葛婷婷 余勤 祝莉 周麗萍

浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

DMOG對(duì)MSCs成骨分化及缺血損傷影響的研究

葛婷婷 余勤 祝莉 周麗萍

浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

[目的]研究二甲基乙二?；拾彼幔╠imethyloxalglycine，DMOG）對(duì)體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）成骨分化和缺血損傷的影響。[方法]利用全骨髓貼壁法獲得MSCs，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，同時(shí)給予20μM、40μM、80μM的DMOG處理，培養(yǎng)3d、7d、14d時(shí)分別進(jìn)行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的定量測(cè)定，培養(yǎng)14d時(shí)進(jìn)行硝酸銀染色；建立MSCs缺血損傷模型，同時(shí)給予不同濃度DMOG處理，Western blot檢測(cè)MSCs中Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)，MTT法檢測(cè)MSCs增殖能力，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)MSCs細(xì)胞活力。[結(jié)果]DMOG處理可促進(jìn)MSCs成骨分化中ALP的表達(dá)，且DMOG 20μM處理促進(jìn)作用最顯著；各組MSCs成骨分化中ALP的表達(dá)均呈時(shí)間依賴性增加。DMOG 20μM組黑色礦化基質(zhì)分泌明顯多于其余各組。40μM DMOG可以顯著提高缺血損傷MSCs中Bcl-2蛋白的表達(dá)、抑制Bax蛋白的表達(dá)，可顯著促進(jìn)缺血損傷MSCs的增殖能力和存活率，DMOG的20μM、80μM處理無(wú)顯著促進(jìn)或抑制作用。[結(jié)論]DMOG 20μM可顯著促進(jìn)MSCs成骨分化能力，DMOG 40μM可有效提高缺血損傷MSCs的增殖能力和存活率。

MSCs；DMOG；成骨分化；缺血損傷；細(xì)胞凋亡

股骨頭壞死是由多種原因引起的股骨頭缺血性破壞或骨細(xì)胞變性導(dǎo)致整個(gè)髖關(guān)節(jié)功能喪失的一類臨床常見(jiàn)骨科疾病，致殘性高[1-2]，多數(shù)患者不得不進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換，尋求保存患者自身關(guān)節(jié)的有效治療方法實(shí)有必要[3]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs）成骨分化作用認(rèn)識(shí)的深入，為股骨頭壞死的治療提供了一種新的選擇。但是，MSCs移植后的生存環(huán)境惡劣，需要借助藥物加強(qiáng)MSCs的成骨分化能力并提高其移植后存活率，因而本課題通過(guò)研究二甲基乙二?；拾彼幔╠imethyloxalglycine，DMOG）對(duì)MSCs成骨分化能力的影響，以及通過(guò)建立MSCs缺血損傷模型，明確不同濃度DMOG對(duì)MSCs缺血損傷的影響，有望為DMOG聯(lián)合MSCs治療股骨頭壞死疾病提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體質(zhì)量為（60～80）g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 主要試劑 DMEM/F-12培養(yǎng)基（Invitrogen公司，批號(hào)：12400-024），胎牛血清（FBS，GiBco公司，批號(hào)：10099-141），0.25%胰蛋白酶-1mmoL EDTA（Invitrogen公司，批號(hào)：25300054），青-鏈霉素（Invitrogen公司，批號(hào)：10378016），Triton X-100裂解液（Biosharp公司，批號(hào)：BS363A），多聚甲醛（天津市化學(xué)試劑研究所，批號(hào)：980227），硝酸銀、硫代硫酸鈉（Sigma公司，批號(hào)：S8157、72049），臺(tái)盼藍(lán)染料、MTT（Amresco公司，批號(hào)：K940、0793），二甲基亞砜(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DH105-9)、DMOG（Cayman公司，批號(hào)：71210），成骨分化培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：RASMX-90021），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測(cè)試劑盒（聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：AP0013），兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體（聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ab36715），兔抗大鼠Bax單克隆抗體（聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ab689），兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ab008），HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：GAR0072）。

