朱廣磊 睢寧 張春椿 俞冰 李石清 張水利 熊耀康

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

不同產(chǎn)地浙貝母藥材HPLC-ELSD指紋圖譜的研究

朱廣磊 睢寧 張春椿 俞冰 李石清 張水利 熊耀康

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

[目的]建立不同產(chǎn)地浙貝母藥材HPLC-ELSD指紋圖譜，為科學(xué)評(píng)價(jià)和有效控制其質(zhì)量提供可靠方法。[方法]采用HPLC-ELSD測(cè)定21個(gè)不同產(chǎn)地的浙貝母藥材樣品，建立指紋圖譜共有模式圖，并通過指紋圖譜相似度計(jì)算、指紋圖譜聚類分析、指紋圖譜主成分分析，對(duì)不同產(chǎn)地浙貝母藥材進(jìn)行區(qū)分研究。[結(jié)果]建立了浙貝母藥材指紋圖譜共有模式圖，包含9個(gè)共有特征峰。以共有模式對(duì)21個(gè)不同產(chǎn)地的藥材進(jìn)行指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)，浙江縉云溪丘、永康、江蘇南通浙貝相似度最低(＜0.8)，浙江磐安地區(qū)浙貝相似度最高(＞0.9)。指紋圖譜聚類分析、主成分分析，將不同產(chǎn)地樣品分為3類。[結(jié)論]浙貝母藥材的指紋圖譜分析可以為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一定的理論基礎(chǔ)。

浙貝母；HPLC-ELSD；指紋圖譜；聚類分析；定性分析；產(chǎn)地；質(zhì)量；道地藥材

浙貝母為百合科(Liliaceae)植物浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq．）的干燥鱗莖，味苦，性寒，歸肺心經(jīng)，具有清熱化痰、散結(jié)解毒之功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，浙貝母具有祛痰、鎮(zhèn)咳、抗病原微生物等作用[1]。同時(shí)，現(xiàn)代研究還表明，浙貝母生物堿是其止咳、化痰和平喘等作用的有效成分[2]。故臨床上常用于肺熱痰火咳嗽、心胸郁悶、瘡毒、瘰疬、乳癰、肺癰等癥[3]?，F(xiàn)浙貝母大多采用HPLC進(jìn)行含量測(cè)定和質(zhì)量評(píng)價(jià),本文在篩選出最佳色譜條件的基礎(chǔ)上,采用HPLC-ELSD測(cè)定了21批來自不同產(chǎn)地的浙貝母藥材樣品，得出不同產(chǎn)地浙貝母HPLC-ELSD指紋圖譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似度軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，并通過指紋圖譜聚類分析、主成分分析對(duì)不同產(chǎn)地浙貝母藥材進(jìn)行區(qū)分研究，以期為浙貝母藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Waters1525高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；ELSD檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；Empower 2色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；Hypersil C18(250 mm×4.6mm，5μm)（大連依利特分析儀器有限公司）；KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AR224CN電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；B-220型電熱恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試劑 甲醇（分析純，批號(hào)：08010，上海三鷹化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，批號(hào)：3BA0015，Spectrum Chemical Mfg.Corp.）；氯仿（分析純，批號(hào)：T20080313，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110750-201110，中國(guó)生物制品檢定所）；貝母素甲標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110751-200709，中國(guó)生物制品檢定所）。

1.3 藥材 浙貝母藥材采于浙江磐安、寧波、東陽(yáng)、縉云、永康、江蘇海門、南通等地，并經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張水利教授鑒定為百合科植物浙貝母(Fritillaria thunbergii miq.)的鱗莖（表1）。按2010版藥典《中國(guó)藥典》浙貝母項(xiàng)下規(guī)定加工：取鱗莖，大小分開，洗凈，除去芯芽，趁鮮切成厚片，洗盡干燥，粉碎，過4號(hào)篩，室溫保存。

