杜國(guó)華 王宏旭 劉子良

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所藥理室 新藥作用機(jī)制研究與藥效評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

姜黃素治療帕金森病的機(jī)制

杜國(guó)華 王宏旭 劉子良

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所藥理室 新藥作用機(jī)制研究與藥效評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

目的 研究姜黃素治療帕金森病(PD)的作用機(jī)制。方法 采用MPTP誘發(fā)小鼠亞急性PD模型，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究鑒定出小鼠中腦差異蛋白，發(fā)現(xiàn)姜黃素的作用靶點(diǎn)，并采用Western印跡進(jìn)行驗(yàn)證。用脂多糖刺激C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞研究蛋白的表達(dá)。結(jié)果 在MPTP誘發(fā)的小鼠PD模型中，蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定出星形膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)高表達(dá)，姜黃素給藥可以下調(diào)GFAP的表達(dá)，Western印跡驗(yàn)證GFAP的表達(dá)與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。在脂多糖刺激的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GFAP的表達(dá)明顯升高，姜黃素給藥后可以降低GFAP的表達(dá)。結(jié)論 星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與PD發(fā)病，姜黃素可通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活產(chǎn)生抗感染作用，進(jìn)而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

帕金森??；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；姜黃素；神經(jīng)炎癥

帕金森病(PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，主要病理改變?yōu)榛颊吆谫|(zhì)致密體部位多巴胺能神經(jīng)元變性，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺含量顯著降低，從而產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)障礙。PD的發(fā)病原因很多，其中由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活引起神經(jīng)炎癥在PD發(fā)病過(guò)程中起重要作用〔1〕。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞特有的中間絲成分，除了維持細(xì)胞正常形態(tài)功能之外，還參與多種病理過(guò)程，如神經(jīng)退行性病、腦外傷、腦卒中、癲癇等。GFAP在星形膠質(zhì)細(xì)胞激活后表達(dá)明顯升高，因此GFAP常被用作星形膠質(zhì)細(xì)胞活性狀態(tài)的一種標(biāo)志〔2〕。姜黃素具有抗氧化、抗感染、抗癌、清除自由基等多種藥理活性。近年研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)神經(jīng)退行性疾病有治療作用，可能與其抑制神經(jīng)炎癥有密切的關(guān)系〔3〕。但是姜黃素通過(guò)何種途徑抑制炎癥反應(yīng)尚不十分明確。本文通過(guò)蛋白質(zhì)學(xué)研究尋找姜黃素給藥后對(duì)MPTP誘發(fā)的PD模型小鼠腦內(nèi)差異蛋白并進(jìn)行驗(yàn)證，從炎癥角度闡明姜黃素對(duì)PD的治療作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 姜黃素和所有進(jìn)口試劑均購(gòu)于美國(guó)Sigma和Promega公司；固相pH梯度干膠條(18 cm，linear，pH3～10)、IPG緩沖液(pH3～10)均購(gòu)自Amersham Pharmacia Biotech公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。所有溶液均用Milli Q水配制。雄性C57小鼠，體重23～25 g，購(gòu)于維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中所有操作均遵循北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定。C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞購(gòu)自協(xié)和細(xì)胞中心。Ettan IPGphor3等電聚焦儀、Ettan DALTsix垂直電泳槽、ImageScanner Ⅲ掃描儀(美國(guó)GE公司)；MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)；高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)GE公司)；化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(美國(guó)GE公司)。

1.2 PD模型的建立和給藥 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、PD模型組、姜黃素組，每組20只。MPTP(Sigma)溶于生理鹽水，30 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)5 d。姜黃素100 mg/kg于MPTP注射前1 h灌胃給藥，在MPTP停止注射后繼續(xù)給藥7 d。對(duì)照組腹腔注射相同量的生理鹽水。

1.3 小鼠中腦蛋白樣品的制備和雙向凝膠電脈(2-DE)分離 小鼠斷頭取腦，冰上分離中腦，用非變性裂解液提取中腦總蛋白，考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行蛋白定量。按照操作指南將制得的蛋白樣品進(jìn)行分離，然后考馬斯亮藍(lán)染色，脫色，采用LabScan6.01軟件控制的ImageScannerⅢ掃描儀掃描，得到對(duì)照組、PD組和姜黃素組的圖譜。

