馬雙雙 王學勇 劉春生 肖瑤 趙保勝 張馳 李妍芃 王娟 田思敏 馮瓊

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·論著·

基于ITS條形碼的維藥克孜力喬古魯克藥材的分子鑒定研究

馬雙雙 王學勇 劉春生 肖瑤 趙保勝 張馳 李妍芃 王娟 田思敏 馮瓊

目的 對維藥克孜力喬古魯克藥材(Paeoniaeradixhybridae，PRH)的品種進行精準鑒別，同時將其原植物塊根芍藥PaeoniahybridaPall.與窄葉芍藥P.anomalaL.和新疆芍藥P.sinjiangensisK.Y.Pan進行區(qū)分，為保證藥材來源的準確性提供科學依據(jù)。 方法 提取塊根芍藥的DNA，基于內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的核糖體DNA序列(ITS)進行PCR引物擴增并測序，并從GenBank數(shù)據(jù)庫下載塊根芍藥和其原變種窄葉芍藥和近緣種新疆芍藥的ITS序列，采用DNAMAN、Editseq、MeGA5等軟件，計算塊根芍藥種間、種內(nèi)的Kimura 2-parameter(K 2-P)遺傳距離，尋找塊根芍藥的特異位點，并構(gòu)建Neighbor-joining(N-J)系統(tǒng)聚類樹。 結(jié)果 塊根芍藥G+C含量范圍為55.82%～56.45%，與另外兩個種G+C含量未重疊；所有樣本ITS序列的K 2-P遺傳距離范圍為0～0.026，其中種間遺傳距離分布為0.014～0.026，大于塊根芍藥種內(nèi)遺傳距離0.000～0.012；通過序列比對分析，發(fā)現(xiàn)塊根芍藥與另外2個種有6個特異位點；N-J系統(tǒng)聚類樹也將19個樣品聚為兩個大支系，所有塊根芍藥聚為一支，有84%支持率，其中中國地區(qū)分布的塊根芍藥聚為一小支，俄羅斯地區(qū)分布的塊根芍藥親緣關(guān)系較遠。 結(jié)論 經(jīng)過遺傳距離、系統(tǒng)聚類、特異位點分析等系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)ITS序列能區(qū)分塊根芍藥與其原變種窄葉芍藥和近緣種新疆芍藥，可以應用于維藥PRH的精準鑒別，并且在變種與原變種的區(qū)分方面有很大潛力。

克孜力喬古魯克； 塊根芍藥； 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)； 遺傳多樣性； 分子鑒別

維藥克孜力喬古魯克(Paeoniaeradixhybridae，PRH)為維醫(yī)習用藥，來源于毛茛科芍藥屬植物塊根芍藥PaeoniahybridaPall.(又名P. anomala L. var. intermedia C. A. Mey)的干燥塊根[1-2]，藥性為二級干熱，有散阻滯、散氣、祛濕、止血、強壯各器官的功效，用于治療胃病、肝虛、黑膽質(zhì)性病、月經(jīng)不調(diào)、各種出血性疾病[2]，作為新疆民族醫(yī)常用處方制劑買朱尼歐都斯賽力比蜜膏的重要組成，還用于治療濕寒性或黏液質(zhì)性腦部疾病[1]。目前，對PRH的研究主要有定性分析[3]，芍藥苷、多糖和微量元素含量分析[4-7]，芍藥總苷的提取工藝[8]、臨床用藥[9]、藥理作用[10-11]等。研究發(fā)現(xiàn)，PRH含有豐富的多糖、微量元素、黏液質(zhì)等物質(zhì)[2, 5,12]，并且在抗菌[10]、抗血小板凝集[11, 13]、防齲[12]等方面有突出作用，且原植物塊根芍藥P.anomalavar. intermedia生長環(huán)境良好，未受到有機氯類農(nóng)藥的污染[14]。由于新疆地區(qū)地理環(huán)境獨特，生態(tài)環(huán)境復雜等優(yōu)勢，孕育著珍貴的野生中藥資源，具有品種繁多、資源豐富、質(zhì)量上乘等特色[15]，維醫(yī)在心血管病和腦部疾病方面也有獨特療效[1,16]，因此維藥PRH有很好的開發(fā)前景。但是由于維文記載的相關(guān)參考資料缺乏，在藥材來源、鑒別、性質(zhì)等方面有混淆現(xiàn)象，藥材名稱不統(tǒng)一等因素的存在[17-18]，加上傳統(tǒng)鑒別方法(形態(tài)鑒別和理化鑒別)的局限性，新疆分布的芍藥種類繁多等原因，導致其藥材來源同名異物，同物異名現(xiàn)象嚴重，且存在嚴重的種質(zhì)混亂問題，其中新疆芍藥P.sinjiangensisK.Y.Pan和窄葉芍藥P.anomalaL.常被混用為PRH[3-5,7,11,19-20]，且形態(tài)特征不宜區(qū)分，目前對三者的鑒別區(qū)分工作未見詳細報道。《新疆植物志》記載新疆芍藥根供藥用，有活血化瘀、解毒消腫之功，但不同于PRH，為保證PRH的臨床療效，快速有效的精準鑒別成為當務之急。