表1 浙貝母藥材編號(hào)及來源Tab.1 Number and source of Fritillaria thunbergii Miq

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 本實(shí)驗(yàn)色譜條件在前人[4-8]研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化得出。最佳色譜條件為：Hypersil BDS色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；甲醇(含0.05%三乙胺)（A）-水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫0～10min，45%～55% A，10～30min，25%～75%A，30～45min，12%～88%A，45～60min，5%～95%A；流速1.0mL·min-1；蒸發(fā)光散色檢測(cè)器(ELSD)檢測(cè)參數(shù)：漂移管溫度55℃，增益值為2，氮?dú)饬魉?0psi，進(jìn)樣量為20μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 取貝母素甲對(duì)照品、貝母素乙對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，配制成1.0mL含貝母素甲0.20mg、貝母素乙0.22mg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 根據(jù)2010版中國(guó)藥典中浙貝母提取方法稍加改進(jìn)制備供試品溶液。取本品粉末（過四號(hào)篩）約2g，精密稱定，置錐形瓶中，加濃氨水4mL浸潤(rùn)0.5h，精密加入氯仿-甲醇(4:1)的混合溶劑40mL，稱定，混勻，置超聲儀（80W）中超聲1.0h，放冷，再稱定，加上述混合溶劑，補(bǔ)足質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液10ml，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜法（0.45μm）過濾，備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，共有色譜峰（峰1～峰9）的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.0%，相對(duì)峰面積均小于5.0%，表明精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液分別在0、4、6、8、10、12和24h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，共有色譜峰（峰1～峰9）的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3.0%，相對(duì)峰面積均小于5.0%，表明穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次供試品5份，按照供試品制備和檢測(cè)方法制備供試品并分別進(jìn)行檢測(cè)，共有色譜峰（峰1～峰9）的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0%，表明穩(wěn)定性良好。

2.5 浙貝母藥材指紋圖譜的建立 按照中藥指紋圖譜研究技術(shù)要求[9]，對(duì)1～21號(hào)樣品分別檢測(cè)其色譜峰，記錄60min色譜圖。運(yùn)用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)[10]（2004A版）軟件對(duì)21批藥材的色譜峰進(jìn)行匹配并生成共有峰模式圖（圖1）。在浙貝母指紋圖譜上，共有9個(gè)峰是21批浙貝母藥材所共有，因此將其確定為特征指紋色譜峰，并依次編號(hào)1～9，以8號(hào)峰分離度好，作為參照峰，相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)保留面積均設(shè)為1，得到其他各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。見表2、表3。

比較標(biāo)準(zhǔn)品和樣品峰的保留時(shí)間和色譜圖可知，其中8號(hào)和7號(hào)峰分別為貝母素甲和貝母素乙對(duì)照品。貝母素甲和貝母素乙對(duì)照品色譜圖（圖2），空白對(duì)照?qǐng)D見圖3。

2.6 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 以浙貝母共有模式圖譜作為對(duì)照?qǐng)D譜，對(duì)21批浙貝母藥材進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。相似度用Excel軟件，參照文獻(xiàn)《Excel 2002在中藥指紋譜相似度計(jì)算中的應(yīng)用》[11]，分別以相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法計(jì)算浙貝母藥材樣品圖譜與共有模式的相似度，結(jié)果見圖4、表4、表5。

圖1 浙貝母藥材共有峰模式圖Fig.1 Common peak pattern diagram of Fritillaria thunbergii Miq

圖2 貝母素甲和貝母素乙混標(biāo)圖Fig.2 Peimine and peiminine mixed plotting

圖3 空白對(duì)照?qǐng)DFig.3 Blank control chart

圖4 不同產(chǎn)地浙貝母藥材指紋圖譜（n=21，從下到上編號(hào)為1,2,3，……21）Fig.4 Fingerprint of Fritillaria thunbergii Miq from different habitats（from bottom to top numbered 1,2,3，……21）

表2 浙貝母指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 Fingerprint relative retention time of Fritillaria thunbergii Miq

表3 浙貝母指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab.3 Fingerprint relative peak areas of Fritillaria thunbergii Miq

表4 樣品中位數(shù)矢量相似度評(píng)價(jià)Tab.4 Median vector similarity evaluation of samples

表5 樣品平均值矢量相似度評(píng)價(jià)Tab.5 Average vector similarity evaluation of samples

由表4樣品中位數(shù)矢量相似度評(píng)價(jià)結(jié)果可知,按相關(guān)系數(shù)法評(píng)定，第1、18、19批樣品指紋圖譜的相似度在0.70～0.78之間，相似度較低；第15、16、17、21批樣品指紋圖譜的相似度在0.80～0.88之間相對(duì)較低，其余的相似度均在0.90以上,相似度較高。按夾角余弦法評(píng)定，僅第1、15、16、18、19批樣品指紋圖譜的相似度在0.83～0.88之間；其余均在0.90以上,相似度較高?？梢园聪嗨贫冗M(jìn)行區(qū)分。由表5樣品平均值矢量相似度評(píng)價(jià)結(jié)果可知,按相關(guān)系數(shù)法評(píng)定,第1、18、19批樣品指紋圖譜的相似度在0.64～0.73之間，相似度低；第15、16、21批樣品指紋圖譜的相似度在0.85～0.89之間；其余均在0.90以上,相似度較高。按夾角余弦法評(píng)定,僅第1批樣品的相似度在0.80以下,較低；第16、18、19、20批樣品的相似度在0.81～0.89之間；其余均在0.90以上,相似度較高。其中15、20、21批浙貝母鱗莖經(jīng)相關(guān)系數(shù)和夾角余弦計(jì)算后只有一種計(jì)算相似度結(jié)果在0.90以上，因?yàn)橄嚓P(guān)系數(shù)和夾角余弦在原理上有一定的差異性[12]。

