左長鵬 王 芳 縱 靜 李芳芳 雍 輝 梁 凱 徐路紅 劉加立 錢文浩

(徐州醫(yī)科大學(xué)心血管病研究所，江蘇 徐州 221000)

·基礎(chǔ)研究·

人參皂苷Rb1對(duì)H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧的作用

左長鵬 王 芳 縱 靜1李芳芳1雍 輝 梁 凱 徐路紅1劉加立1錢文浩1

(徐州醫(yī)科大學(xué)心血管病研究所，江蘇 徐州 221000)

目的 觀察人參皂苷Rb1對(duì)H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧的作用。方法 采用人參皂苷Rb1對(duì)H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧進(jìn)行預(yù)處理，通過檢測(cè)氧化應(yīng)激、凋亡指標(biāo)觀察人參皂苷Rb1的作用。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、缺氧復(fù)氧組、缺氧復(fù)氧加人參皂苷Rb1(50、100、200 μmol/L)，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素處理后，通過蛋白電泳檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3，檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 缺氧復(fù)氧處理可使H9c2心肌細(xì)胞的ROS 和MDA 水平顯著增加，SOD 活性顯著下降，上調(diào)caspase-3的表達(dá)，增加H9c2心肌細(xì)胞的凋亡。人參皂苷Rb1預(yù)處理可減少缺氧復(fù)氧H9c2細(xì)胞MDA表達(dá)量，增加SOD活性，降低ROS水平，且人參皂苷Rb1預(yù)處理可減少缺氧復(fù)氧H9c2細(xì)胞caspase-3的表達(dá)量及凋亡細(xì)胞數(shù)量。結(jié)論 人參皂苷Rb1可降低缺氧復(fù)氧對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷及凋亡，從而對(duì)缺氧復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。

人參皂苷Rb1；缺氧復(fù)氧；氧化應(yīng)激；凋亡

目前，降低心肌缺血患者死亡率最有效的方法是通過溶栓或者機(jī)械打通閉塞血管實(shí)現(xiàn)快速灌注。然而，再灌注本身也可以損害心肌，這一過程稱為“再灌注損傷”，長時(shí)間心肌缺血以后，再灌注會(huì)引起心肌細(xì)胞凋亡、壞死以及存活心肌細(xì)胞可逆的收縮功能障礙〔1，2〕。人參皂苷Rb1主要存在于人參、三七、西洋參等植物中，是其主要活性成分〔3〕。人參皂苷Rb1可清除氧自由基、抑制鈣過度內(nèi)流、改善能量代謝等，人參皂苷Rb1預(yù)處理具有抗心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用〔4，5〕。本實(shí)驗(yàn)在體外建立心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧(I/R)模型，觀察I/R對(duì)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響，以及人參皂苷Rb1的干預(yù)效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 人參皂苷Rb1(Vicmed，純度>95%)，胎牛血清、培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰蛋白酶青霉素鏈霉素雙抗溶液(Sigma公司)，CCK8試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，Annexin Ⅴ-APC 凋亡檢測(cè)試劑盒(eBioscience公司)，牛血清白蛋白(Amresco公司)，TUNEL試劑盒(Chemicon，Temecula，CA公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Amersham公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Heraeus公司)，三氣培養(yǎng)箱(Thermo公司)，酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)，蛋白電泳及電轉(zhuǎn)裝置(Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清，1%青霉素鏈霉素雙抗溶液的DEME培養(yǎng)基于37℃、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。傳3～5代，待狀態(tài)穩(wěn)定后用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，每次傳代時(shí)細(xì)胞密度控制在1×105/ml，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 ①空白對(duì)照(CON)組：細(xì)胞于二氧化碳培養(yǎng)箱(5% CO2、37℃)培養(yǎng)48 h。②缺氧復(fù)氧(H/R)組：細(xì)胞于二氧化碳培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)32 h后，三氣培養(yǎng)箱(N294%、CO25%、O21%，37℃)經(jīng)歷4 h缺氧培養(yǎng)，然后在二氧化碳培養(yǎng)箱復(fù)氧12 h。③人參皂苷Rb1 低、中、高(L、M、H)組：細(xì)胞在二氧化碳培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)32 h后，分別加入50、100、200 μmol/L人參皂苷Rb1預(yù)處理1 h，然后在三氣培養(yǎng)箱經(jīng)歷4 h缺氧，再在二氧化碳培養(yǎng)箱復(fù)氧12 h。

