕；同時(shí)這些炎癥因子又會(huì)激活NF-κB，后者將使TNF-α、IL-1β等大量表達(dá)，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或死亡，形成惡性循環(huán)〔13〕?？赡芤?yàn)榇竽X缺血導(dǎo)致大量炎癥因子、活性氧流入，激活NF-κB，誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)等從而參與大腦缺血損傷，又因?yàn)門(mén)NF-α的增多而導(dǎo)致NF-κB表達(dá)進(jìn)一步增加，放大炎癥反應(yīng)，如此循環(huán)加重腦組織損傷。黃小平等〔14〕證實(shí)黃芪和三七可以抑制小鼠缺血再灌注模型腦組織NF-κB信號(hào)通路的激活，減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達(dá)，減輕腦組織的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)腦組織；鄧冰湘等〔15〕亦報(bào)道一些藥物可通過(guò)抑制NF-κB，下調(diào)TNF-α等轉(zhuǎn)錄水平，從而抑制炎癥反應(yīng)，最終發(fā)揮抗炎和保護(hù)腦細(xì)胞作用；朱曉瓞等〔16〕認(rèn)為還可以通過(guò)NF-κB通路來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞凋亡?？寡趸瘎㏄DTC是NF-κB的活化抑制劑，通過(guò)抑制NF-κB的活性有效抑制腦組織TNF-α的表達(dá)，其阻斷炎癥惡性循環(huán)，干預(yù)腦缺血的病理過(guò)程，從而減輕腦缺血再灌注損傷〔17〕，實(shí)現(xiàn)保護(hù)腦組織。

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〔2016-08-31修回〕

(編輯 郭 菁)

史 冬(1971-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科腦血管病方面的研究。

R743

A

1005-9202(2017)10-2403-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.023

1 南陽(yáng)市中心醫(yī)院病理科