與現(xiàn)代科技融合是維吾爾醫(yī)藥可持續(xù)發(fā)展的重要策略[21]，分子生物學技術(shù)推進了中藥學科的標準化、規(guī)范化，周洪濤等[22]人曾利用RAPD技術(shù)為赤芍和白芍道地性的形成找到依據(jù)，蔣雨晗等[23]應用ISSR分子標記技術(shù)分析了不同產(chǎn)地白芍的遺傳離和親緣關(guān)系，張旻桓等[24]應用ISSR分析技術(shù)從分子水平上揭示了湖南產(chǎn)牡丹品種間親緣關(guān)系及較高的遺傳多樣性。DNA條形碼技術(shù)的快速發(fā)展打破了傳統(tǒng)鑒定方法的局限性[25]，以其不受形態(tài)特征限制、高效、準確、易于自動化和標準化的特點[26]，成為遺傳分類學不可缺少的工具[27]，并廣泛應用于中藥學科。ITS條形碼因其核苷酸的高度變異性和長度的保守性，尤其適合關(guān)系密切的被子植物的系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定研究[28]，使其用于區(qū)分塊根芍藥與窄葉芍藥和新疆芍藥成為可能。

因此，為保證PRH藥材來源的準確性和規(guī)范化，避免近緣植物的混入而影響PRH臨床療效，本研究立足于成熟的ITS條形碼技術(shù)，標準參照《中國植物志》和《新疆植物志》，對新疆地區(qū)維藥材PRH的源植物塊根芍藥P.hybrida和GenBank注冊的塊根芍藥P.hybrida及其近緣植物新疆芍藥P.sinjiangensis和窄葉芍藥P.anomalaITS序列進行分析，以期對三者進行有效的區(qū)分，并利用ITS條形碼技術(shù)為塊根芍藥的精準鑒別提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物與儀器

收集新疆和田藥材市場的PRH樣本，實驗材料經(jīng)新疆維吾爾醫(yī)學?？茖W校買買提江·阿布都瓦克副教授鑒定為芍藥屬植物塊根芍藥P.hybrida，并存放于北京中醫(yī)藥大學標本館內(nèi)。

PCR儀(Biomerta，德國)、SIGMAA3K-15低溫高速離心機(Sigma，德國)、電泳系統(tǒng)(Bio-Rad公司)、JS-680B全自動凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)；廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京博邁德科技發(fā)展有限公司，批號：70670922)、2×Taq plus pcr mastermix(含染料)(北京博邁德科技發(fā)展有限公司，批號：706586BB)。

1.2 實驗方法

ITS條形碼分析主要包括DNA提取、PCR擴增、凝膠電泳驗證并測序、序列分析、遺傳距離分析和N-J系統(tǒng)聚類樹的構(gòu)建等過程。

1.2.1 DNA提取和PCR擴增 維藥材PRH為塊根類藥材，質(zhì)地堅硬，處理時用枝剪剪成0.5 cm左右的小片段，去皮備用。取樣品3份，先用75%的酒精擦拭表面，用液氮研成細粉，分別按照廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒說明書提取DNA。采用ITS通用引物[29]，上游引物為P1：5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTC-3′；下游引物為P4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，擴增條件為50 μL反應體系：2 × Taq PCR MasterMix 25 μL, 引物P1和P4各2 μL, DNA模版8 μL, ddH2O 13 μL在PCR儀上擴增，擴增條件為94℃預變性5分鐘，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72 ℃延伸1分鐘，40個循環(huán)，72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下檢視，相應位置條帶清晰明亮，說明擴增產(chǎn)物可能是目標產(chǎn)物，送上海生工生物有限公司測序部測序。各樣品采用正向和反向雙向測序，以保證測序的準確性。

1.2.2 序列分析 應用Contig Express軟件對正、反向序列進行拼接、校對，根據(jù)相似度搜索法(Blast方法)所獲相似度最高物種的同屬ITS序列邊界，截取待鑒定物種的ITS序列，用于后續(xù)分析。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載所有塊根芍藥、窄葉芍藥和新疆芍藥的ITS序列，對實驗所得序列和GenBank中已知序列進行多重比較分析，對所有序列選用Kimura 2-parameter(K 2-P)模式的Bootstrap方法，對樣本進行遺傳距離計算和構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。