1.4 CCK8檢測(cè) 將100 μl的H9c2單細(xì)胞懸液加入96孔板中，二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)板中分別加入50、100、200、400 μmol/L不同濃度的人參皂苷Rb1，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，然后向培養(yǎng)板中加入10 μl CCK8溶液，再孵育2 h，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.5 酶標(biāo)儀檢測(cè)活性氧(ROS) 將細(xì)胞等密度接種于96孔板中，每孔約2×105/ml，用各組實(shí)驗(yàn)因素處理2 h后加入DCFA-DA探針，在37℃孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍后，檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度(激發(fā)光波長485 nm，發(fā)射光波長525 nm)，以每次實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度作為100%計(jì)算ROS含量。

1.6 MDA含量和SOD活性檢測(cè) MDA含量測(cè)定取100 μl細(xì)胞勻漿；SOD活性檢測(cè)取20 μl細(xì)胞勻漿。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。分別按照試劑盒說明進(jìn)行MDA含量及SOD活性檢測(cè)。

1.7 TUNEL檢測(cè) 將H9c2細(xì)胞傳代于24孔板，培養(yǎng)12 h后，按照上述分組進(jìn)行加藥，12 h后PBS洗滌3遍，用1%多聚甲醛進(jìn)行固定，按照TUNEL試劑盒說明進(jìn)行染色，用DAPI進(jìn)行染核并封片。倒置顯微鏡拍照，用IPP6.0軟件進(jìn)行合并(Merge)，并進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 Western印跡檢測(cè)Procaspase-3、酶切caspase-3表達(dá) 使用Bradford法測(cè)定蛋白后，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)封閉、一抗二抗孵育后，掃描并分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；組內(nèi)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或者組間方差不齊，采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 人參皂苷Rb1對(duì)H9c2細(xì)胞毒性的影響 對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%(OD450 nm為1.15±0.06)，人參皂苷Rb1在50、100、200、400 μmol/L濃度細(xì)胞存活率分別為97.4%、93.9%、90.4%、82.6%(OD450 nm分別為1.12±0.12，1.08±0.04，1.04±0.08，1.04±0.08)，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的人參皂苷Rb1濃度具有低毒性。為了排除人參皂苷Rb1對(duì)H9c2細(xì)胞毒性損傷引起細(xì)胞存活率改變及影響其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用50、100、200 μmol/L為藥物濃度。

2.2 各組MDA、ROS含量和SOD 活性比較 H/R 處理心肌細(xì)胞后SOD活性較CON組下降(P<0.05)，但其MDA、ROS含量顯著增高(P<0.05)。人參皂苷Rb1預(yù)處理細(xì)胞后，L、M、H各組MDA、ROS含量較H/R組明顯降低(P<0.05 )，但M組與H組間MDA、ROS含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；L、M、H各組SOD活性較H/R組顯著增高(P<0.05)，Rb1各組間SOD活性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。表明人參皂苷Rb1預(yù)處理可以減少I/R H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，呈濃度依賴性。見表1 。

2.3 TUNEL染色結(jié)果 見圖1。H/R處理使H9c2心肌細(xì)胞TUNEL陽性細(xì)胞增多〔CON組(1.33±0.58)%，H/R(15.33±3.06)%，P<0.05〕，凋亡加重；L、M、H組與H/R組相比，TUNEL陽性細(xì)胞減少〔L、M、H組分別為(11.00±1.00)%，(6.67±1.16)%，(4.67±1.16)%，均P<0.05〕；M組與H組相比，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；人參皂苷Rb1預(yù)處理能降低H9c2細(xì)胞TUNEL陽性細(xì)胞，改善心肌細(xì)胞的凋亡，呈濃度依賴性。

表1 各組SOD、MDA、ROS的表達(dá)量比較

與CON組比較：1)P<0.05；與H/R組比較：2)P<0.05；與L組比較：3)P<0.05；與M組比較：4)P<0.05

圖1 各組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)(×400)

2.4 Western印跡法檢測(cè)結(jié)果 H/R處理H9c2心肌細(xì)胞后，酶切caspase-3蛋白水平上調(diào)(P<0.05)，L、M、H組與H/R組相比酶切caspase-3蛋白表達(dá)量均降低(P<0.05)，但M組與H組間酶切caspase-3蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。H/R處理H9c2心肌細(xì)胞后，Procaspase-3蛋白水平下調(diào)(P<0.05)，人參皂苷Rb1預(yù)處理能夠上調(diào)Procaspase-3凋亡蛋白的表達(dá)(P<0.05)，但M組與H組之間Procaspase-3凋亡蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。表明人參皂苷Rb1預(yù)處理可減少H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)，呈濃度依賴性。見圖2，表2。

