梁 軍 劉安民 葛洪醒 周 峰 金 濤 羅 丹

(荊門(mén)市第二人民醫(yī)院骨科，湖北 荊門(mén) 448000)

復(fù)方接骨中藥介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化

梁 軍 劉安民 葛洪醒 周 峰 金 濤 羅 丹

(荊門(mén)市第二人民醫(yī)院骨科，湖北 荊門(mén) 448000)

目的 探討復(fù)方接骨中藥介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖及成骨分化的促進(jìn)作用。方法 取健康雄性SD大鼠60只，隨機(jī)平均分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組灌喂復(fù)方接骨中藥煎劑，對(duì)照組灌喂等體積自來(lái)水，處理10 d后提取各組大鼠血清。分離BMSCs，利用體積分?jǐn)?shù)為0.1的含藥血清及非含藥血清單獨(dú)處理BMSCs 24、48、72 h及聯(lián)合10 μmol/L p38MAPK抑制劑SB203580處理BMSCs 72 h后，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖；RT-PCR及Western印跡檢測(cè)兩組血清單獨(dú)處理及聯(lián)合SB203580處理BMSCs 72 h后成骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因ALP、BGP、BMP-2的表達(dá)；Western印跡檢測(cè)兩組血清處理BMSCs 72 h p38蛋白表達(dá)及磷酸化。結(jié)果 含藥血清處理24、48 h，細(xì)胞OD值與非含藥血清組及對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第72小時(shí)含藥血清組細(xì)胞OD值顯著高于對(duì)照組及非含藥血清組(P<0.01)，非含藥血清組細(xì)胞OD值與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組血清處理72 h后，含藥血清處理組ALP、BGP、BMP-2表達(dá)及p38磷酸化明顯高于對(duì)照組及非含藥血清組(P<0.01)，非含藥血清組ALP、BGP、BMP-2表達(dá)及p38磷酸化與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，p38總蛋白表達(dá)三組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SB203580聯(lián)合兩組血清處理72 h后，非含藥血清+SB203580組與SB203580組細(xì)胞增殖及ALP、BGP、BMP-2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，含藥血清+SB203580組細(xì)胞增殖及ALP、BGP、BMP-2表達(dá)顯著高于SB203580組(P<0.01)，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 復(fù)方接骨中藥可能通過(guò)促進(jìn)MAPK信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs的增殖及成骨分化。

復(fù)方接骨中藥；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是存在于發(fā)育早期中胚層和外胚層的干細(xì)胞，骨髓MSCs(BMSCs)則是存在于骨髓的MSCs〔1〕。BMSCs具有多分化潛能，在個(gè)體發(fā)育成熟及組織修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，中藥許多組分體外對(duì)于BMSCs的增殖及分化具有促進(jìn)作用〔3〕。本實(shí)驗(yàn)所用藥方參照范紅旗等〔4〕的藥方成藥，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、活血止痛等作用，對(duì)骨折愈合具有促進(jìn)作用。目前復(fù)方接骨中藥促進(jìn)BMSCs增殖、分化的研究較少且機(jī)制不清。本研究通過(guò)中藥藥理學(xué)〔5〕方法獲得含藥血清作為藥物源，體外獲得BMSCs，研究復(fù)方接骨中藥對(duì)BMSCs增殖及成骨分化的影響，探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。接骨中藥組方：厚樸10 g，大黃10 g，枳殼10 g，桃仁10 g，蘇木10 g，當(dāng)歸10 g，紅花5 g，骨碎補(bǔ)15 g，川斷15 g，熟地15 g，自然銅10 g，龜板10 g，枸杞15 g，杜仲15 g。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司；蛋白酶裂解液、青鏈霉素雙抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；p38MAPK抑制劑SB203580購(gòu)自美國(guó)Gene Operation；堿性磷酸酶(ALP)單抗、骨鈣素(BGP)單抗、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2單抗、p38單抗、p-p38單抗、β-actin單抗、過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotech；噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海奧迪生物制品有限公司；PrimerScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo；倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica。

