馬婷婷 王學(xué)艷 潘 磊 史建全 石 峰 毛澤斌 王秋楓

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，北京 100038)

過氧化物酶體增殖因子活化受體γ在大鼠慢性阻塞性肺疾病模型中的表達(dá)及意義

馬婷婷 王學(xué)艷 潘 磊 史建全1石 峰 毛澤斌2王秋楓3

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，北京 100038)

目的 研究過氧化物酶體增殖因子活化受體(PPAR)γ在大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型中的表達(dá)及意義。方法 SD大鼠24只，隨機(jī)分為對照組(A組)和實(shí)驗(yàn)5 w組(B組)和實(shí)驗(yàn)10 w組(C組)，每組8只。實(shí)驗(yàn)組采用氣管內(nèi)注入胰蛋白酶和熏香煙的方法，建立大鼠COPD模型。從開始實(shí)驗(yàn)起，實(shí)驗(yàn)第5周處死實(shí)驗(yàn)B組；第10周處死C組。應(yīng)用病理學(xué)及肺功能檢查評價(jià)COPD動物模型，免疫組化RT-PCR和Western印跡方法檢測大鼠肺組織PPARγ mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 B組與A組比較，炎癥反應(yīng)明顯，已形成慢性阻塞性肺氣腫，并于第10周形成明顯的肺氣腫。PPARγ在正常肺組織與患慢性阻塞性肺氣腫的肺組織均有表達(dá)，主要定位在炎性浸潤細(xì)胞的核和核周圍區(qū)，比較大鼠肺組織PPARγ在COPD中的表達(dá)(吸光度值A(chǔ)值)：A組為0.497±0.078，B組PPARγ在肺組織中表達(dá)減弱(0.329±0.024)，C組PPARγ在肺組織中表達(dá)明顯減弱(0.216±0.049)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PPARγ mRNA表達(dá)隨著COPD病程的進(jìn)展逐漸降低，A組光密度比值為(1.06 ±0.10)；B組為(0.50 ±0.02)；C組為(0.27 ±0.02)，與A組比較，B、C組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。Western印跡也表明COPD模型B組和C組比A組PPARγ蛋白表達(dá)降低，且B組蛋白表達(dá)降低的更為明顯。結(jié)論 PPARγ在COPD的發(fā)生及進(jìn)展中起重要作用，并且隨著病程的發(fā)展，蛋白表達(dá)降低更為顯著，因此該蛋白有望成為未來COPD治療的新靶點(diǎn)。