圖2 各組Procaspase-3、酶切caspase-3的蛋白表達(dá)量比較

組別Procaspase?3Cleavedcaspase?3CON組1．00±0．101．00±0．12H/R組0．13±0．031)6．58±0．591)L組0．33±0．091)2)4．11±0．601)2)M組0．62±0．131)2)3)3．24±0．551)2)3)H組0．64±0．131)2)3)2．94±0．211)2)3)

與CON組比較：1)P<0.05;與H/R組比較：2)P<0.05；與L組比較：3)P<0.05

3 討 論

本研究證實(shí)I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。人參皂苷Rb1預(yù)處理可以降低I/R H9c2細(xì)胞內(nèi)的ROS 和MDA水平，使SOD活力升高，從而提示人參皂苷Rb1可能通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。細(xì)胞接受來自胞外的刺激后，可以通過死亡受體和線粒體介導(dǎo)的途徑兩個(gè)方面觸發(fā)凋亡。作為凋亡瀑布的重要組成部分，caspase-3的級(jí)聯(lián)活化是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制〔6〕，而caspase-3為凋亡瀑布的最終共同通路，其活化是凋亡的重要標(biāo)志〔7〕。Western印跡結(jié)合TUNEL染色結(jié)果顯示，H/R可明顯增加H9c2心肌細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)，人參皂苷Rb1具有減少H9c2 H/R細(xì)胞凋亡的作用。人參皂苷Rb1可清除氧自由基，拮抗鈣通道，改善能量代謝，促進(jìn)血管再生，抑制心肌細(xì)胞凋亡等。研究證明人參皂苷Rb1對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)均有保護(hù)作用。人參皂苷Rb1對(duì)缺血性心臟病、心律失常、心力衰竭等方面均有臨床意義〔8，9〕。已有的研究證實(shí)人參皂苷Rb1對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞有明顯的抑制作用，根據(jù)研究，Rb1能顯著減少肥厚心肌細(xì)胞H/R的損傷〔10，11〕。H9c2細(xì)胞株來源于大鼠胚胎的心肌細(xì)胞，具有原代心肌細(xì)胞的一般生理生化特性，且能傳代培養(yǎng)，而廣泛用于細(xì)胞學(xué)和藥理學(xué)等研究。從細(xì)胞水平研究藥物的心肌保護(hù)效應(yīng)目的就在于排除在體心臟、離體心臟等模型中全身神經(jīng)體液和局部不同類型細(xì)胞間的相互影響，從而更好地研究藥物對(duì)單個(gè)細(xì)胞的直接作用及其機(jī)制〔12～15〕。作為體外模擬，H9c2細(xì)胞系缺氧后復(fù)氧模型，能很好地用于體內(nèi)環(huán)境心肌I/R損傷的研究。Sheng等〔16〕的研究提示，抑制心肌細(xì)胞凋亡可以逆轉(zhuǎn)心肌肥厚并抑制心肌重構(gòu)，明顯改善心臟正常代謝，提高心血管疾病患者的生存率。本課題組先前已在動(dòng)物在體水平證實(shí)人參皂苷Rb1可通過P38-MAPK通路對(duì)大鼠I/R損傷起保護(hù)作用〔17〕，本實(shí)驗(yàn)只是檢測(cè)了氧化應(yīng)激、凋亡指標(biāo)，未涉及動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)的部分及對(duì)信號(hào)通路的進(jìn)一步研究，因此存在一定的局限性。

1 Wu Y,Xia Z,Dou J,etal.Protective effect of ginsenoside Rb1 against myocardial ischemia/reperfusion injury in streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕.Mol Biol Rep,2011;38(7):4327-35.

2 劉俊偉，任治龍，劉旭玲，等.人參皂苷Rb1對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦梗死體積及腦組織和血清IL-1β的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013;33(12):1696-700.

3 劉曉暉，朱鯤鵬，許 立，等.人參皂苷Rb1的研究進(jìn)展〔J〕.武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006;15(1)：82.

4 謝 薇，方 竣，夏凌輝，等.人參皂苷Rb1對(duì)白消安誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用〔J〕.臨床血液學(xué)雜志，2007;20(3)：162.

5 Xia R,Zhao B,Wu Y,etal.Ginsenoside Rb1 preconditioning enhances eNOS expression and attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury in diabetic rats〔J〕.Bio Med Res Int,2011;2011(1):767930.

6 Scarabelli TM，Stephanou A，Pasini E,etal.Different signaling pathways induce apoptosis in endothelial cells and cardiac myocytes during ischemia/reperfusion injury〔J〕.Circ Res,2002;90(7)：745-8.