1.3 主要儀器設(shè)備 倒置相差顯微鏡（TE2000-S，Nikon公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（VBLC310，美國(guó)Heraeus公司制造），純水儀（PN PAL-CAXXXLSM2，美國(guó)PALL公司），超凈工作臺(tái)（SW-CF-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（3111，美國(guó)FORMA公司），電子天平（ARA-520，Adventurer），離心機(jī)（LDZ5-2型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠），高壓滅菌鍋（YXQ-LS-50A，上海云泰儀器代表有限公司），冰箱（BCD-216E/B，Haier），酶標(biāo)儀（SpectraMax 190，美國(guó)MD公司），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（3K-15，德國(guó)Sigma公司），超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（JY92-IIDN，寧波新芝生物科技股份有限公司），脫色搖床（TS-1型，海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 MSCs的體外分離培養(yǎng) 將SD大鼠脫頸處死，用75%的乙醇浸泡消毒2min；無(wú)菌條件下解剖大鼠，取出股骨、脛骨，剔除骨上附著的軟組織，用5mL PBS液將骨髓沖出，1000r/min離心5min；加入含10% FBS、1%青-鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)液，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24h后換液，棄去未貼壁的細(xì)胞；隨后每2~3d換1次液，待細(xì)胞融合至80%~90%，結(jié)束原代培養(yǎng)。取出細(xì)胞融合接近80%~90%的培養(yǎng)瓶，棄去舊培養(yǎng)液，PBS清洗，用2mL 0.25%胰蛋白酶-1mmoL EDTA消化3~5min，待細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始皺縮變圓，間隙變寬時(shí)加等量的含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞于離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，加入含10%FBS、1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基5mL輕輕吹打細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 MSCs成骨誘導(dǎo)分化、分組及DMOG干預(yù) 將P3代MSCs以1×104個(gè)/mL接種于6孔板中，每孔接種2mL細(xì)胞懸液，24h后將MSCs的培養(yǎng)基更換為含不同濃度DMOG的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，根據(jù)不同濃度的DMOG實(shí)驗(yàn)分為4組：正常組、DMOG 20μM組、DMOG 40μM組、DMOG 80μM組，各組每3d更換1次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化14d。

2.3 ALP定量測(cè)定 分別在成骨誘導(dǎo)分化分組換液培養(yǎng)3d、7d、14d后，收集細(xì)胞并以0.05%的Triton X-100裂解液進(jìn)行裂解。按照ALP活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定，取50μL的裂解物于96孔板中，再加50μL顯色底物混勻，37℃避光孵育 5min，加入100μL終止液終止反應(yīng)，在405nm處檢測(cè)各組樣品的吸光度，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算各組細(xì)胞ALP活力。

2.4 硝酸銀染色 在成骨誘導(dǎo)分化分組換液培養(yǎng)14d后，吸干成骨誘導(dǎo)分化各組6孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，用4%的多聚甲醛固定15min，雙蒸水洗2次，自然晾干后，每孔加入2mL新配制的2%硝酸銀溶液染色5min，用去離子水充分洗滌后，放置于紫外線下照射15～30min，雙蒸水漂洗2次，再用5%硫代硫酸鈉處理2min，雙蒸水洗2次，倒置相差顯微鏡下觀察。

2.5MSCs缺血損傷模型建立、分組及DMOG干預(yù) 取P3代MSCs細(xì)胞懸液5mL（1×105個(gè)/mL）接種于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌3次，更換培養(yǎng)基為無(wú)血清且含不同濃度DMOG的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，建立MSCs缺血損傷模型。實(shí)驗(yàn)共分為3組：正常組（用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)）、缺血清組（用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)）、不同濃度DMOG干預(yù)組（在無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中加入DMOG使其終濃度分別為20μM、40μM、80μM培養(yǎng)）。

2.6 Western blot檢測(cè)MSCs中Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá) 缺血清培養(yǎng)MSCs 24h后，提取各組細(xì)胞蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，變性后上樣，以10%分離膠、5%濃縮膠的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，常規(guī)方法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1h，分別加兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體(1∶1000稀釋)，兔抗大鼠Bax單克隆抗體（按1∶1000稀釋）或兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（1∶5000稀釋），4℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育1.5h，曝光顯影。

2.7 MTT法檢測(cè)MSCs增殖能力 將MSCs(1×104個(gè)/mL）接種96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，按照“2.5 MSCs缺血損傷模型建立、分組及DMOG干預(yù)”方法分為正常組、缺血清組、不同濃度DMOG干預(yù)組。分別在培養(yǎng)1d、3d、5d、7d時(shí)，棄上清，每孔加入20μL濃度5mg·mL-1的MTT，37℃孵育4h，小心吸棄孔內(nèi)上清，每孔加入150μL DMSO溶液，待充分溶解后，在酶標(biāo)儀上測(cè)量490nm處OD值，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，按下列公式計(jì)算其平均OD值。