慢性阻塞性肺疾?。贿^氧化物酶體增殖因子活化受體γ;炎癥

過氧化物酶體增殖因子活化(PPAR)γ是核激素受體超家族中的一員，為一種配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)節(jié)生殖、代謝、生長和免疫反應(yīng)的基因表達(dá)在脂肪細(xì)胞分化和糖代謝中起重要的調(diào)節(jié)作用〔1～3〕。近來研究發(fā)現(xiàn)，人氣道上皮、平滑肌及肺上皮細(xì)胞都有PPARγ表達(dá)〔4〕，在多種疾病中如慢性阻塞性肺氣腫、哮喘、慢性支氣管炎、囊性肺纖維化、支氣管擴(kuò)張、肺損傷、感染以及肺癌等〔5，6〕肺疾病均都發(fā)揮作用。隨著PPARγ在肺組織抗增生、抗感染效應(yīng)的備受重視，PPARγ在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的調(diào)節(jié)作用也越來越受到重視。為了解PPARγ對COPD發(fā)展過程中的調(diào)控作用，本研究通過以SD大鼠COPD模型為研究對象檢測PPARγ在大鼠慢性阻塞性肺氣腫中肺組織不同時(shí)間段的PPARγ蛋白的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立 雄性二級SD大鼠(北京動物試驗(yàn)中心提供)24只，鼠齡8周齡，體重150～170 g。將動物隨機(jī)分為3組：對照組(A組)，實(shí)驗(yàn)5 w組(B組)，實(shí)驗(yàn)10 w組(C組)，每組8只。采用熏煙加氣管內(nèi)注入豬胰蛋白酶法，即實(shí)驗(yàn)第1，14天經(jīng)氣管內(nèi)注入豬胰蛋白酶(PPE Amresco公司)(0.5 mg/kg)，次日將大鼠置于80 cm×60 cm×50 cm大小的有機(jī)玻璃熏箱內(nèi)被動吸煙，每日熏煙1次，每次25支香煙(都寶牌香煙，由安徽蕪湖卷煙廠出品)，時(shí)間持續(xù)1 h。A組采用氣管內(nèi)注入生理鹽水，二級動物房內(nèi)正常飼養(yǎng)。第5周及第10周處死動物前用實(shí)驗(yàn)動物肺功能儀(北京悅宏達(dá)有限責(zé)任公司產(chǎn)品)測定肺功能，測定分鐘通氣量(MVV)、吸氣阻力(Ri)、呼氣阻力(Re)、肺順應(yīng)性(CL)。采用外加壓力法，測定0.3 s 用力呼氣量(FEV 0.3)，取股動脈血 0.5 ml 作血?dú)夥治?。從開始實(shí)驗(yàn)起，實(shí)驗(yàn)第5周處死B組、第10周處死C組。3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，股動脈放血處死大鼠，右肺中下葉迅速放入中性10%甲醛溶液(濟(jì)南百博生物技術(shù)有限公司，500 ml/盒，國藥準(zhǔn)字1400105號)中浸泡24 h以上，石蠟包埋切片，分別作蘇木素-伊紅(HE)染色，免疫組化染色，光學(xué)顯微鏡(Leica，DM/LS型)觀察，其余的肺組織馬上放入液氮中保存。

1.2 病理學(xué)觀察 處死大鼠后，右肺中下葉迅速放入中性10%甲醛溶液中浸泡24 h以上，脫水石蠟包埋，常規(guī)5 μm切片，作HE染色。肺組織PPARγ免疫組織化學(xué)染色(SP法)。右肺組織石蠟切片，分別滴加PPARγ兔多克隆一抗(Santa Cruz，美國1∶200稀釋)，生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，最后滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，顯微鏡下二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木素復(fù)染胞核。用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)替換一抗作陰性對照。應(yīng)用多功能彩色圖像分析系統(tǒng)對PPARγ蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，胞質(zhì)內(nèi)顯顆粒，胞核為棕褐色為陽性反應(yīng)。每張切片任選5個(gè)視野，測其吸光度值(A值)，表達(dá)強(qiáng)度用積分光密度表示。

1.3 肺組織PPARγ mRNA表達(dá) 從液氮中取出50～100 mg的肺組織，采用異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法，按Trizol試劑盒(Invitrogen 公司)提取肺組織總mRNA。甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳法鑒定RNA的完整性，紫外分光法確定260 nm和280 nm波長的OD 值，計(jì)算RNA 濃度RNA的量和純度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒(NEB公司)，按產(chǎn)品說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取總的RNA 2 μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行半定量PCR反應(yīng)。利用設(shè)計(jì)軟件Oligo設(shè)計(jì)過氧化物增殖活化受體PPARγ：正義5′-GTCTCACAATGCCATCAGCTTT-3′，反義5′-GCAGGGGGGTGATATGTTTG-3′，目的片段287 bp，退火溫度60℃；內(nèi)參GAPDH：正義5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反義5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，產(chǎn)物長度465 bp，退火溫度60℃。RT-PCR反應(yīng)的條件為：50 μl體系94℃預(yù)變性2 min，94℃變性2 min，60℃30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10 min。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，掃膠儀掃膠，凝膠成像系統(tǒng)圖像分析，以目的PPARγ片段/GAPDH片段的條帶光密度比值(IOD)來比較。