1.2 含藥血清的制備 選取60只3月齡、體重300～350 g的SD健康大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。復(fù)方中藥每天煎制后，按2.5 ml/只的量灌喂實(shí)驗(yàn)組大鼠，對(duì)照組每天灌喂等量的自來(lái)水，連續(xù)灌喂10 d。末次灌喂前1 d大鼠禁食水，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后進(jìn)行腹腔取血。大鼠腹部消毒后，打開(kāi)腹腔，找到腹主動(dòng)脈后進(jìn)行穿刺取血，每只大鼠約取7～8 ml血，2 500 r/min離心30 min取上清。上清置于56℃水浴鍋中30 min使補(bǔ)體失活，過(guò)濾除菌后置于4℃保存。

1.3 BMSCs的分離及鑒定 取1只3月齡健康雄性SD大鼠，處死后置于75%乙醇中消毒15 min，超凈臺(tái)中取出大鼠的雙側(cè)股骨和脛骨，剪掉骨兩端使骨髓腔暴露出來(lái)，使用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓直至骨為白色，收集流出液到離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，使用5 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀，細(xì)胞懸液加到5 ml 1.073 g/ml的Percoll梯度液中，4℃、500 r/min離心30 min，取中間細(xì)胞層重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度約達(dá)到80%時(shí)，0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞，按1∶2接種至新鮮培養(yǎng)基中。取第4代細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，分別加入CD29、CD45、CD11b/c、CD90抗體置于4℃避光孵育30 min，收集細(xì)胞，PBS清洗后，向沉淀中加入0.3 ml PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 MTT比色法檢測(cè)BMSCs增殖 取第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSCs，胰酶消化后收集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml，以每孔200 μl接種于96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，向含藥血清孔中加入體積分?jǐn)?shù)為0.1含藥血清的DMEM培養(yǎng)基，非含藥血清孔加入體積分?jǐn)?shù)為0.1的非含藥血清的DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h，含藥血清+SB203580組及非含藥血清+SB203580組預(yù)先加入10 μmol/L SB203580干預(yù)1 h后棄去培養(yǎng)基，分別加入體積分?jǐn)?shù)為0.1的非含藥血清及0.1的含藥血清處理72 h，SB203580組加入10 μmol/L SB203580干預(yù)1 h后加入等體積PBS處理72 h，對(duì)照組不作處理，每個(gè)梯度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，培養(yǎng)完成后取出細(xì)胞，加入150 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去上清液，加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)震蕩培養(yǎng)10 min，晶體完全溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光值。

1.5 RT-PCR檢測(cè)ALP、BGP、BMP-2的表達(dá) 取處理后各組細(xì)胞，向細(xì)胞中加入1 ml Trizol，冰上靜置30 min，細(xì)胞中加入200 μl氯仿，震蕩15s后冰上靜置3 min，離心取上清液至新離心管中，加入等體積異丙醇，震蕩30 s后-20℃放置30 min，離心取沉淀，加入1 ml無(wú)水乙醇漂洗2次，待沉淀晾干后加入20 μl無(wú)酶水溶解，微量核酸儀檢測(cè)RNA濃度。利用PrimerScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)體系，置于定量PCR儀檢測(cè)，并分析mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中蛋白表達(dá) 取處理72 h的各組細(xì)胞，離心收集沉淀，加入細(xì)胞裂解液冰上孵育30 min，離心收集上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度，制備蛋白樣品，樣品蛋白含量一致。配制蛋白膠，蛋白膠凝固后上樣，電壓80 V電泳30 min，120 V繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)跑出蛋白膠。取出蛋白膠冰浴轉(zhuǎn)膜，取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜加入5%脫脂奶粉室溫孵育3 h，分別加入ALP單抗、BGP單抗、BMP-2單抗、p38單抗、p-p38單抗作為一抗4℃孵育過(guò)夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗后加入二抗室溫孵育1 h，TBST清洗，加入化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)發(fā)光劑顯影5 min后利用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件行t檢驗(yàn)，使用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 含藥血清對(duì)BMSCs增殖的影響 非含藥血清組與對(duì)照組細(xì)胞OD值差異不大(P>0.05)，第24小時(shí)和第48小時(shí)含藥血清組OD值與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，72 h時(shí)含藥血清組細(xì)胞OD值明顯高于對(duì)照組及非含藥血清組(P<0.01)。說(shuō)明復(fù)方接骨中藥促進(jìn)BMSCs增殖。見(jiàn)圖1。

