郭 海，宋 爽，陳 偉，才秀蓮

(1.河南醫(yī)學高等?？茖W校 組織學與胚胎學教研室，河南 鄭州 451191；2.遵義醫(yī)學院 組織學與胚胎學教研室，貴州 遵義 563099)

基礎醫(yī)學研究

XIAP和Smac在染錳大鼠生精細胞Caspase-9和Apaf-1表達中的作用

郭 海1，宋 爽1，陳 偉2，才秀蓮2

(1.河南醫(yī)學高等?？茖W校 組織學與胚胎學教研室，河南 鄭州 451191；2.遵義醫(yī)學院 組織學與胚胎學教研室，貴州 遵義 563099)

目的 研究氯化錳導致的大鼠生精細胞caspase-9及Apaf-1表達中XIAP和Smac的調節(jié)機制，探討錳導致的雄性不育機制。 方法 雄性SD大鼠隨機分為對照組、低劑量(15 mg/kg MnCl2)和高劑量(30 mg/kg MnCl2)組，腹腔注射MnCl24周和6周，免疫組織化學檢測生精細胞caspase-9、Apaf-1、XIAP和Smac表達。結果 ①各組生精細胞caspase-9、Apaf-1和Smac表達均顯著升高(P<0.01)，XIAP表達降低(P<0.01)。②同時間的高劑量組與低劑量組比較，同劑量的6周組與4周組比較，生精細胞caspase-9、Apaf-1和Smac表達均顯著升高(P<0.01)，XIAP表達降低(P<0.01)。③各組caspase-9與Apaf-1表達呈正相關(r=0.862，P<0.05)，XIAP與Smac表達呈負相關(r=-0.887，P<0.01)。 結論 錳可促進生精細胞caspase-9、Apaf-1和Smac表達，抑制XIAP表達，導致細胞凋亡，產生雄性生殖毒性效應。

錳；生精細胞；caspase-9；Apaf-1；XIAP；Smac

細胞凋亡過程中最關鍵的環(huán)節(jié)是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)家族的激活，caspase-9是該家族中在凋亡起始階段最先激活的成員，通過與凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptosis protease activating factor-1,Apaf-1)形成caspase-9-Apaf-1復合物而促進自身前體活化[1]。凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)可直接抑制caspase家族各成員的活性， X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)是IAP家族中最強大的凋亡抑制因子[2]，它可直接抑制caspase家族多個成員活性[3]，但其本身卻受線粒體第二激活因子(second mitochondria-derived activator of caspases，Smac)的抑制[4]。隨著汽車的普及，作為汽油抗爆劑成分之一的錳在環(huán)境中的含量也隨之上升。其作為一種生殖毒性金屬，可以直接誘發(fā)caspase家族的激活，最終導致生精細胞的凋亡[5]，抑制雄性生殖作用。但在caspase家族所介導的細胞凋亡過程中，最先發(fā)生的是caspase-9和Apaf-1的結合，同時該家族的其他成員活性又受XIAP和Smac的調節(jié)，共同維持生精細胞數量穩(wěn)定。本實驗擬通過檢測錳中毒大鼠睪丸caspase-9、Apaf-1、XIAP及Smac的表達情況，探尋錳的雄性生殖毒性機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只健康雄性SD大鼠，35日齡，體重110～130 g，由四川大學華西醫(yī)院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(川)2003-0001。設定對照組、低劑量(15 mg/kg)組和高劑量 (30 mg/kg)組，每組內再分為4周和6周組，共6組，每組10只。均為腹腔注射給藥，對照組以生理鹽水代替，每周5 d，每天1次，飼養(yǎng)及實驗溫度(20±1) ℃，濕度30%～50%，光照12 h/d。

1.2 主要試劑及儀器 分析純MnCl2·4H2O購于上海化學試劑公司；caspase-9和Apaf-1兔抗鼠單克隆抗體購于北京中杉金橋生物工程公司；XIAP和Smac小鼠抗大鼠單克隆抗體購于德國Roche公司；SABC免疫組織化學試劑盒購于北京中杉金橋生物工程公司；DMLB2HC型細胞圖像分析系統購于德國LEICA公司。

1.3 標本采集 分別于第4周末和第6周末處死各自時間段的對照組、低劑量組和高劑量組，分離雙側睪丸，縱切后4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，片厚4 μm進行冠狀位切片，免疫組織化學檢測生精細胞caspase-9、Apaf-1、XIAP及Smac表達。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知的caspase-9和Apaf-1表達陽性的乳腺癌切片及XIAP和Smac表達陽性的胃癌切片作為陽性對照，具體步驟按照說明書進行。

1.4 觀察指標及方法 Caspase-9、Apaf-1、XIAP及Smac陽性產物均呈棕黃色，位于生精細胞的細胞質，各組大鼠均可見，主要位于精母細胞。每例切片在冠狀位從左至右連續(xù)觀察10個生精小管，分別計數caspase-9、Apaf-1、XIAP及Smac表達陽性的生精細胞數占總生精細胞數的百分率，即為各自的陽性細胞率。