7 Moorjani N，Westaby S，Narula J.Effects of left ventricular volume overload on mitochondrial and death-receptor-mediated apoptotic pathways in the transition to heart failure〔J〕.Am J Cardiol,2009;103：1261-8.

8 Wang X,Liu X,Zhou Q,etal.Ginsenoside Rb1 reduces isoproterenol-induced cardiomyocytes apoptosis in vitro and in vivo〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med,2013;2013(1):454389.

9 賈繼明,王宗權(quán),吳立軍,等.人參皂苷 Rb1 的藥理活性研究進(jìn)展〔J〕.中國中藥雜志,2008;33(12):1371-7.

10 Li Y,Li Y,Fan G,etal.Cardioprotection of ginsenoside Rb1 against ischemia/reperfusion injury is associated with mitochondrial permeability transition pore opening inhibition〔J〕.Chin J Inteqr Med,2016:〔Epub ahead of print〕.

11 Liu Z,Chen J,Huang W,etal.Ginsenoside Rb1 protects rat retinal ganglion cells against hypoxia and oxidative stress〔J〕.Mol Med Rep,2013;8(5):1397-403.

12 余 杰,屠偉峰,王 婕,等.利多卡因預(yù)處理對(duì)H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧性損傷的保護(hù)作用〔J〕.廣東醫(yī)學(xué),2010;31(9):1077-80.

13 劉 源,唐其柱,胡哲夫,等.番茄紅素可改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的 H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激〔J〕.中華心血管病雜志,2015;(4):341-6.

14 王瑞霞.苦參堿對(duì) H9c2 細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制〔J〕.中國心血管雜志,2015;20(4):290-4.

15 儲(chǔ)倩雯,李偉秋,魯詩史,等.利用低氧/厭氧工作站建立 H9c2 細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的探討〔J〕.中國生化藥物雜志,2015;(11):11-4.

16 Sheng R，Gu ZI.Cardiomyocyte apoptosis and regeneration in overload cardiac hypertrophy〔J〕.Chin Pharmacol Bull，2005;21(4)：531-5.

17 Li G,Qian W,Zhao C.Analyzing the anti-ischemia-reperfusion injury effects of ginsenoside Rb1 mediated through the inhibition of p38α MAPK〔J〕.Canad J Physiol Pharmacol,2015;94(1):97-103.

〔2016-11-15修回〕

(編輯 徐 杰)

Effects of ginsenoside Rb1 on hypoxia-reoxygenation H9c2 cells

ZUO Chang-Peng,WANG Fang,ZONG Jing,etal.

Institute of Cardiovascular Disease Research,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000,Jiangsu,China

Objective To observe the effects of ginsenoside Rb1 on hypoxia-reoxygenation H9c2 cells.Methods Ginsenoside Rb1 was used to pretreat hypoxia-reoxygenation H9C2 cells,and the effects of ginsenosides Rb1 on oxidative stress and apoptosis were observed. H9C2 cells were divided into normal control,hypoxia/reoxygenation(H/R),H/R plus low,medium and high dose Ginsenoside Rb1 (L,M,H)groups. The apoptosis-related protein caspase-3 was detected by electrophoresis,superoxide dismutase (SOD),malondialdehyde (MDA),reactive oxygen species(ROS). TUNEL staining were used to detect.Results With treatment of hypoxia-reoxygenation ,the levels of ROS and MDA in H9c2 cardiomyocytes were significantly increased,the activity of SOD was decreased,the expression of apoptosis protein was increased and the apoptosis of H9c2 cardiomyocytes was increased. Ginsenoside Rb1 decreased the content of MDA and increased the activity of SOD and decreased the level of ROS,while Ginsenoside Rb1 reduced the amount of apoptotic protein and the number of apoptotic cells in hypoxia-reoxygenation H9C2 cells.Conclusions Ginsenoside Rb1 could reduce the oxidative stress injury and apoptosis of H9c2 cardiomyocytes induced by H/R,and protect H9c2 cardiomyocytes from H/R.

Ginsenoside Rb1;Hypoxia and reoxygenation;Oxidative stress;Apoptosis

國家自然科學(xué)基金(81400178)；江蘇省自然科學(xué)基金青年基金(BK20160231)

錢文浩(1967-)，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事冠心病臨床及基礎(chǔ)研究。

左長鵬(1990-)，男，碩士，主要從事冠心病與心肌缺血再灌注基礎(chǔ)研究。

R541.4

A

1005-9202(2017)10-2341-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.001

1 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科