OD490-均=（OD490-1+OD490-2+OD490-3+OD490-4+OD490-5）/5（公式1-1）

2.8 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)MSCs活力 正常組、缺血清組、不同濃度DMOG干預(yù)組各組細(xì)胞培養(yǎng)3d時(shí)分別制備單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整至細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL。取1滴0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液和9滴細(xì)胞懸液混勻，在3min內(nèi)用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，鏡下活細(xì)胞拒染，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色。按下列公式計(jì)算細(xì)胞活力：

細(xì)胞活力（%）=[（總細(xì)胞數(shù)-死細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)]× 100%（公式1-2）

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同濃度DMOG處理后MSCs中ALP定量測(cè)定結(jié)果(±s，U·L-1)Tab.1 The quantitative results of ALP in different DMOG concentration groups(±s,U·L-1)

表1 不同濃度DMOG處理后MSCs中ALP定量測(cè)定結(jié)果(±s，U·L-1)Tab.1 The quantitative results of ALP in different DMOG concentration groups(±s,U·L-1)

注：同一時(shí)間點(diǎn)，與正常組比較，*P<0.05；與DMOG 20μM組比較，△P<0.05；與DMOG 40μM組比較，□P<0.05。同一組內(nèi)，與3d比較，■P<0.05；與7d比較，☆P<0.05。Note:At the same time,compared with control group,*P<0.05;Compared with DMOG 20μM group,△P<0.05;Compared with DMOG 40μM group,□P< 0.05.In the same group,compared wtih 3d,■P<0.05;Compared wtih 7d,☆P<0.05.

組別正常組DMOG 20μM組DMOG 40μM組DMOG 80μM組誘導(dǎo)分化時(shí)間3d 7d 14d 31.46±0.48 35.86±0.45*32.68±0.58*△32.96±0.36*△86.89±2.76■142.55±0.16*■99.12±0.98*△■97.80±22.28*△■122.62±1.75■☆175.98±1.29*■☆166.65±1.42*△■☆140.43±2.14*△□■☆

3 結(jié)果

3.1 MSCs形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)3d時(shí)，可見(jiàn)放射狀排列的細(xì)胞集落，伸出長(zhǎng)短不一、粗細(xì)不均的突起，并開(kāi)始大量增殖（圖1A）；原代培養(yǎng)8d時(shí)，單個(gè)細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，細(xì)胞呈漩渦狀生長(zhǎng)，且細(xì)胞密度增大，融合度達(dá)到80%~90%（圖1B）。傳代后的MSCs生長(zhǎng)迅速（圖1C、圖1D），細(xì)胞形態(tài)主要表現(xiàn)為梭形、紡錘形，少數(shù)為多角形，趨向于均一化，且懸浮的雜細(xì)胞逐漸減少，說(shuō)明通過(guò)不斷的傳代和換液MSCs純度提高。

3.2 不同濃度DMOG處理后MSCs中ALP定量測(cè)定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）。誘導(dǎo)分化3d時(shí)，與正常組比較，DMOG 20μM組、DMOG 40μM組和DMOG 80μM組ALP活力均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；與DMOG 20μM組比較，DMOG 40μM組、DMOG 80μM組ALP活力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與DMOG 40μM組比較，DMOG 80μM組ALP活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。誘導(dǎo)分化7d時(shí)，與正常組比較，DMOG 20μM組、DMOG 40μM組和DMOG 80μM組ALP活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；DMOG的20μM、40μM組、80μM三組之間兩兩比較，DMOG 20μM組ALP活力最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。誘導(dǎo)分化14d時(shí)，與正常組比較，DMOG 20μM組、DMOG 40μM組和DMOG 80μM組ALP活力顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；DMOG 20μM、40μM、80μM三組之間兩兩比較，DMOG 20μM組ALP活力最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在同一組內(nèi)，ALP活力增加呈時(shí)間依賴性，誘導(dǎo)分化14d時(shí)各組ALP活力均最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果顯示：DMOG處理可促進(jìn)MSCs成骨分化中ALP的表達(dá)，且DMOG 20μM處理促進(jìn)作用最顯著，各組MSCs成骨分化中ALP的表達(dá)均呈時(shí)間依賴性增加。

