陳盛火 張 權(quán) Mwanza Christopher 吳 彥 段彩靈 鄧慧華

(東南大學(xué)兒童發(fā)展與學(xué)習(xí)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210096)(東南大學(xué)學(xué)習(xí)科學(xué)研究中心, 南京 210096)

唾液及頭發(fā)中內(nèi)源性大麻素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)

陳盛火 張 權(quán) Mwanza Christopher 吳 彥 段彩靈 鄧慧華

(東南大學(xué)兒童發(fā)展與學(xué)習(xí)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210096)(東南大學(xué)學(xué)習(xí)科學(xué)研究中心, 南京 210096)

基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀建立了檢測(cè)唾液和頭發(fā)中花生四烯酸乙醇氨(AEA)和2-花生四烯酸甘油(2-AG)含量的方法,并用于檢測(cè)157名在校大學(xué)生唾液和頭發(fā)中的AEA和2-AG,探討AEA和2-AG對(duì)性別和肥胖的影響.唾液中的待測(cè)物采用乙酸乙酯液液萃取提純;頭發(fā)中的待測(cè)物經(jīng)甲醇孵育,用固相萃取柱萃取提純.在大氣壓化學(xué)電離正離子模式和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式下進(jìn)行定性測(cè)試,以外標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)試.方法驗(yàn)證結(jié)果顯示,唾液AEA,2-AG檢測(cè)限分別為0.07和0.40 ng/mL;頭發(fā)AEA,2-AG檢測(cè)限分別為0.7和3.2 pg/mg;日內(nèi)、日間變異系數(shù)均小于15%,回收率為97.9%～108.0%.人群研究結(jié)果表明,肥胖者唾液和頭發(fā)AEA,2-AG含量均顯著高于非肥胖者(p<0.010);男性唾液2-AG含量顯著低于女性(p<0.050),但AEA含量沒(méi)有性別差異(p=0.844);男性頭發(fā)2-AG含量顯著高于女性(p<0.010),但AEA含量沒(méi)有性別差異(p=0.456).

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;AEA;2-AG;唾液;頭發(fā)

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)是由內(nèi)源性大麻素(eCBs),大麻素受體(CB1和CB2),與eCBs合成、降解及轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的酶類共同組成的信號(hào)系統(tǒng),該系統(tǒng)對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織具有廣泛的作用,可以調(diào)控一系列生理和心理功能[1].目前,研究最多的內(nèi)源性大麻素物質(zhì)是花生四烯酸乙醇氨(AEA)和2-花生四烯酸甘油(2-AG),它們均具有與四氫大麻酚極為相似的三維結(jié)構(gòu),都能作用于CB1和CB2受體.CB1受體主要位于腦、脊髓與外周神經(jīng)系統(tǒng)中,這種分布可能與大麻素對(duì)記憶、認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)控制的調(diào)節(jié)有關(guān);CB2受體不存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,它主要分布于外周免疫細(xì)胞,與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[2].

實(shí)驗(yàn)中用于測(cè)定人體內(nèi)源性大麻素含量、采樣無(wú)應(yīng)激的生物基質(zhì)主要有唾液和頭發(fā).然而,唾液和頭發(fā)中內(nèi)源性大麻素含量非常低,對(duì)檢測(cè)方法要求較高.目前,主要采用靈敏度高的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法進(jìn)行檢測(cè)[3].唾液檢測(cè)方法檢測(cè)限高、耗時(shí)且前處理過(guò)程繁瑣.例如,Lam等[4-5]建立的分析方法檢測(cè)限高,無(wú)法定量檢測(cè)人類唾液中的內(nèi)源性大麻素;Matias等[6]雖然成功檢測(cè)出人體內(nèi)唾液中內(nèi)源性大麻素,但沒(méi)有給出樣品前處理及方法驗(yàn)證等詳細(xì)信息;Prestifilippo等[7-8]通過(guò)3次液液萃取,成功檢測(cè)出大鼠和狗唾液中內(nèi)源性大麻素,但是該方法耗時(shí)且前處理過(guò)程繁瑣.Krumbholz 等[9]建立了用于檢測(cè)頭發(fā)樣品中AEA,2-AG的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法,但存在著前處理過(guò)程復(fù)雜耗時(shí)、樣品用量較多、堿性條件下的提純過(guò)程易導(dǎo)致2-AG,o-AEA轉(zhuǎn)化等缺點(diǎn).Mwanza 等[10]在中性環(huán)境下提純待測(cè)物,減少了2-AG的異構(gòu)化及o-AEA轉(zhuǎn)化成AEA的可能性.