1.4 質(zhì)譜鑒定 切取2-DE凝膠上的GFAP蛋白質(zhì)點(diǎn)置于Eppendorf管進(jìn)行膠內(nèi)酶切，經(jīng)過(guò)脫色、還原、烷基化、酶解等步驟的處理獲得樣品，將制備好的樣品與基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-CHCA)混勻點(diǎn)樣，于ABI 4800 plus MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)肽質(zhì)量指紋譜的分析及鑒定。采用反射模式(800～4 000)、正離子譜測(cè)定，獲取一級(jí)質(zhì)譜圖。質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加50次，并用基質(zhì)峰和胰蛋白酶自動(dòng)降解離子峰作為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜峰，以多肽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(ABI公司)為外標(biāo)進(jìn)行校正。對(duì)一級(jí)質(zhì)譜獲得的高豐度肽段進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，用Mascot軟件進(jìn)行肽段鑒定，選擇Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索。

1.5 Western印跡檢測(cè)中腦GFAP蛋白的表達(dá) 小鼠中腦用非變性裂解液勻漿。勻漿液離心后煮沸5 min。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)移上蛋白的PVDF膜在5%的TBST配制的脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，室溫下與TBST稀釋的一抗孵育2 h，用TBST洗3遍。然后在TBST稀釋的辣根過(guò)氧化酶耦聯(lián)的二抗中孵育1.5 h，洗3遍后，在LAS4000化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)，Gel-Pro Analyzer 4.0分析條帶灰度。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)和給藥 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞以DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)加入終濃度為2.5%滅活的胎牛血清和15%的馬血清。在37℃，5%CO2/95%空氣，100%相對(duì)濕度下生長(zhǎng)。細(xì)胞每隔2～3 d傳代一次，培養(yǎng)24～36 h后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。所用的消化液為0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA(溶于Dulbecco溶液中)。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以3×103個(gè)/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后加姜黃素10 μmol/L，1 h后加脂多糖(LPS)500 ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行下面的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.7 GFAP熒光標(biāo)記檢測(cè) C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)LPS刺激和與姜黃素共孵育后，細(xì)胞以4%的多聚甲醛固定15 min，然后用0.1%Triton-PBS透化，3%羊血清封閉1 h，加GFAP一抗(1∶100)共孵育4℃過(guò)夜，加FITC標(biāo)記的熒光二抗(1∶200)室溫孵育2 h，采用高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)Analyzer1000觀察藥物刺激后GFAP蛋白的表達(dá)，并采集圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩組間比較行LSD-SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠中腦差異蛋白表達(dá)和蛋白鑒定 圖1所示為對(duì)照組、PD組、姜黃素組2-DE蛋白表達(dá)圖。采用ImageMaster6.01軟件對(duì)凝膠進(jìn)行強(qiáng)度校正、點(diǎn)檢測(cè)、背景消減和匹配等分析，發(fā)現(xiàn)一些差異蛋白，切取差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，圖1中圈出的蛋白質(zhì)點(diǎn)一級(jí)質(zhì)譜分析獲得的肽質(zhì)量指紋圖(PMF)如圖2。將PMF數(shù)據(jù)通過(guò)Mascot軟件查詢SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)。查詢條件為：肽片段分子質(zhì)量最大容許誤差控制在±0.02 D，選擇胰酶，酶解片段不完全選擇為1個(gè)，物種來(lái)源選擇鼠，離子選擇〔M+H〕+，固定修飾選擇脲甲基半胱氨酸。初步確定該蛋白質(zhì)為GFAP。對(duì)一級(jí)質(zhì)譜獲得的高豐度肽段，如m/z1 296.711 4，m/z1 539.817 5和m/z1 475.780 6進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，用Mascot軟件進(jìn)行肽段鑒定，選擇Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，進(jìn)一步確認(rèn)該蛋白質(zhì)為GFAP(分子量49 927.5 kD，蛋白代碼P03995，pI 5.27)。表1為應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和PMF聯(lián)合檢索的結(jié)果。基于以上確認(rèn)，圖1中蛋白質(zhì)點(diǎn)為GFAP。軟件分析2-DE圖譜可知，動(dòng)物水平GFAP蛋白表達(dá)的變化為：PD模型組高于對(duì)照組，姜黃素組低于PD模型組。以上結(jié)果表明炎癥參與MPTP誘發(fā)PD模型的機(jī)制中，表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，即GFAP蛋白表達(dá)升高。姜黃素可通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化而抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元。