圖1 大鼠骨髓MSCs形態(tài)圖（40×）Fig.1 Morphology of rat bone marrow MSCs（40×）

3.3 不同濃度DMOG處理后MSCs成骨分化的硝酸銀染色結(jié)果 各組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化14d后，硝酸銀染色可見(jiàn)細(xì)胞間散有黑色顆粒，顆粒大小不一，表明有礦化基質(zhì)沉淀。圖2A、2B、2C、2D分別是MSCs成骨分化正常組、DMOG 20μM組、DMOG 40μM組、DMOG 80μM組的染色情況，結(jié)果顯示：DMOG 20μM組黑色礦化基質(zhì)分泌明顯多于其余各組。

3.4 不同濃度DMOG處理缺血損傷MSCs中Bcl-2/ Bax蛋白的表達(dá) 提取各組細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，可見(jiàn)大小26kDa的Bcl-2蛋白，20kDa的Bax蛋白及42kDa的β-actin蛋白（圖3C）。對(duì)顯影結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與正常組比較，缺血清組、20μM DMOG組、80μM DMOG組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），40μM DMOG組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；與缺血清組比較，20μM DMOG組、40μM DMOG組、80μM DMOG組Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中，40μM DMOG組Bcl-2蛋白表達(dá)水平最高（圖3A）。與正常組比較，各組Bax蛋白表達(dá)均顯著提高（P<0.01）；與缺血清組比較，20μM DMOG組、40μM DMOG組Bax蛋白表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），80μM DMOG組表達(dá)水平顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中，40μM DMOG組Bax蛋白表達(dá)水平最低（圖3B）。結(jié)果顯示：40μM DMOG可以顯著提高缺血損傷MSCs中Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制缺血損傷MSCs中Bax蛋白的表達(dá)。

圖2 各組MSCs成骨分化硝酸銀染色結(jié)果圖（200x）Fig.2 Von Kossa stain results of MSCs osteogenetic differentiation in each group（200x）

表2 不同濃度DMOG處理對(duì)缺血損傷MSCs增殖能力的影響（OD490，n=5，±s)Tab.2 The effects of multiplication capacity of ischemic injury MSCs with different concentration DMOG treated (OD490，n=5，±s)

表2 不同濃度DMOG處理對(duì)缺血損傷MSCs增殖能力的影響（OD490，n=5，±s)Tab.2 The effects of multiplication capacity of ischemic injury MSCs with different concentration DMOG treated (OD490，n=5，±s)

注：同一時(shí)間內(nèi)，與正常組比較，*P<0.05；與缺血清組比較，#P<0.05；與20μM DMOG組比較，△P<0.05；與40μM DMOG組比較，□P<0.05。Note:At the same time,compared with control group,*P<0.05;Compared with ischemic injury group,#P<0.05;Compared with 20μM DMOG group,△P<0.05;Compared with 40μM DMOG group,□P<0.05.

時(shí)間1d 3d 5d 7d組別正常組 缺血清組 20μM DMOG組 40μM DMOG組 80μM DMOG組0.322±0.008 0.729±0.003 0.839±0.010 0.988±0.010 0.177±0.009*0.206±0.012*0.227±0.014*0.238±0.012*0.177±0.012*0.206±0.018*0.229±0.016*0.236±0.009*0.196±0.009*#△0.221±0.006*#△0.247±0.005*#△0.268±0.005*#△0.176±0.006*□0.208±0.018*□0.232±0.021*□0.242±0.009*□

3.5 不同濃度DMOG處理對(duì)缺血損傷MSCs增殖能力的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）。缺血損傷1d、3d、5d、7d時(shí)，與正常組比較，缺血清組、20μM DMOG組、40μM DMOG組、80μM DMOG組的OD值均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與缺血清組比較，20μM DMOG組、80μM DMOG組的OD值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），40μM DMOG組的OD值顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與20μM DMOG組比較，40μM DMOG組的OD值顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），80μM DMOG組的OD值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P> 0.05）；與40μM DMOG組比較，80μM DMOG組的OD值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果顯示：DMOG 40μM處理可顯著促進(jìn)缺血損傷MSCs的增殖能力，DMOG的20μM、80μM處理無(wú)顯著促進(jìn)或抑制作用。

圖3 不同濃度DMOG處理缺血損傷MSCs中Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)水平Fig.3 The expression level of Bcl-2/Bax protein from ischemia injury MSCs in different DMOG concentrations