2.7 指紋圖譜聚類分析 將上述不同產(chǎn)地浙貝母樣本看作一個(gè)整體，通過比較不同樣本間相對(duì)峰面積變量間的性質(zhì)與特征，即用所有峰的面積除以8號(hào)峰的面積，然后用SPSS18.0軟件對(duì)21個(gè)浙貝母樣本的相對(duì)峰面積標(biāo)量進(jìn)行系統(tǒng)聚類，按歐氏距離進(jìn)行度量，用最小距離法進(jìn)行聚類，其樣本聚類結(jié)果（圖5）。結(jié)果顯示：21批不同產(chǎn)地浙貝母樣品可以聚為三大類，即第15、16批分為I類，第1、2、3、19批為II類，剩余的歸為III類。I類為寧波浙貝母，II為縉云和江蘇南通浙貝母,III類為江蘇海門、永康和東陽(yáng)浙貝與磐安的浙貝母。其中江蘇海門、永康和東陽(yáng)浙貝與磐安的浙貝同聚為III類，可能是由于這些地區(qū)的浙貝母都是從江蘇海門引種的原因；從分類距離上看，即使是相同產(chǎn)地浙貝母也存在一定的差異。個(gè)共有峰的峰面積值用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析（PCA），結(jié)果（圖6）。從圖中可以看出第1、18、19批與第15、16、17批遠(yuǎn)離其他樣品,這些樣品為縉云溪丘、永康、江蘇南通、寧波、東陽(yáng)三聯(lián)鎮(zhèn)浙貝,區(qū)別于其它產(chǎn)地樣品；尤以第1、18、19批浙貝母樣品與其它浙貝母相比,差異較大。結(jié)果還顯示浙貝母樣品集中區(qū)基本為浙江磐安地區(qū)所產(chǎn)，但縉云壺鎮(zhèn)、江蘇海門與其并未能區(qū)分開來。21個(gè)產(chǎn)地浙貝母樣品可大

圖5 樣品聚類分析Fig.5 Cluster analysis of samples

2.8 指紋圖譜主成分分析 將21批浙貝母樣品中9致聚為三類，見圖6，主成分分析其結(jié)果與相似度分析和聚類分析基本一致。

圖6 樣品主成分分析Fig.6 Principal component analysis of samples

由表6可知，前三個(gè)主成分特征值大于1，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到87.422%，說明這三個(gè)主成分包含信息較多，且第一主成分方差貢獻(xiàn)率達(dá)到51.916%，貢獻(xiàn)率最大，包含信息最多。將表7中主成分載荷矩陣中每個(gè)成分的值除以主成分對(duì)應(yīng)的特征值的平方根，得到3個(gè)主成分中每個(gè)峰所對(duì)應(yīng)的系數(shù)，得到表達(dá)式：

F1＝0.4486 X1＋0.2512 X2＋0.4196 X3＋0.3659 X4-0.1109 X5＋0.2913 X6＋0.4561 X7＋0.4501 X8＋0.3106 X9

F2＝-0.3312 X1＋0.5519 X2＋0.3196 X3＋0.4334 X4＋0.2456 X5＋0.1913 X6-0.3442 X7-0.4152 X8＋0.2175 X9F3＝0.0918 X1-0.3517 X2-0.1187 X3＋0.2573 X4＋0.7896 X5＋0.1491 X6＋0.1482 X7＋0.1466 X8＋0.0787 X9

3個(gè)主成分中，F(xiàn)1的特征值最大，最能代表主成分中包含的信息，其中系數(shù)較大的為相對(duì)應(yīng)的X1、X7、X8，相應(yīng)的色譜峰為1、7、8，說明這3個(gè)色譜峰的含量對(duì)于浙貝母質(zhì)量控制起著至關(guān)重要的作用。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用 HPLC-ELSD測(cè)定了21個(gè)不同產(chǎn)地的浙貝母藥材樣品，得到了指紋圖譜共有模式圖，并在這21個(gè)產(chǎn)地內(nèi)進(jìn)行比較，結(jié)合相似度分析、聚類分析以及主成分分析區(qū)分出不同產(chǎn)地間樣品的差異。本方法可為浙貝母藥材的鑒別和質(zhì)量控制提供一定的理論依據(jù)。