2.2 含藥血清對(duì)成骨分化的影響 mRNA表達(dá)統(tǒng)計(jì)時(shí)將對(duì)照組ALP、BGP、BMP-2 mRNA的表達(dá)均設(shè)為1，蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)時(shí)設(shè)內(nèi)參蛋白β-actin的表達(dá)為1。非含藥血清組ALP、BGP、BMP-2的mRNA表達(dá)分別為(1.052±0.123)、(1.074±0.123)、(1.101±0.172)，含藥血清組分別為(1.825±0.112)、(2.362±0.153)、(1.413±0.135);對(duì)照組ALP、BGP、BMP-2的蛋白表達(dá)分別為(0.223±0.015)、(0.329±0.021)、(0.162±0.008)，非含藥血清組分別為(0.227±0.016)、(0.334±0.022)、(0.169±0.009)，含藥血清組分別為(0.398±0.019)、(0.683±0.024)、(0.262±0.016)，非含藥血清組ALP、BGP、BMP-2的表達(dá)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，含藥血清組三者mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯升高，與對(duì)照組及非含藥血清組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

2.3 含藥血清對(duì)p38蛋白磷酸化的影響 將內(nèi)參蛋白β-actin的表達(dá)設(shè)為1。對(duì)照組p38、p-p38蛋白表達(dá)分別為(0.524±0.023)、(0.167±0.014)，非含藥血清組分別為(0.527±0.025)、(0.170±0.016)，含藥血清組分別為(0.529±0.026)、(0.318±0.017)，非含藥血清組與對(duì)照組相比未出現(xiàn)顯著性變化(P>0.05)，含藥血清組p38總蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化(P>0.05)；p-p38蛋白表達(dá)明顯升高，顯著高于對(duì)照組及非含藥血清組(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

2.4 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對(duì)p38蛋白表達(dá)及磷酸化的影響 設(shè)內(nèi)參蛋白β-actin的表達(dá)為1，對(duì)照組p38、p-p38蛋白表達(dá)分別為(0.518±0.028)、(0.182±0.026)，SB203580組為(0.516±0.027)、(0.104±0.018)，非含藥血清組+SB203580組分別為(0.520±0.029)、(0.108±0.016)，含藥血清組+SB203580組分別為(0.521±0.031)、(0.175±0.014)，4組細(xì)胞中p38總蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；非含藥血清+SB203580組和SB203580組p-p38的表達(dá)未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)，與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.01)，含藥血清組p-p38的表達(dá)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，顯著高于SB203580組(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

