唐瑤 包曉霞 魯周南 薛曉鷗

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·論著·

“連花湯”正丁醇提物對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

唐瑤 包曉霞 魯周南 薛曉鷗

目的 研究“連花湯”正丁醇提物對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為臨床應(yīng)用“連花湯”治療子宮內(nèi)膜癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 提取物從10 mg/mL依次降濃度梯度至0.078125 mg/mL分成8組，即：10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL、0.15625 mg/mL、0.078125 mg/mL組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率；分別計(jì)算出兩種細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 “連花湯”正丁醇提物在不同濃度、不同時(shí)間里對(duì)2種內(nèi)膜癌細(xì)胞系的增殖有顯著抑制作用。其中，作用24小時(shí)、48小時(shí)，HEC-1A細(xì)胞1.25 mg、0.625 mg、0.3125 mg組間細(xì)胞抑制率有顯著性差異(P<0.01)；Ishikawa細(xì)胞5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL、0.15625 mg/mL組間細(xì)胞抑制率有顯著性差異(P<0.01)；作用24小時(shí)，HEC-1A細(xì)胞、Ishikawa細(xì)胞10 mg、5 mg、0.625 mg、0.078125 mg組間細(xì)胞抑制率有顯著性差異(P<0.01)。與正常組相比，“連花湯”正丁醇提物細(xì)胞凋亡率顯著增高，差異顯著。其中，HEC-1A細(xì)胞：高劑量組0.4 mg/mL、中劑量組0.2 mg/mL、低劑量組0.1 mg/mL與正常組比較，細(xì)胞凋亡率有顯著性差異(P<0.01)；Ishikawa細(xì)胞：Ishikawa 高劑量組1.0 mg/mL、中劑量組0.5 mg/mL、低劑量組0.25 mg/mL與正常組比較，細(xì)胞凋亡率有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論 “連花湯”正丁醇提物能有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

子宮內(nèi)膜癌； “連花湯”正丁醇提物； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一。在中國(guó)，其發(fā)病率僅次于宮頸癌，約占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20%～30%，占女性全身惡性腫瘤的7%[1]。根據(jù)子宮內(nèi)膜癌的臨床特點(diǎn)和預(yù)后將其分為2型:Ⅰ型為雌激素依賴型，Ⅱ型為非雌激素依賴型[2]。Ishikawa細(xì)胞是ER陽(yáng)性子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系,HEC-1A細(xì)胞為ER低表達(dá)細(xì)胞系。目前子宮內(nèi)膜癌的治療原則是以手術(shù)為主，輔以放療、化療、內(nèi)分泌治療及生物治療等[3]。

前期研究發(fā)現(xiàn)[4]，中藥復(fù)方“連花湯”中部分單體多糖能通過(guò)抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞即Ⅰ型雌激素依賴型中TAMS活化下調(diào)TLR4/MYD88信號(hào)通路表達(dá),抑制TAMS的活化，從而起到抗子宮內(nèi)膜癌的作用。而“連花湯”對(duì)Ⅱ型非雌激素依賴型HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究即以清熱解毒方“連花湯”復(fù)方正丁醇提取物分別作用于2種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系，觀察其對(duì)兩種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，檢驗(yàn)相互之間是否有差異，為臨床提供實(shí)驗(yàn)學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞由北京大學(xué)人民醫(yī)院婦科實(shí)驗(yàn)室友情贈(zèng)送。

1.2 藥物與試劑

“連花湯”正丁醇提取物制備：中藥復(fù)方“連花湯”：黃連10 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g、生黃芪20 g，5劑，采購(gòu)自東直門(mén)醫(yī)院中草藥房，于北京大學(xué)天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)藥室以正丁醇萃取，烘箱烘干，密封，冰箱4攝氏度保存。胎牛血清購(gòu)自Gibco，DMEM 購(gòu)自Hyclone，MTS試劑購(gòu)自Promega，凋亡試劑購(gòu)自BD公司。