2 結果

2.1 錳對大鼠生精細胞caspase-9和Apaf-1表達的影響 Caspase-9和Apaf-1陽性產物均呈棕黃色，主要位于精母細胞的細胞質，其余各級生精細胞可見少量表達。與對照組比較，低劑量、高劑量組caspase-9和Apaf-1表達均升高(P<0.01)。同時間的高劑量組與低劑量組比較，以及同劑量的6周組與4周組比較，caspase-9和Apaf-1表達均升高(P<0.01，見表1和圖1)。

組別caspase-9陽性細胞率4周6周Apaf-1陽性細胞率4周6周空白對照5.26±1.574.38±2.713.94±1.622.84±0.5715mg/kgMnCl235.84±5.13a52.92±4.42ab43.25±5.37a61.27±4.68ab30mg/kgMnCl254.41±6.32ac62.34±5.65abc62.81±7.34ac77.56±5.73abc

a: 與同時間點對照組相比; b: 與同劑量4周組相比; c: 與同時間點低劑量組相比；P<0.01。

A：caspase-9，對照組；B：caspase-9，4周低劑量組；C：caspase-9，6周低劑量組；D：Apaf-1，對照組；E：Apaf-1，6周低劑量組；F：Apaf-1，6周高劑量組。↗表示陽性細胞。 圖1 各組大鼠生精細胞caspase-9和Afaf-1表達(SABC，×400)

2.2 錳對大鼠生精細胞XIAP和Smac表達的影響 XIAP和Smac免疫陽性產物均呈棕黃色或棕褐色，主要表達于精母細胞的細胞質，其余各級生精細胞可見少量表達，各組大鼠均可見。與對照組比較，除4周低劑量組XIAP和Smac表達沒有明顯差異外，各組XIAP表達顯著降低，Smac表達顯著升高(P<0.01)。同時間的高劑量組與低劑量組比較，以及同劑量的6周組與4周組比較，XIAP表達顯著降低，Smac表達顯著升高(P<0.01，見表2和圖2)。

分組XIAP陽性細胞率4周6周Smac陽性細胞率4周6周空白對照45.52±5.3647.83±3.678.26±1.547.98±1.3315mg/kgMnCl243.41±4.2332.77±3.94ab35.16±5.21a56.31±6.62ab30mg/kgMnCl224.78±3.25ac19.13±4.38abc64.14±6.17ac76.53±5.47abc

a: 與同時間點對照組相比；b: 與同劑量4周組相比；c: 與同時間點低劑量組相比，P<0.01。

A：XIAP，對照組；B：XIAP；6周低劑量組；C：XIAP, 6周高劑量組；D：Smac, 對照組；E：Smac, 6周低劑量組；F：Smac, 6周高劑量組。↗表示陽性細胞。圖2 各組大鼠生精細胞XIAP和Smac表達(SABC，×400)

2.3 染錳大鼠生精細胞caspase-9、Apaf-1、XIAP及Smac表達間相關關系 各組大鼠生精細胞caspase-9陽性細胞率與Apaf-1陽性細胞率呈正相關(r=0.862，P<0.05)，XIAP陽性細胞率與Smac陽性細胞率呈負相關(r=-0.887，P<0.01)。

3 討論

錳是體內多種酶的活性中心[6]，但過量的錳蓄積于體內可以穿過血睪屏障，破壞生精微環(huán)境，導致生精細胞特別是精母細胞凋亡[5]，其直接后果為精子數量下降和雄性不育。

細胞凋亡的內源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑最終都將導致caspase家族成員的激活，其中caspase-2,-8,-9,10是凋亡途徑的啟動酶，caspase-3,-6,-7是凋亡途徑的效應酶[7]。通常情況下caspase-9以前體酶原pro-caspase-9的形式存在，在線粒體釋放的細胞色素C的作用下，一方面使pro-caspase-9發(fā)生水解而自身激活，另一方面促使同樣在線粒體內部的Apaf-1釋放，共同組成Cyto-c-Apaf-1-caspase-9凋亡復合體[8]。該復合體再激活caspase-3，最終導致不可逆的凋亡發(fā)生。在此過程中，Apaf-1起到承上啟下的關鍵作用，是整個凋亡復合體的核心[9]。染錳后Apaf-1主要表達于精母細胞細胞質，與caspase-9表達區(qū)域一致，且二者之間存在正相關。說明生精細胞凋亡過程中，首先被激活的是Apaf-1，其釋放后與同時表達增加的caspase-9形成凋亡復合體，最終使細胞質中caspase-3表達上調，并發(fā)生由細胞質向細胞核的轉移導致生精細胞凋亡。