表3 不同濃度DMOG處理組MSCs的臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果（±s,%）Tab.3 Trypan blue stain results of MSCs in different DMOG treated groups(±s,%)

表3 不同濃度DMOG處理組MSCs的臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果（±s,%）Tab.3 Trypan blue stain results of MSCs in different DMOG treated groups(±s,%)

組別正常組缺血清組20μM DMOG組40μM DMOG組80μM DMOG組活細(xì)胞比例95.65±0.012 82.74±0.032*83.50±0.106*89.45±0.066*#△83.87±0.086*□

3.6 不同濃度DMOG處理對(duì)缺血損傷MSCs活力的影響 各組MSCs培養(yǎng)3d時(shí)，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，測(cè)定細(xì)胞活力，即測(cè)定活細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例，結(jié)果（表3）。與正常組比較，缺血清組、20μM DMOG組、40μM DMOG組和80μM DMOG組活細(xì)胞比例顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與缺血清組比較，20μM DMOG組和80μM DMOG組活細(xì)胞比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），40μM DMOG組活細(xì)胞比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與20μM DMOG組比較，40μM DMOG組活細(xì)胞比例明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），80μM DMOG組活細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與40μM DMOG組比較，80μM DMOG組活細(xì)胞比例明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果顯示：DMOG 40μM處理可顯著提高缺血損傷MSCs的存活率，DMOG的20μM、80μM處理無(wú)顯著促進(jìn)或抑制作用。

4 討論

MSCs來(lái)自于中胚層，是一類未分化的多能成體干細(xì)胞，擁有多向分化的潛力[4]。在體內(nèi)或體外適宜的條件下具有分化為成骨細(xì)胞[5]、心肌細(xì)胞[6]、神經(jīng)細(xì)胞[7]、脂肪細(xì)胞[8]等多種細(xì)胞的能力。MSCs來(lái)源廣泛，易于提取分離、體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，不存在倫理問(wèn)題的爭(zhēng)議，所以現(xiàn)已成為組織工程、細(xì)胞和基因治療方面研究的熱點(diǎn)，有著可觀的應(yīng)用前景。本課題選擇全骨髓貼壁篩選法對(duì)MSCs進(jìn)行培養(yǎng)，并定期換液除去雜細(xì)胞，達(dá)到純化細(xì)胞的目的。同時(shí)，全骨髓貼壁篩選法幾乎保留所有的骨髓前體細(xì)胞，還提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的細(xì)胞因子，促使細(xì)胞更好的生長(zhǎng)。

DMOG作為一種小分子酮戊二酸類似物，通過(guò)與內(nèi)源性的2-酮戊二酸競(jìng)爭(zhēng)從而抑制脯氨酸羥化酶（proline hydroxylase,PHD），使得細(xì)胞在正常氧環(huán)境下也“感覺(jué)”低氧，對(duì)動(dòng)物及人類均無(wú)毒性，可作為高效安全的缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）穩(wěn)定劑。目前，有研究[9-10]表明DMOG在MSCs成骨分化中有一定的促進(jìn)作用，可能是其作用形成的低氧環(huán)境促使細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，研究同時(shí)表明HIF-1在MSCs的成骨分化中發(fā)揮重要作用。DMOG作為一種缺氧模擬劑，可以有效降低HIF-1α的降解，穩(wěn)定HIF-1的表達(dá)，從而促進(jìn)MSCs成骨分化。本課題給予MSCs不同濃度DMOG處理，根據(jù)ALP的定量測(cè)定可知DMOG處理可促進(jìn)MSCs成骨分化中ALP的表達(dá)，且DMOG 20μM處理促進(jìn)作用最顯著；各組MSCs成骨分化中ALP的表達(dá)均呈時(shí)間依賴性增加。同時(shí)，硝酸銀染色結(jié)果也顯示，在DMOG的給藥濃度為20μM時(shí)，礦化基質(zhì)沉淀最多，表示DMOG 20μM的給藥濃度能有效促進(jìn)MSCs的成骨分化。