2 結(jié)果

2.1 ITS序列分析

對本實驗所得塊根芍藥P.hybrida和GenBank下載同種源和其近緣種的19條ITS序列進行分析，其中樣本編號1～11為窄葉芍藥，編號12為新疆芍藥，編號13～19為塊根芍藥(見表1)，其中樣本1、2、3、11和19分布于俄羅斯阿勒泰邊疆地區(qū)的巴爾瑙市郊區(qū)，而其他樣品均分布于中國境內(nèi)。序列全長為643～652 bp，其中塊根芍藥P.hybrid(編號：13、14、15、16和19)和窄葉芍藥P.anomala(編號：1、2、3、4、10和11)的ITS均為643 bp，而新疆芍藥P.sinjiangensis(編號：12)為651 bp，另外8條為ITS不完整序列，長度均為634 bp，塊根芍藥為窄葉芍藥的變種，兩者ITS長度并未發(fā)生明顯變異，但新疆芍藥ITS長度大于塊根芍藥。G+C含量整體分布為55.36 %～56.45 %，其中塊根芍藥中G+C含量分布為55.92 %～56.45 %，而窄葉芍藥的G+C含量為55.36 %～55.67 %，新疆芍藥為55.76 %，G+C含量的整體差異較小，但是種間未重疊，說明三者的親緣關(guān)系相近，但是仍存在明顯的遺傳變異。

2.2 特異位點分析

通過比對ITS序列發(fā)現(xiàn)，塊根芍藥與另外兩個種的所有樣本中都存在堿基序列差異，其中存在6個特異性位點(見表2)可用于區(qū)分塊根芍藥與新疆芍藥和窄葉芍藥，為保證維藥材PRH準確的藥材來源提供了科學依據(jù)。

2.3 遺傳距離分析

對19條ITS序列進行遺傳距離計算(見表1)，全部序列的遺傳距離數(shù)值分布于0～0.026，塊根芍藥的種內(nèi)遺傳距離為0～0.009，種間遺傳距離為0.014～0.026，種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離。最大遺傳距離0.026出現(xiàn)在一條分布于中國地區(qū)的塊根芍藥(編號：17)和4條分布在俄羅斯地區(qū)的窄葉芍藥(編號：1、2、3、11)；分布于俄羅斯地區(qū)的塊根芍藥(編號：19)與分布于中國地區(qū)的塊根芍藥(編號：13～18)的遺傳距離均大于編號為13～18塊根芍藥的種內(nèi)遺傳距離。

2.4 系統(tǒng)聚類樹分析

對所有ITS序列構(gòu)建N-J系統(tǒng)聚類樹(圖1)，上述19個樣品共聚為兩大支系，12條窄葉芍藥和新疆芍藥聚為一大支，其中分布于俄羅斯的窄葉芍藥的四條序列(編號：1、2、3、11)單獨聚為一小支；塊根芍藥的7個序列聚為一大支，支持率為84%，全部與窄葉芍藥和新疆芍藥分開，中國地區(qū)分布的塊根芍藥聚為一小支，有99 %的支持率，而與俄羅斯地區(qū)分布的塊根芍藥(編號：19)親緣關(guān)系較遠。

表1 塊根芍藥與窄葉芍藥和新疆芍藥的ITS序列K 2-P遺傳距離

注： 編號1～11為窄葉芍藥，編號12為新疆芍藥，編號13～19為塊根芍藥；斜體數(shù)據(jù)表示塊根芍藥和新疆芍藥、窄葉芍藥的種間遺傳距離。

表2 塊根芍藥與窄葉芍藥和新疆芍藥的特異位點

注：編號1 ～ 11為窄葉芍藥，編號12為新疆芍藥，編號13 ～ 19為塊根芍藥

圖1 基于ITS序列構(gòu)建的N-J系統(tǒng)聚類樹

3 討論

本研究結(jié)果表明遺傳距離、特異位點、系統(tǒng)聚類樹分析都可以區(qū)分塊根芍藥與其原變種窄葉芍藥和近緣種新疆芍藥，ITS條形碼技術(shù)可用于PRH源藥材的精準鑒別，保證藥材來源的準確性，并且在變種和原變種的區(qū)分方面存在很大潛力。