X染色體連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)是凋亡抑制蛋白家族中最強大最有效的caspase家族抑制劑，也是唯一能夠同時抑制凋亡起始階段caspase-9和凋亡執(zhí)行階段caspase-3的凋亡抑制蛋白[10]。XIAP由3個桿狀病毒caspase抑制因子重復區(qū)(baculovirus IAP repeats domain，BIR)的結構域組成，分別是BIR1，BIR2和BIR3，BIR1和BIR2主要抑制caspase-3和caspase-7的活性，而BIR3主要通過在氨基酸組成序列上與Apaf-1高度同源的RING結構域競爭性抑制Apaf-1-caspase-9凋亡復合體的形成，使Apaf-1維持單體形態(tài)而喪失催化活性，進而抑制caspase-9的激活[11]。因此，XIAP不僅在上游途徑通過對pro-caspase-9的抑制阻止凋亡發(fā)生，而且還通過對caspase-3和caspase-7的直接抑制作用，在下游途徑阻止后續(xù)級聯反應的進行。本實驗顯示，隨著染錳時間延長和劑量增加，XIAP的活性逐漸被抑制，導致原本受其控制的Apaf-1和caspase-9表達增加，最終導致生精細胞發(fā)生凋亡。

Caspase家族的線粒體第二激活因子(Smac)也位于動物細胞線粒體內，在人體各個器官中以睪丸表達最高，卵巢次之[12]。單體的Smac并無促凋亡作用，當其自身剪切活化形成二聚體后，通過N端的丙氨酸-纈氨酸-脯氨酸-異亮氨酸(AVPI)序列可以與包括XIAP在內的多種凋亡抑制蛋白結合，使caspase-3,-7,-9從XIAP釋放，解除XIAP對它們的抑制作用，促進凋亡發(fā)生[13]。還可以誘導pro-caspase-3的活性上升，使其更容易被caspase-9識別并激活，直接導致細胞凋亡[14]。最后，Smac還可以通過反向激活Bax，再次使細胞核釋放細胞色素C，形成凋亡內源性途徑的自身循環(huán)，加速凋亡進程[15]。染錳后，作為caspase家族底物的Apaf-1隨同細胞色素C一同自線粒體釋放，二者共同激活caspase-9，進而激活家族核心成員caspase-3，直接導致生精細胞凋亡。同時，具有抑制凋亡作用的XIAP表達下降，同時促進caspase-3,-7,-9釋放，誘發(fā)凋亡的Smac表達增加，說明錳一方面通過誘發(fā)凋亡內源性的線粒體途徑激活，同時破壞凋亡抑制蛋白，促進caspase家族成員與其分離，最終導致生精細胞的破壞和雄性生殖功能的抑制。

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[收稿2016-12-31;修回2017-02-28]

(編輯：王靜)

Effects of XIAP and Smac on the expressions of Caspase-9 and Apaf-1 in spermatogenic cells of rats exposed to manganese

GuoHai1,SongShuang1,ChenWei2,CaiXiulian2

(1.Department of Histology and Embryology, Henan Medical College, Zhengzhou Henan 451191, China; 2.Department of Histology and Embryology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To determine the regulatory effects of XIAP and Smac on the expressions of caspase-9 and Apaf-1 in spermatogenic cells of rats exposed to manganese and further explore the mechanisms through which male sterility caused by manganese. Methods Male Sprague Dawley rats were divided into control and MnC12(15 and 30 mg/kg) groups. After exposed to manganese for 4 or 6 weeks, the expressions of caspase-9, Apaf-1, XIAP and Smac were detected by immunohistochemistry (SABC) assay. Results 1) The caspase-9-positive-cell rate, the Apaf-1-positive-cell rate and the Smac-positive-cell rate were increased (P<0.01) while the XIAP-positive-cell rate was decreased (P<0.01). 2) Among the same dose and same time manganese groups, caspase-9-positive-cell rate, the Apaf-1-positive-cell rate and the Smac-positive-cell rate were increased (P<0.01) while the XIAP-positive-cell rate was decreased (P<0.01). 3)There was a positive correlation between caspase-9-positive-cell rate and Apaf-1-positive-cell rate (r=0.862,P<0.05), and a negative correlation between XIAP-positive-cell rate and Smac-positive-cell rate (r=-0.887,P<0.01). Conclusion Manganese could promote the expressions of caspase-9,Apaf-1 and Smac and inhibit the expression of XIAP, which might lead to male reproductive toxicity.

manganese; spermatogenic cells; caspase-9; Apaf-1; XIAP; Smac

遵義市科技局社會發(fā)展資助項目(NO: 遵市科合社字[2007]07); 遵義市紅花崗區(qū)科技局社會發(fā)展資助項目(NO: 遵紅科合[2006]22)。

才秀蓮，女，教授，碩士生導師，研究方向：生殖毒理學，E-mail:lianxiucai@163.com。

R114

A

1000-2715(2017)02-0156-05