1.3 儀器設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)，垂直超凈工作臺(tái)(Esco公司)，節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝生物科技有限公司)，倒置熒光顯微鏡(北京銳馳恒業(yè)儀器科技有限公司)、流式細(xì)胞儀(Epics Elite ESP型，美國(guó)Coulter公司)。

1.4 方法

1.4.1 MTS法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖情況及計(jì)算IC50值 將Ishikawa及HEC-1A于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件在5%CO2、37℃及飽和濕度下進(jìn)行，以1×104cells/well接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，將“連花湯”正丁醇提取物溶解在含0.1%DMSO的培養(yǎng)液中，配成20 mg/mL的母液，于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用DMEM培養(yǎng)液稀釋。MTT檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖情況，被試藥物被稀釋為8個(gè)濃度梯度，即：10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL、0.15625 mg/mL、0.078125 mg/mL。實(shí)驗(yàn)分為18個(gè)組:Ishikawa 8個(gè)藥物濃度組和對(duì)照組(培養(yǎng)液+細(xì)胞)；HEC-1A組8個(gè)藥物濃度組和對(duì)照組(培養(yǎng)液+細(xì)胞)，分別作用24、48小時(shí)。在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)棄原培養(yǎng)基，加入16組干預(yù)藥物工作液100 μL/孔。16組細(xì)胞處理24、48小時(shí)(每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔)后，棄藥物工作液及對(duì)照組培養(yǎng)基，每孔加入MTS溶液(5 g/L)20 μL+80 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4小時(shí)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處讀取每孔的吸光度(OD)值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率(%)=(1-加藥組測(cè)定的平均OD 值/對(duì)照孔測(cè)定的平均OD 值)×100%，繪制細(xì)胞抑制率曲線。1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 根據(jù)MTT計(jì)算細(xì)胞IC50值，分別計(jì)算兩種細(xì)胞系給藥濃度，分為高劑量組(IC50組)、中劑量組(1/2 IC50)、低劑量組(1/4 IC50組)，HEC-1A：高劑量組0.4 mg/mL、中劑量組0.2 mg/mL、低劑量組0.1 mg/mL、正常組及陽(yáng)性對(duì)照組；Ishikawa 高劑量組1.0 mg/mL、中劑量組0.5 mg/mL、低劑量組0.25 mg/mL，正常組及陽(yáng)性對(duì)照組。各組細(xì)胞加藥干預(yù)24小時(shí)后收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞凋亡，培養(yǎng)基+細(xì)胞組作為空白對(duì)照。200 μ binding buffer重懸細(xì)胞加入10 μL Annexin V和4 μL propidium iodide，室溫中避光孵育30分鐘，最后加入300 μL binding buffer，1小時(shí)內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Cell Quest軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 “連花湯”正丁醇提物對(duì)HEC-1A及Ishikawa細(xì)胞增殖影響

HEC-1A及Ishikawa兩種細(xì)胞系多組間抑制率進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(時(shí)間，濃度)，HEC-1A、Ishikawa兩組細(xì)胞隨時(shí)間和藥物濃度的增加，細(xì)胞的抑制率增加。不同時(shí)間，不同濃度組之間差異不同，見(jiàn)表1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)“連花湯”正丁醇提物對(duì)HEC-1A及Ishikawa細(xì)胞凋亡影響

Probit法用于計(jì)算IC50，細(xì)胞凋亡各組間采用單因素方差分析LSD法進(jìn)行組間兩兩比較。見(jiàn)表2。

2.3 “連花湯”正丁醇提物對(duì)HEC-1A及Ishikawa細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖

圖1～4所示細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果，其中Q1為死亡細(xì)胞，Q2為晚期凋亡細(xì)胞，Q3為活細(xì)胞，Q4為早期凋亡細(xì)胞，Q2+Q4即為各組細(xì)胞總凋亡率。從所有結(jié)果中選擇四組作為示例，結(jié)果可見(jiàn)，“連花湯”正丁醇給藥組HEC-1A、Ishikawa細(xì)胞凋亡率與陰性對(duì)照組比較差異有顯著性。