1.4 Western印跡免疫雜交 從液氮里取出肺組織，用液氮研磨，用PBS洗研磨的組織，4℃離心1 min，倒掉上清，重復(fù)兩次，按照0.6 ml/1 g加入裂解液(臨用時(shí)加入苯甲磺酰氟和二甲基亞砜)，提取蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法測定提取蛋白的濃度。配制SDS-PAGE凝膠(15%分離膠，12%濃縮膠)，電泳時(shí)濃縮膠電壓100 V，分離膠電壓130 V，電泳結(jié)束后在4℃蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)移2 h至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用麗春紅染色，TBS洗3次，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，一抗兔抗鼠PPARγ抗體(Santa Cruz，美國)(1∶60稀釋)，內(nèi)參照兔抗鼠β-actin(中山公司)(1∶400稀釋)4℃封閉過夜，TBS洗3次；二抗羊抗兔(中山公司)(1∶4 000稀釋)封閉2 h，TBS洗3次，顯影，X線片曝光，凝膠成像系統(tǒng)圖像分析，PPARγ蛋白相對表達(dá)量及其特異性結(jié)合條帶與β-actin結(jié)合條帶的光密度比值來表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 A組大鼠強(qiáng)壯肥碩，活潑好動，皮毛光澤發(fā)亮，呼吸平穩(wěn)，體重逐漸增加。B組表現(xiàn)倦怠，黃澀，毛發(fā)失去光澤，體重增幅有減少趨勢，C組皮毛枯槁、黃澀，無光澤，蜷縮，活動明顯減少，體重下降，甚至出現(xiàn)喘息。

2.2 肺功能及血?dú)夥治鼋Y(jié)果 B組FEV0.3/FVC%顯著低于A組，Re和Ri顯著高于A組，PaCO2顯著高于A組，PaO2和SaO2顯著低于A組；C組FEV0.3/FVC%顯著低于A組，PaCO2顯著高于A組，PaO2和SaO2顯著低于A組(均P<0.05)，見表1。

2.3 形態(tài)學(xué)分析 與A組相比，COPD模型大鼠肺體積比對照組明顯增大，顏色蒼白，彈性減弱，肺表面略顯不平，可見小囊泡狀突起，有多少不等的肺泡融合形成大皰，表面無出血，無液體滲出。光鏡觀察：①A組除少數(shù)大鼠可見局限性輕度炎癥變化外，其余均未見異常。鏡下可見正常氣管及各級支氣管上皮纖毛豐富，排列整齊，在纖毛細(xì)胞間夾雜有少數(shù)杯狀細(xì)胞，管壁內(nèi)有少數(shù)散在的淋巴細(xì)胞。②B組大鼠氣管及各級支氣管可見不同程度的慢性炎癥細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及單核細(xì)胞)和少量中性粒細(xì)胞浸潤。黏膜上皮可見纖毛倒伏、粘連或脫落。纖毛細(xì)胞可見變性、壞死或脫落，少數(shù)增生，個(gè)別出現(xiàn)鱗狀化生。杯狀細(xì)胞明顯增多，胞體增大，內(nèi)含豐富的黏蛋白顆粒。支氣管平滑肌增厚。管腔內(nèi)有較多的分泌物以及巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞。周邊肺組織普遍存在小葉中央型肺氣腫，表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺泡壁變薄或斷裂、肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，部分融合成肺大皰。部分周邊肺組織肺泡擴(kuò)大，呈肺泡型肺氣腫。③C組慢性炎癥細(xì)胞和大量的中性粒細(xì)胞浸潤，支氣管平滑肌增厚明顯，肺泡壁變薄或斷裂、肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，大部分合成肺大泡，形成嚴(yán)重的肺氣腫，見圖1。

表1 各組肺功能血?dú)鉁y定結(jié)果

與A組比較：1)P<0.01

圖1 各組肺組織病理學(xué)HE染色(×100)