研究表明，DMOG與HIF-1α關(guān)系密切，且對(duì)細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用[11]。DMOG作為缺氧模擬劑可以抑制HIF-1α亞基降解，提高其活性，高度表達(dá)的HIF-1α可進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-1β亞基形成有活性的二聚體HIF-1，HIF-1再與下游靶基因作用發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)功效。DMOG能抑制MSCs因缺血損傷引起的凋亡，其機(jī)制可能為對(duì)凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2/Bax表達(dá)的調(diào)控[12-13]。本課題通過(guò)Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)40μM DMOG可以顯著提高缺血損傷MSCs中抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制缺血損傷MSCs中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。通過(guò)MTT法檢測(cè)各組MSCs增殖能力，以此研究DMOG對(duì)MSCs缺血損傷的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，40μM濃度組OD值高于缺血清組，但低于正常組，提示40μM DMOG給藥濃度對(duì)MSCs在缺血損傷環(huán)境下有一定的保護(hù)作用。而20μM DMOG和80μM DMOG組OD值皆低于缺血清組，提示該兩組DMOG給藥濃度不能提高M(jìn)SCs在缺血損傷環(huán)境下的存活率。同時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果也表明40μM DMOG組的活細(xì)胞比例顯著高于20μM和80μM組。

綜上所述，本研究結(jié)果提示DMOG 20μM可顯著促進(jìn)MSCs成骨分化能力，DMOG 40μM可有效提高缺血損傷MSCs的增殖能力和存活率。研究結(jié)果中，DMOG促進(jìn)MSCs成骨分化和提高缺血損傷MSCs的增殖能力、存活率的濃度不一致，可能與MSCs缺血清損傷前后對(duì)DMOG敏感程度不同有關(guān)，具體機(jī)制我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中展開(kāi)更為深入的研究。在低濃度DMOG對(duì)各種細(xì)胞作用的研究中，Marchbank等[14]發(fā)現(xiàn)10~70μM濃度的DMOG能呈劑量依賴的促進(jìn)人HT29細(xì)胞增殖，6.25~25μM濃度的DMOG能呈劑量依賴的促進(jìn)人HT29細(xì)胞遷移能力，且本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMOG 20μM處理對(duì)MSCs成骨分化有顯著促進(jìn)作用，這也給予我們啟示：在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中開(kāi)展更低濃度DMOG對(duì)MSCs成骨分化能力影響的實(shí)驗(yàn)研究十分必要，可為進(jìn)一步完善和豐富本研究成果提供一定的理論基礎(chǔ)。

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The Effects of DMOG on MSCs Osteogenic Differentiation and Ischemic Injury

GE Tingting,YU Qin,ZHU Li,et al
College of Life Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

[Objective]Isolating and culturing rat bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)in vitro,we aimed to understand the effects of different concentrations of DMOG on their osteogenic differentiation and ischemic injury.[Methods]Whole bone marrow adherent method was used to obtain the MSCs, MSCs were induced to differentiate into osteoblast while giving 20μM,40μM,80μM concentrations of DMOG,and conducted the quantitative measurement of alkali quantitative phosphatase(ALP)at the time when cultivated 3d,7d and 14d,respectively,and performed Von Kossa staining when cultured 14d; Established MSCs ischemic injury model,while treated with different concentrations of DMOG,protein level of Bcl-2/Bax was detected by Western blot, then MTT method was used to detect the MSCs proliferation ability,and trypan blue staining was used to detect the MSCs viability.[Results]DMOG treatment may promote the ALP expression in osteogenic differentiation of MSCs,and DMOG 20μM treatment had the most significant role in promoting; ALP expression of each group in the osteogenic differentiation of MSCs increased in a time-dependent manner.In DMOG 20μM group,the black mineralizing matrix secretion was significantly more than other groups.40μM DMOG can significantly improve the expression of Bcl-2 protein,inhibit the expression of Bax protein in ischemic injury MSCs,and significantly promote proliferation and survival ability of ischemic injury MSCs,DMOG 20μM,80μM treatment had no significant promotion or inhibition effect.[Conclusion]DMOG 20μM could significantly promote osteogenic differentiation ability of MSCs; DMOG 40μM could effectively improve the proliferation ability and survival rate of ischemic injury MSCs.

mesenchymal stem cells;dimethyloxalglycine;osteogenic differentiation;ischemic injury;apoptosis

R331

：A

：1005-5509（2017）05-0400-08

10.16466/j.issn1005-5509.2017.05.014

2016-12-27）

浙江省新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目(2015R410048)；浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y20163679）

Fund projects:Xinmiao Talent Project of Zhejiang Province(2015R410048);Foundation of Zhejiang Education Committee (Y20163679)

周麗萍，E-mail：lipingzhou1219@126.com