本文提出了一種樣品使用量較少、靈敏度較高的唾液和頭發(fā)中內(nèi)源性大麻素檢測(cè)方法,并利用上述方法檢測(cè)157名在校大學(xué)生唾液和頭發(fā)中的內(nèi)源性大麻素,探討性別和肥胖對(duì)內(nèi)源性大麻素含量的影響.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑包括AEA、2-AG標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%,美國(guó)西格瑪奧德里奇公司)、甲醇(色譜純,美國(guó)西格瑪奧德里奇公司)、甲酸、乙酸銨(色譜純,美國(guó)天地公司)和去離子蒸餾水.

實(shí)驗(yàn)儀器包括API 3200 Q-TRAP型質(zhì)譜儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)和Agilent 1200型液相色譜儀 (美國(guó)安捷倫科技公司).

1.2 唾液及頭發(fā)樣品采集

采集南京某大學(xué)157名在校大學(xué)生的唾液和頭發(fā)樣品.

唾液樣品采集過(guò)程如下:采樣前先用清水漱口,約5 min后,自行收集大約2 mL的唾液于4 mL塑料離心管中,做好標(biāo)記,放入冰箱(-60 ℃)保存.

頭發(fā)樣品采集過(guò)程如下:采集后枕部貼頭皮1 cm的頭發(fā),將其裝入干燥的密封袋中并做好標(biāo)記,放入冰箱(-60 ℃)保存.

1.3 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

1.3.1 唾液及頭發(fā)樣品預(yù)處理過(guò)程

唾液樣品預(yù)處理過(guò)程如下:① 取出唾液樣品,避光解凍;② 將唾液樣品搖勻30 s,并于離心機(jī)中1.2×104r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min,用移液器取500 μL上清唾液,放入2 mL塑料離心管,加入1 mL乙酸乙酯,渦旋2 min;③ 將裝有溶液的離心管于1.2×104r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min,用移液器移取800 μL上清液并放入新試管中;④ 將離心管中的上清液在50 ℃氮?dú)鈼l件下吹干,并用50 μL的流動(dòng)相溶液重新溶解,以備進(jìn)樣.

頭發(fā)樣品預(yù)處理過(guò)程如下:① 將采集的頭發(fā)樣品用5 mL甲醇清洗2次,置于烘箱中烘干,將烘干后的頭發(fā)剪碎,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的頭發(fā)樣品;② 將頭發(fā)樣品移入2 mL的離心管中,加入1 mL甲醇于25 ℃的水浴環(huán)境中孵育24 h;③ 將裝頭發(fā)的離心管取出孵育箱,于1.2×104r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min,取800 μL上清液于新試管中,并在50 ℃氮?dú)鈼l件下吹干;④ 將50 μL甲醇加入試管,混合搖勻2 min,加1 mL水將吹干的殘留物重新溶解;⑤ 將試管中重溶后的溶液加入活化后的固相萃取柱(SPE)進(jìn)行萃取,并用800 μL甲醇洗脫,洗脫液滴入新離心管中;⑥ 將離心管中的溶液在50 ℃氮?dú)鈼l件下吹干,用流動(dòng)相溶液定容到50 μL,待進(jìn)樣.

1.3.2 液相色譜與質(zhì)譜條件

實(shí)驗(yàn)色譜柱選用迪馬Platisiltm ODS-C18,長(zhǎng)度為150 mm,內(nèi)徑為4.6 mm,填料粒徑為5 μm.色譜柱預(yù)柱選用迪馬C18柱,長(zhǎng)度為10 mm,內(nèi)徑為4.6 mm,填料粒徑為5 μm.流動(dòng)相由90%的甲醇及10%的水溶液組成(乙酸銨濃度為2 mmol/L,pH=4.5).流動(dòng)相配制完成后用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾及超聲儀超聲去除氣泡.流速為500 μL/min;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為20 μL.