2.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 A組可見大量PPARγ陽性細(xì)胞，以核著色為主，為棕色且色深，胞質(zhì)著色極少，腺體陽性細(xì)胞較多。B組可見PPARγ陽性細(xì)胞很少，而且核棕色偏淺淡，PPARγ在肺組織中表達(dá)減弱(0.329±0.024)，與A組比較(0.497±0.078)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。C組可見PPARγ陽性細(xì)胞極少，核棕色淺淡，PPARγ在肺組織中表達(dá)明顯減弱(0.216±0.049)，與A組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

2.5 肺組織PPARγ mRNA表達(dá) 與A組比較，B組PPARγ mRNA表達(dá)(0.50±0.02)明顯低于A組(1.06±0.10)(P=0.000)，C組PPARγ mRNA表達(dá)(0.27±0.02)明顯低于A組(P=0.000)，見圖3。

2.6 Western印跡結(jié)果 與A組肺組織中PPARγ蛋白表達(dá)(0.645±0.006)比較，B組肺組織中PPARγ蛋白表達(dá)(0.329±0.011)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；C組肺組織中PPARγ蛋白表達(dá)(0.229±0.009)明顯減弱，與A組及B組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.001)，見圖4。

圖2 各組大鼠肺組織PPARγ表達(dá)(DAB，×100)

圖3 各組大鼠肺組織PPARγ mRNA的表達(dá)

圖4 Western印跡檢查PPARγ蛋白表達(dá)

3 討 論

PPARγ屬核激素受體超家族成員，與炎癥及細(xì)胞周期密切相關(guān)，它與配基相結(jié)合后被活化，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控多種基因〔7～11〕。隨著研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn) PPARs 的作用非常廣泛〔12～15〕，PPARγ主要分布于分解代謝活躍的器官，如肝、心、腎、肌肉中，近來研究發(fā)現(xiàn)，人氣道上皮支氣管黏膜下層和肺上皮細(xì)胞都有PPARγ表達(dá)〔16，17〕，具有抗iNOS、IL-8等前炎癥因子效應(yīng)，PPARγ在多種組織器官中的抗增生、抗炎癥效應(yīng)備受重視，已有學(xué)者認(rèn)為PPARγ與COPD有關(guān)〔18〕，因?yàn)镃OPD具有慢性支氣管炎和阻塞性肺氣腫的特點(diǎn)，它的病理生理過程中有多種炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥介質(zhì)的釋放，同時(shí)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，它們能與相應(yīng)的細(xì)胞表面受體結(jié)合，在局部產(chǎn)生生物效應(yīng)〔19〕。PPARγ在COPD發(fā)展過程中的調(diào)控作用還不是十分明了，存在爭議。本研究結(jié)果表明在COPD的早期，PPARγ在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生顯著性改變，而PPARγ蛋白的變化則相對較晚，可見PPARγ在COPD的發(fā)病和進(jìn)展中起重要的調(diào)節(jié)作用，PPARγ的表達(dá)下降將導(dǎo)致局部抑制炎癥作用減弱，使局部炎癥反應(yīng)擴(kuò)大。因此加重COPD 病程，它在COPD組織上的早期表達(dá)，不僅將為未來COPD的早期診斷提供新的可靠指標(biāo)，而且將為未來COPD的治療提供新的途徑，可作為診斷COPD嚴(yán)重程度的重要診斷指標(biāo)。

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〔2015-12-03修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

王秋楓(1966-)，男，碩士，主要從事慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等呼吸道疾病研究。 毛澤斌(1966-)，男，博士，主要從事分子生物學(xué)研究。

馬婷婷(1979-)，女，博士，主要從事慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、肺動脈高壓及過敏相關(guān)性疾病研究。

R563.9

A

1005-9202(2017)10-2379-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.014

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室

2 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)系

3 內(nèi)蒙古電力中心醫(yī)院 包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院