7條塊根芍藥序列中，序列19的產(chǎn)地來源為俄羅斯阿勒泰地區(qū)的巴爾瑙市郊區(qū)，其他序列均來源于中國，遺傳距離、特異位點和系統(tǒng)聚類樹三方面都支持序列19與其他塊根芍藥的遺傳關(guān)系較遠，由于來源于不同國家地區(qū)，因地理因素、生態(tài)環(huán)境和氣候條件等差異，塊根芍藥的基因型發(fā)生顯著改變，遺傳多樣性豐富，因此，ITS序列可作為塊根芍藥產(chǎn)地劃分的依據(jù)之一。由于塊根芍藥在新疆各地、國外歐洲、西伯利亞和蒙古地區(qū)都有分布[30]，分布地區(qū)廣泛，遺傳多樣性豐富，可能存在明顯的產(chǎn)地趨向變異，有待加大樣本量和產(chǎn)地豐富性揭示塊根芍藥的遺傳多樣性，探究基于ITS序列的塊根芍藥的產(chǎn)地劃分標準。

《中國植物志》和《新疆植物志》規(guī)定，塊根芍藥P.anomalavar. intermedia是窄葉芍藥P.anomala的變種，而新疆芍藥P.sinjiangensis為單獨物種，理論上，塊根芍藥與窄葉芍藥的親緣關(guān)系比窄葉芍藥與新疆芍藥的親緣關(guān)系更近，新疆芍藥的ITS序列長度大于窄葉芍藥和塊根芍藥，支持窄葉芍藥與新疆芍藥的親緣關(guān)系較其與塊根芍藥的親緣關(guān)系遠。但是窄葉芍藥與新疆芍藥之間的遺傳距離小于窄葉芍藥和塊根芍藥之間的遺傳距離，且系統(tǒng)聚類樹將新疆芍藥與窄葉芍藥聚為同一支系，遺傳距離、系統(tǒng)聚類分析等分子生物學證據(jù)并不支持塊根芍藥是窄葉芍藥的變種，反而反應出新疆芍藥和窄葉芍藥的遺傳關(guān)系更近。因此三者的親緣關(guān)系仍需要更深入的研究。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Study of molecular identification of peoniae radix hybridae based on ITS barcode sequence

MAShuangshuang，WANGXueyong,LIUChunsheng，etal.

BeijingUniversityofChineseMedicineTraditionalChineseMedicineCollege，Beijing100102，China

FENGQiong，E-mail：fengqiong64@sina.com

Objective To accurately identify the variety of Paeoniae radix hybridae and distinguishPaeoniahybridaPall. withPaeoniaanomalaL. andPaeoniasinjiangensisK.Y.Pan to provide a scientific basis for ensuring the accuracy of material sources.Methods Total genomic DNA was extracted fromP.hybridaand internal transcribed spacer (ITS) was amplified by PCR and the product sent to sequence. ITS sequences ofP.hybrida,P.anomalaandP.sinjiangensiswere downloaded from GenBank database. Interspecific and intraspecific Kimura 2-parameter(K 2-P) genetic distance, specific site and Neighbor-joining(N-J)system cluster tree were acquired based on softwares of ContigExpress、DNAMAN、Editseq、MeGA5.Results The content of G+C inPaeoniahybridwas ranged from 55.82% to 56.45%, which not overlapped with the other two species; The K 2-P genetic distance of all sequences was ranged from 0 to 0.026. The K 2-P genetic distance of interspecific and intraspecific samples was respectly ranged from 0.014 to 0.026 and 0.000 ～ 0.012; Compared with the other two categories,P.hybridhas 6 specific sites; Total samples were classified into 2 branches which containing one branch ofP.hybridawith 84% in favor. Among of those,P.hybriddistributed in region of China clustered into one small branch, while theP.hybriddistributed in Russia was far away from those in genetic relationship.Conclusion ITS can distinguishP.hybridfromP.anomalaandP.sinjiangensisby genetic distance, systematic cluster tree, site-specific analysis research and could be used for precise discrimination ofPaeoniaeradixhybridaeand have great potential to make a distinction between the varieties and the original variety.

Paeoniae radix hybridae；PaeoniahybridaPall.； ITS； Genetic diversity； Molecular identification

中央本級重大增減支項目(2060302)；北京市自然科學基金(7152094)；新疆科技支撐計劃(201433101)；國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制專項(2014ZX09304307001)

100102 北京中醫(yī)藥大學中藥學院[馬雙雙(碩士研究生)、劉春生、肖瑤、張馳(碩士研究生)、李妍芃(博士研究生)、王娟(碩士研究生)、田思敏(碩士研究生)、王學勇)]，中醫(yī)藥研究院(趙保勝)；北京聯(lián)合大學生物化學工程學院醫(yī)務室(馮瓊)

馬雙雙(1991- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：藥品鑒定、民族藥藥效和物質(zhì)基礎研究。E-mail：mashuang110818@foxmail.com

馮瓊(1964- )，女，本科，主治醫(yī)師。研究方向：臨床醫(yī)學或全科。E-mail：fengqiong64@sina.com

R282.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.06.011

2016-12-12)