優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如下:離子化方式為大氣壓化學(xué)電離(APCI)正離子,檢測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè),離子化源溫度為450 ℃,霧化氣壓強(qiáng)為310.3 kPa,氣簾氣壓強(qiáng)為137.9 kPa,霧化電流為4.0 μA.質(zhì)譜碰撞氣設(shè)定為Medium.待測(cè)物檢測(cè)離子對(duì)及其對(duì)應(yīng)的離子化條件見(jiàn)表1.

表1 AEA,2-AG離子對(duì)和質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 頭發(fā)樣品使用量?jī)?yōu)化

取同一被試緊貼頭皮頭發(fā)樣品,準(zhǔn)確稱取頭發(fā)質(zhì)量m=10,15,20 mg.按照1.3節(jié)所述的方法進(jìn)行樣品前處理和HPLC-MS/MS測(cè)定,得到如圖1所示的色譜圖.由圖可知,當(dāng)樣品量為10 mg時(shí),AEA不能檢出,2-AG信號(hào)強(qiáng)度不高且干擾峰較多;當(dāng)樣本量為15和20 mg時(shí),2種物質(zhì)均能被檢出,峰型較好.因此,15 mg被選定為最終的實(shí)驗(yàn)樣品量.

(a) m=10 mg

(b) m=15 mg

(c) m=20 mg

2.2 色譜圖

選取待測(cè)物AEA和2-AG濃度小于檢測(cè)限的唾液和頭發(fā)作為唾液和頭發(fā)空白樣品.將50 μL質(zhì)量濃度為1.0 ng/mL AEA和5.0 ng/mL 2-AG的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別加入唾液和頭發(fā)空白樣品中,按照1.3節(jié)所述的方法進(jìn)行頭發(fā)樣品前處理和HPLC-MS/MS測(cè)定,得到如圖2所示的色譜圖.由圖可知,AEA出峰時(shí)間約為11.9 min,2-AG出峰時(shí)間約為13.0 min;唾液和頭發(fā)中AEA,2-AG在出峰時(shí)間內(nèi)無(wú)干擾峰.

(a) 唾液

2.3 唾液檢測(cè)中的線性范圍、精密度和回收率

取5份500 μL唾液空白樣品分別放入5個(gè)試管中,每份加入50 μL質(zhì)量濃度為2.0 ng/mL AEA和50.0 ng/mL 2-AG的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及1 mL乙酸乙酯溶液,按照1.3節(jié)所述的方法進(jìn)行唾液樣品前處理和HPLC-MS/MS測(cè)定.實(shí)驗(yàn)連續(xù)重復(fù)3 d,每天測(cè)定5份平行樣,用于評(píng)價(jià)方法的精密度和回收率,結(jié)果見(jiàn)表2.由表可知,唾液AEA,2-AG檢測(cè)限分別為0.07和0.40 ng/mL,定量限分別為0.2和1.3 ng/mL,回收率分別為108.0%和105.2%,日內(nèi)、日間變異系數(shù)均小于15%.由此表明,該方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性均符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求.

表2 唾液HPLC-MS/MS方法參數(shù)

2.4 頭發(fā)檢測(cè)中的線性范圍、精密度和回收率

取5份15 mg頭發(fā)空白樣品分別放入5個(gè)試管中,每份加入50 μL質(zhì)量濃度為2.0 ng/mL AEA和50.0 ng/mL 2-AG的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及1 mL甲醇溶液,按照1.3節(jié)所述的方法進(jìn)行頭發(fā)樣品前處理和HPLC-MS/MS測(cè)定.實(shí)驗(yàn)連續(xù)重復(fù)3 d,每天測(cè)定5份平行樣,用于評(píng)價(jià)方法的精密度和回收率,結(jié)果見(jiàn)表3.由表可知,頭發(fā)AEA,2-AG檢測(cè)限分別為0.7和3.2 pg/mg,定量限分別為2.1和10.9 pg/mg,回收率分別為97.9%和100.1%,日內(nèi)、日間變異系數(shù)均小于15%.由此表明,該方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性均符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求.