表1 “連花湯”正丁醇提物對(duì)Ishikawa及HEC-1A細(xì)胞 抑制率(%)的比較

注： HEC-1A細(xì)胞作用24小時(shí)、48小時(shí)兩組間比較，1.25 mg、0.625 mg、0.3125 mg組間有差異，aP<0.01；Ishikawa細(xì)胞作用24小時(shí)、48小時(shí)兩組間比較，5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL、0.15625 mg/mL組間有差異，bP<0.01；HEC-1A細(xì)胞、Ishikawa細(xì)胞作用24小時(shí)，兩組間比較10 mg、5 mg、0.625 mg、0.078125 mg組間有差異，cP<0.01。

表2 “連花湯”正丁醇提物對(duì)Ishikawa及HEC-1A細(xì)胞 凋亡率(%)的比較

注： HEC-1A細(xì)胞：高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與正常組比較，aP<0.01；低劑量組與高劑量組、中劑量組比較，bP<0.05；Ishikawa細(xì)胞：高劑量組、中劑量組、低劑量組與正常組比較，cP<0.05。三個(gè)組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，dP<0.01。

圖2 HEC-1A細(xì)胞凋亡正常對(duì)照組

圖3 Ishikawa細(xì)胞凋亡“連花湯”正丁醇提物 中劑量給藥組0.5 mg/mL

圖4 Ishikawa細(xì)胞凋亡正常對(duì)照組

3 討論

3.1 連花湯醇提物能有效抑制Ishikawa及HEC-1A的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

從MTT來(lái)看，“連花湯”正丁醇提物均能有效抑制Ishikawa及HEC-1A的增殖，呈明顯時(shí)間依賴性，而從細(xì)胞凋亡來(lái)看，沒(méi)有明顯劑量依賴，HEC-1A細(xì)胞藥物中等濃度凋亡率高于高等濃度，然兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ishikawa細(xì)胞也是中等濃度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率最高，而三者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因，其一可能在凋亡實(shí)驗(yàn)中高劑量用藥濃度并未被完全利用，中等劑量就能誘導(dǎo)大部分細(xì)胞凋亡。其二，可能與重復(fù)次數(shù)少有關(guān)，今后實(shí)驗(yàn)可以加大樣本量及重復(fù)次數(shù)，再做統(tǒng)計(jì)。

3.2 “連花湯”正丁醇提物對(duì)HEC-1A細(xì)胞藥效優(yōu)于Ishikawa細(xì)胞

對(duì)Ishikawa及HEC-1A兩個(gè)細(xì)胞系之間比較，“連花湯”正丁醇提物在較高劑量組間的抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在中等劑量間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與MTT的精確度不高有關(guān)，從凋亡的結(jié)果來(lái)看，“連花湯”正丁醇提物對(duì)HEC-1A效果要好，最佳藥效濃度在0.2 mg/mL，而Ishikawa最佳藥效濃度在0.5 mg/mL。

3.3 “連花湯”正丁醇提物對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抑制可能不通過(guò)ER受體表達(dá)通路

既往研究發(fā)現(xiàn)中藥有效成分對(duì)子宮內(nèi)膜癌作用機(jī)制大致為影響雌激素受體拮抗雌激素作用，引起癌細(xì)胞DNA損傷，阻滯癌細(xì)胞周期，抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，影響子宮內(nèi)膜癌侵襲力，抑制子宮內(nèi)膜癌新生血管生成及逆轉(zhuǎn)耐藥性等[5]。Ishikawa為ER陽(yáng)性子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系,HEC-1A為ER低表達(dá)細(xì)胞系，達(dá)到同樣的抑制率Ishikawa所需“連花湯”正丁醇提物藥物濃度比HEC-1A要高很多。因此可以推測(cè)“連花湯”正丁醇提物對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抑制機(jī)制可能不通過(guò)ER受體表達(dá)通路影響，而是通過(guò)其他機(jī)制作用。具體通過(guò)哪種機(jī)制作用，有待進(jìn)一步細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)及信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)研究探討。