圖1 小鼠中腦蛋白的2-DE圖譜

圖2 GFAP的質(zhì)譜鑒定

組別肽段數(shù)得分置信度(CI%)總離子得分總離子得分CI%序列覆蓋率(%)對(duì)照組580999846910012PD模型組56699565559997312姜黃素組78199988639999617

2.2 Western印跡驗(yàn)證GFAP蛋白的表達(dá) PD模型組小鼠中腦GFAP表達(dá)(0.67±0.07)與對(duì)照組相比明顯升高(0.28±0.04，P<0.01)，給予小鼠姜黃素可顯著降低GFAP的表達(dá)(0.36±0.03,P<0.01)，見(jiàn)圖3，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。

2.3 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞GFAP蛋白表達(dá)的變化 LPS刺激后GFAP表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增加，給予姜黃素后可明顯降低GFAP的表達(dá)，表明該藥可抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的激活而抑制炎癥反應(yīng)，見(jiàn)圖4。

圖3 Western印跡驗(yàn)證各組GFAP的表達(dá)

圖4 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞GFAP的高內(nèi)涵觀察圖像(FITC，×200)

3 討 論

膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的炎癥在PD的發(fā)病中起著重要作用〔4〕。PD患者和動(dòng)物模型中腦黑質(zhì)部位存在不同程度的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活〔5，6〕，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可誘導(dǎo)CD23的表達(dá)，后者進(jìn)一步激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)產(chǎn)生NO，引起炎癥反應(yīng)，從而損傷多巴胺能神經(jīng)元〔7〕，造成多巴胺能神經(jīng)元大量丟失。目前已上市治療PD的藥物，如L-多巴只能是改善癥狀，不能阻止疾病的進(jìn)程。而姜黃素是從姜科植物中提取的一種多酚類物質(zhì)，具有抗氧化〔8〕、抗感染〔8〕、抗癌、清除自由基等多種藥理活性。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)〔9，10〕，其中抗感染作用有與抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB的活性密切相關(guān)〔11〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦缺血、神經(jīng)退行性疾病〔3〕中都有保護(hù)作用，可能與其抑制神經(jīng)炎癥有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)MPTP誘發(fā)的PD模型中腦內(nèi)有炎癥反應(yīng)的參與〔12〕。姜黃素可抑制炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α的產(chǎn)生，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而減輕多巴胺能神經(jīng)元的損傷〔13〕。但是姜黃素抑制膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)炎癥的靶點(diǎn)尚不明確，本研究表明姜黃素可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，這與GFAP在腦損傷和PD疾病中表達(dá)上調(diào)等文獻(xiàn)報(bào)道一致〔13，14〕。姜黃素能夠抑制GFAP的表達(dá)，表明姜黃素具有明顯抑制炎癥的作用。

綜上所述，GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化標(biāo)志物，它的高表達(dá)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。姜黃素可抑制GFAP的表達(dá)而抑制炎癥反應(yīng)，因此姜黃素是一種有效的神經(jīng)保護(hù)劑，有希望用于治療神經(jīng)退行性疾病。然而，神經(jīng)退行性疾病往往涉及多種復(fù)雜機(jī)制，因此，姜黃素是否還通過(guò)其他生物分子或信號(hào)網(wǎng)絡(luò)而對(duì)神經(jīng)退行性疾病有效，仍需要更多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)深入研究。

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〔2015-12-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

杜國(guó)華(1967-)，女，副研究員，博士，主要從事蛋白質(zhì)和生物信息學(xué)研究。

R742.5

A

1005-9202(2017)10-2387-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.017