與對(duì)照組相比：1)P<0.01；與非含藥血清組相比：2)P<0.01圖1 兩組血清對(duì)BMSCs增殖的影響

圖2 兩組血清對(duì)ALP、BGP、BMP-2表達(dá)的影響

圖3 兩組血清對(duì)p38蛋白表達(dá)及磷酸化的影響

2.5 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對(duì)BMSCs增殖的影響 對(duì)照組、SB203580組、非含藥血清組+SB203580組、含藥血清組+SB203580組OD值分別為(0.118±0.014)、(0.061±0.012)、(0.069±0.011)、(0.102±0.009)，非含藥血清+SB203580組與SB203580組細(xì)胞OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，含藥血清+SB203580組細(xì)胞OD值顯著高于SB203580組(P<0.01)，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對(duì)成骨分化的影響 SB203580組ALP、BGP、BMP-2 的mRNA表分別為(0.428±0.032)、(0.397±0.027)、(0.221±0.018)，非含藥血清組+SB203580組ALP、BGP、BMP-2 mRNA分別為(0.436±0.033)、(0.408±0.026)、(0.230±0.017)，含藥血清組+SB203580組分別為(0.973±0.054)、(0.962±0.048)、(0.592±0.037)；對(duì)照組ALP、BGP、BMP-2 的蛋白表達(dá)分別為(0.322±0.021)、(0.454±0.032)、(0.215±0.020)，SB203580組分別為( 0.218±0.019)、( 0.234±0.026)、(0.112±0.015)，非含藥血清組+SB203580組分別為(0.220±0.021)、(0.239±0.028)、(0.115±0.016)，含藥血清組+SB203580組分別為(0.317±0.023)、(0.441±0.035)、(0.210±0.020)，非含藥血清+SB203580組與SB203580組細(xì)胞ALP、BGP、BMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，含藥血清+SB203580組細(xì)胞三種基因表達(dá)顯著高于SB203580組(P<0.01)，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

1：對(duì)照組；2：SB203580組；3：非含藥血清+SB203580組；4：含藥血清+SB203580組；下圖同圖4 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對(duì)p38蛋白表達(dá)及磷酸化的影響

圖5 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對(duì)成骨分化的影響

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)成人MBSCs仍具有分化能力，在適宜的條件下能分化成骨相關(guān)的結(jié)締組織，證實(shí)MBSCs具有成骨能力〔6〕。ALP是成骨細(xì)胞分化所必需的酶，是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物〔7〕。ALP通過(guò)水解有機(jī)酸酯為游離的磷酸根，而且能通過(guò)破壞鈣化抑制劑啟動(dòng)鈣化的發(fā)生〔8〕。ALP的活性標(biāo)志著成骨細(xì)胞的分化程度。BGP是由成熟的成骨細(xì)胞分泌的一種多肽，是成骨細(xì)胞分化的中期標(biāo)志物〔9〕。BGP含量的高低與成骨細(xì)胞的分化程度正相關(guān)。大量研究證實(shí)，BGP含量增高促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。BMP-2也是成骨細(xì)胞分化的檢測(cè)指標(biāo)，其含量的高低與成骨細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)〔10〕。BMP-2的表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞的增殖以及分化具有促進(jìn)作用〔11〕。本研究結(jié)果說(shuō)明復(fù)方接骨中藥能促進(jìn)MBSCs向成骨細(xì)胞分化。MAPK是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、炎癥反應(yīng)等具有調(diào)節(jié)作用〔12〕。MAPK信號(hào)通路包括ERK1/2、p38等，活化的MAPK通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)將外界信號(hào)傳遞給細(xì)胞核，通過(guò)作用于AIF-2、c-Myc等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、分化相關(guān)的基因表達(dá)〔13〕。有報(bào)道稱(chēng)p38MAPK信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞的分化具有促進(jìn)作用，p38蛋白的磷酸化是該通路被激活的重要過(guò)程〔14〕。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方接骨中藥血清對(duì)p38的磷酸化具有促進(jìn)作用，提示該中藥可能通過(guò)活化p38MAPK信號(hào)通路促進(jìn)MBSCs的增殖及成骨分化。蛋白酶抑制劑具有抑制蛋白激酶活性的能力，SB203580是p38MAPK的常用抑制劑，能夠透過(guò)細(xì)胞抑制p38蛋白磷酸化，進(jìn)而抑制后續(xù)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)SB203580可以有效抑制細(xì)胞中一些炎癥因子誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑〔15〕。本研究證實(shí)復(fù)方接骨中藥通過(guò)作用于p38MAPK信號(hào)通路，使p38蛋白磷酸化增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)該信號(hào)通路的活化，促進(jìn)MBSCs的增殖及成骨分化。

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〔2016-10-24修回〕

(編輯 袁左鳴)

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2004ABA208)

羅 丹(1978-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事骨疾病研究。

梁 軍(1969-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事骨疾病研究。

R681

A

1005-9202(2017)10-2360-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.007