本文首次分別以相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法評(píng)定浙貝母藥材樣品圖譜與共有模式的中位數(shù)矢量相似度及樣品平均值矢量相似度。相似度越高說明浙貝母樣品間化學(xué)成分均一性越好。從相似度結(jié)果可知：不同產(chǎn)地浙貝母樣品中化學(xué)成分存在差異，相同產(chǎn)地浙貝母樣品中化學(xué)成分具有良好的相似性，質(zhì)量穩(wěn)定較好；磐安地區(qū)的浙貝母相似度基本在0.9以上質(zhì)量穩(wěn)定較好，縉云溪丘、永康、寧波、江蘇南通浙貝的相似性均小于0.9，指紋圖譜相似度較低原因可能與藥材的生長(zhǎng)環(huán)境與生長(zhǎng)條件有關(guān)。這進(jìn)一步證實(shí)了藥材的道地性之說。結(jié)果還表明,中位數(shù)矢量法和平均數(shù)矢量法的結(jié)果稍有差異，均可以看出1、18、19號(hào)樣品相似度最低,說明其化學(xué)成分均一性最差。

本實(shí)驗(yàn)將21批不同產(chǎn)地浙貝母樣品可以聚為三大類，即15、16分為I類，1、2、3、19為II類，剩余的歸為III類。I類為寧波浙貝母，II為縉云和江蘇南通浙貝母，III類為江蘇海門、永康和東陽(yáng)浙貝與磐安的浙貝母。較相似度分析，聚類分析沒能將縉云和南通產(chǎn)地浙貝區(qū)分開，據(jù)筆者實(shí)地考察，縉云、永康、磐安、東陽(yáng)產(chǎn)地浙貝母的母種均是從江蘇購(gòu)買，這個(gè)在相似度分析中沒有能夠很好地體現(xiàn)出來，而寧波浙貝母則是農(nóng)戶自己留種，可能是這個(gè)原因使得相似度分析和聚類分析均將寧波浙貝母分別出來，而從江蘇引種到浙江環(huán)境上的改變對(duì)浙貝母的影響比較顯著，像浙江縉云產(chǎn)地浙貝母。不同產(chǎn)地浙貝母生理生化特性存在差異，所含微量元素也有差異，加上不同產(chǎn)地其環(huán)境不同可能會(huì)導(dǎo)致其有效成分的含量差異[13-14]。但其種源引自浙江，故其差異性多是受環(huán)境影響而形成，引種時(shí)間越久其種間會(huì)越來越凸顯出差異，剛引種到一個(gè)新的環(huán)境，由于要適應(yīng)新環(huán)境也可能會(huì)造成比較大的差異。主成分分析中得出色譜峰1、7、8為主要色譜峰，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可知，7、8分別為貝母素乙、貝母素甲，其中色譜峰1有待進(jìn)一步確定。21批浙貝母樣品通過聚類方法被聚為三類，與相似度分析和主成分分析結(jié)果基本一致，由此可見，該聚類譜系從一定程度上可以反映出浙貝母藥材質(zhì)量與道地產(chǎn)地及種源的相關(guān)性。

表6 浙貝母主成分分析特征值與貢獻(xiàn)率Tab.6 Eigenvalue and contribution rate of Fritillaria thunbergii Miq cluster analysis

表7 浙貝母成分分析結(jié)果因子載荷矩陣Tab.7 Factor loading matrix of Fritillaria thunbergii Miq component analysis results

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Study on HPLC-ELSD Fingerprint of Fritillaria Thunbergii from Different Places

ZHU Guanglei,SUI Ning,ZHANG Chunchun,et al
Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou(310053)，China

[Objective]To establish the HPLC-ELSD fingerprint of Fritillaria thunbergii from different places,providing a reliable method for scientific evaluation and effective control of its quality.[Methods]Fritillaria thunbergii samples from 21 different places were determined by HPLC-ELSD to establish fingerprint common pattern,and through the analysis of fingerprint similarity calculation and clustering,principal component analysis to distinguish Fritillaria thunbergii from different places.[Results]Common pattern of Fritillaria thunbergii Miq is established,which includes 9 common peaks,similarity evaluation of the 21 Fritillaria thunbergii from different places in common mode indicates similarity of Fritillaria thunbergii from Zhejiang Jinyun,Yongkang, Jiangsu Nantong is lowest(＜0.8),Fritillaria thunbergii from Zhejiang Pan'an is highest(＞0.9).In cluster analysis and principal component analysis,the samples from different places are divided into 3 groups.[Conclusion]The fingerprint of Fritillaria thunbergii can provide some theoretical basis for its quality evaluation.

Fritillaria thunbergii Miq;HPLC-ELSD;fingerprint;cluster analysis;qualitative analysis;producing areas;quality;famous region drug

R282.71

：A

：1005-5509（2017）05-0352-10

10.16466/j.issn1005-5509.2017.05.002

2017-01-11）

中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（2060302）；國(guó)家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)（201407002）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81603222）

Fund projects:Significant increase and decrease of the central level projects（2060302）;National scientific research project of national traditional Chinese medicine(201407002);National Natural Science Foundation of China（81603222）

張水利，E-mail：zhang_shuili@163.com