中醫(yī)藥治療子宮內(nèi)膜癌強(qiáng)調(diào)以“扶正祛邪、攻補(bǔ)兼施”為總則?！斑B花湯”以黃連、白花蛇舌草、半枝蓮清熱解毒，生黃芪益氣扶正，可以彌補(bǔ)手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療的不足。手術(shù)固然能切除癌腫，但還有殘癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管中癌栓存在等，運(yùn)用中醫(yī)中藥術(shù)后長(zhǎng)期治療，可以防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；放療、化療治療對(duì)消化道和造血系統(tǒng)有一定的毒副作用，損傷機(jī)體正氣，運(yùn)用中醫(yī)中藥治療既能提高機(jī)體正氣加強(qiáng)放療、化療的效果，又能減輕放、化療的毒副作用，對(duì)于晚期子宮內(nèi)膜癌癥患者或不能手術(shù)和放療、化療的患者可以采用中醫(yī)中藥治療[6]。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了一定基礎(chǔ)，本方對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前、術(shù)后的治療均有重要的參考價(jià)值。

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(本文編輯： 禹佳)

Effect of N-butanolextract fromLianhuadecoction on proliferation and apoptosis of human endometrial cancer cell

TANGYao，BAOXiaoxia，LUZhounan，etal.

DongzhimenHospitalBejingUniversityofChineseMedicine，Beijing100700,China

XUEXiaoou,E-mail:Pro_xue@163.com

Objective To investigate the effect of N-butanol extract fromLianhuadecoction on proliferation and apoptosis of human endometrial cancer cell, and provide the experimental evidence of endometrial cancer treatment.Methods N-butanol extract fromLianhuadecoction was divided into 10 mg/mL,5 mg/mL,2.5 mg/mL,1.25 mg/mL,0.625 mg/mL,0.3125 mg/mL,0.15625 mg/mL,0.078125 mg/mL gourps. Half inhibition concentration(IC50) of cell was calculated, apoptosis rate was detected by flow cytometry.Results N-butanol extract fromLianhuadecoction had significant inhibitory effects on the proliferation of two kinds of endometrial cancer cell lines at different concentrations and different time. The inhibition rates of HEC-1A cells in 1.25 mg gourp, 0.625 mg gourp, 0.3125 mg gourp were significantly different at 24 hours and 48 hours (P<0.01). Cell inhibition rate of Ishikawa cell in 5 mg/mL gourp, 2.5 mg/mL gourp, 1.25 mg/mL gourp, 0.625 mg/mL gourp, 0.3125 mg/ml gourp, 0.15625 mg/mL gourp had significant difference (P<0.01,P<0.01). Cell inhibition rate of HEC - 1 A cells and Ishikawa cells in 10 mg gourp, 5 mg gourp, 0.625 mg gourp, 0.078125 mg gourp had significant difference in 24 hours(P<0.01). Compared with normal group , the apoptosis rate of N-butyl alcohol extract fromLianhuadecoctionon was significantly higher. The cell apoptosis rate of high dose of 0.4 mg/mL, middle dose group of 0.2 mg/mL and low dose of 0.1 mg/mL had significant difference compared with normal group in HEC-1A cell(P<0.01). The cell apoptosis rate of high dose of 1.0 mg/mL, middle dose group of 0.5 mg/mL and low dose group of 0.25 mg/mL had significant difference compared with normal group in Ishikawa cell(P<0.05).Conclusion The N-butanol extract fromLianhuadecoction can effectively inhibit the cell proliferation and induce cell apoptosis.

Endometrial cancer; N-butanol extract fromLianhuadecoction; Cell proliferation; Cell apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(81403262)

100700 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院婦科[唐瑤(博士研究生)、包曉霞、魯周南、薛曉鷗]

唐瑤(1985- )，2014級(jí)在讀博士研究生。研究方向:中西醫(yī)結(jié)合治療婦科腫瘤。E-mail:tangyaobeijing@126.com

薛曉鷗(1963- )，女，博士，教授，主任醫(yī)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療婦科內(nèi)分泌及腫瘤。E-mail：Pro_xue@163.com

R711.74

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.06.012

2017-02-19)