表3 頭發(fā)HPLC-MS/MS方法參數(shù)

2.5 頭發(fā)樣品和唾液樣品的檢測(cè)與應(yīng)用

下面運(yùn)用HPLC-MS/MS方法檢測(cè)157名在校大學(xué)生唾液和頭發(fā)樣品中AEA和2-AG含量.157名學(xué)生包括男性102名,女性55名;提供頭發(fā)樣品共計(jì)123人,其中肥胖者17人;提供唾液樣品共計(jì)127人,其中肥胖者16人.文獻(xiàn)[10]指出,正常人群與瘦子人群體內(nèi)AEA和2-AG含量無(wú)差異.將身體質(zhì)量指數(shù)大于等于28 kg/m2的人歸為肥胖人群,身體質(zhì)量指數(shù)小于 28 kg/m2的人歸為非肥胖人群.采用獨(dú)立樣品Z檢驗(yàn)方法,檢測(cè)AEA,2-AG在肥胖人群和非肥胖人群、男性及女性唾液和頭發(fā)中的含量是否存在差異.當(dāng)統(tǒng)計(jì)量p<0.050時(shí),數(shù)據(jù)顯著性被接受.人群研究結(jié)果表明,肥胖者唾液中AEA含量顯著高于非肥胖者(Z=-3.524,p<0.001),2-AG含量也顯著高于非肥胖者(Z=-2.899,p=0.004);肥胖者頭發(fā)中AEA含量顯著高于非肥胖者(Z=-2.682,p=0.007),2-AG含量也顯著高于非肥胖者(Z=-2.778,p=0.005);男性唾液2-AG含量顯著低于女性(Z=-2.150,p=0.032),AEA含量差異不顯著(Z=-0.196,p=0.844);男性頭發(fā)中2-AG含量高于女性(Z=-3.123,p=0.002),AEA含量差異不顯著(Z=-0.745,p=0.456).2-AG含量高于女性(Z=-3.123,p=0.002),AEA含量差異不顯著(Z=-0.745,p=0.456).本研究中關(guān)于肥胖與內(nèi)源性大麻素之間的關(guān)系結(jié)論與文獻(xiàn)[6,10]的結(jié)果一致,性別與頭發(fā)2-AG含量的結(jié)果與文獻(xiàn)[10]結(jié)果一致,從而間接證明了所提方法的準(zhǔn)確性.

2.6 討論

較之以往的檢測(cè)方法,本文所提方法具有以下優(yōu)勢(shì):① 檢測(cè)限低,靈敏度高.本文方法的頭發(fā)AEA和2-AG檢測(cè)限分別為0.7和2.1 pg/mg,而文獻(xiàn)[10]方法的檢測(cè)限為1.5 和3.0 pg/mg,文獻(xiàn)[9]中方法的2-AG檢測(cè)限為15 pg/mg.本文方法能夠定量檢測(cè)98%唾液樣品中AEA和2-AG的含量,相比之下,文獻(xiàn)[4-5]方法由于具有高的檢測(cè)限,故無(wú)法定量檢測(cè)人體唾液中的內(nèi)源性大麻素濃度.② 樣品預(yù)處理過(guò)程簡(jiǎn)單.采用本文方法時(shí)唾液預(yù)處理僅使用了1次液液萃取,而文獻(xiàn)[7-8]中方法則需要使用3次液液萃取.③ 頭發(fā)樣品使用量少,僅為15 mg,文獻(xiàn)[9-10]中則分別為50和20 mg.

上述優(yōu)勢(shì)的獲得主要在于本研究進(jìn)行以下幾方面的改進(jìn):① 以往研究中使用了ESI離子化源[4-5,9],更適合分析極性較大的分析物,而AEA和2-AG屬于弱極性物質(zhì),且比皮質(zhì)醇等激素更弱[10],因此,本文采用了更適合弱極性物質(zhì)分析的APCI離子化源.② 以往研究多用乙腈作為流動(dòng)相中的有機(jī)相[4-5],而文獻(xiàn)[11]指出AEA和2-AG的離子化效率在甲醇為流動(dòng)相的環(huán)境下是乙腈的10倍,因此,本文采用甲醇作為有機(jī)相,使AEA和2-AG的離子化效率更高.③ 文獻(xiàn)[9]的研究結(jié)果表明,在堿性條件下提純易使2-AG轉(zhuǎn)化為1-AG或3-AG,o-AEA轉(zhuǎn)化為AEA.本文選擇在中性條件下提純唾液和頭發(fā)中的內(nèi)源性大麻素,減少了2-AG轉(zhuǎn)化為1-AG或3-AG及o-AEA轉(zhuǎn)化為AEA的可能性.

3 結(jié)論

1) 建立了一種同時(shí)檢測(cè)唾液和頭發(fā)中AEA，2-AG含量的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析方法.該方法靈敏度更高，樣品使用量更少，有利大規(guī)模樣本研究.本研究中待測(cè)物與外源性大麻素分子結(jié)構(gòu)極為相似，這對(duì)外源性大麻素檢測(cè)方法的建立具有借鑒作用.

2) 所提分析方法的日內(nèi)、日間變異系數(shù)均小于15%，回收率為97.9%～108.0%，符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求，可應(yīng)用于AEA和2-AG含量較低的唾液和頭發(fā)等生物基質(zhì)的分析中.

3) 人群檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，性別和肥胖均會(huì)影響AEA和2-AG的含量.

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Detection of endocannabinoids in saliva and hair by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

Chen Shenghuo Zhang Quan Mwanza Christopher Wu Yan Duan Cailing Deng Huihua

(Key Laboratory of Child Development and Learning Science of Ministry of Education, Southeast University, Nanjing 210096, China)(Research Center of Learning Science, Southeast University, Nanjing 210096, China)

A new method based on high performance-liquid chromatography tandem mass spectrometry was developed for quantification of N-arachidonoyl-ethanolamine (AEA) and 2-arachidonoyl-glycerol (2-AG) in saliva and hair. This method was used for 157 healthy undergraduate students to explore the influences of gender and obesity on the contents of AEA and 2-AG. The analysts in saliva were extracted by liquid-liquid extraction with ethyl acetate and those in hair were purified by solid phase extraction with methanol. The qualitative tests were carried out with atmosphere pressure chemical ionization in the positive mode and multiple reaction monitoring, while the quantitative tests were performed with the external standard method. The method validation results reveal that the detection limits for saliva AEA and 2-AG are 0.07 and 0.40 ng/mL, respectively, and those for hair AEA and 2-AG are 0.7 and 3.2 pg/mg, respectively. The intra-day and inter-day coefficients of variation are less than 15% and the recovery ranges from 97.9% to 108.0%. The population analysis results show that the contents of AEA and 2-AG of salivary and hair of the obese individuals are significantly than those of the non-obese ones (p<0.010). The contents of saliva 2-AG of males are obviously lower than those of females (p<0.050), but no gender difference in AEA content is observed (p=0.844). The contents of hair 2-AG of males are obviously higher than those of females (p<0.01), but there is no significant gender difference in hair AEA (p=0.456).

high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; N-arachidonoyl-ethanolamine(AEA); 2-arachidonoylglycerol(2-AG); saliva; hair

10.3969/j.issn.1001-0505.2017.03.020

2016-10-26. 作者簡(jiǎn)介: 陳盛火(1990—),男,碩士生;鄧慧華(聯(lián)系人),男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,dengrcls@seu.edu.cn.

教育部人文社會(huì)科學(xué)研究一般資助項(xiàng)目(15YJAZH009)、江蘇省社會(huì)科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(15GLB017)、江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目(KYZZ15_0054)

陳盛火,張權(quán),Mwanza Christopher,等.唾液及頭發(fā)中內(nèi)源性大麻素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2017,47(3):534-538.

10.3969/j.issn.1001-0505.2017.03.020.

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