袁錚

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·論著·

白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究

袁錚

目的 研究白藜蘆醇(resveratrol，Res)對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用并探討其可能的作用機(jī)制。 方法 采用夾閉雙側(cè)腎蒂血管45分鐘的方法建立缺血再灌注腎損傷大鼠模型并給予不同劑量白藜蘆醇低、中、高劑量[10、20、40 mg/(kg·d)]和銀杏葉提取物[100 mg/(kg·d)]進(jìn)行干預(yù)治療(療程14天)，并另設(shè)模型組和假手術(shù)組。計(jì)算腎臟指數(shù)，生化分析法測(cè)定血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinin，SCr)、尿酸(uric acid，UA)含量，HE染色法觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；比色法檢測(cè)腎臟組織中抗氧化酶活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)；TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡狀況。 結(jié)果 與模型組比較發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇中劑量[20 mg/(kg·d)]組、白藜蘆醇高劑量[40 mg/(kg·d)]組大鼠腎臟指數(shù)顯著降低，血清BUN、SCr、UA含量均顯著降低；腎臟組織病變明顯改善，以白藜蘆醇高劑量組最為顯著；抗氧化酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(cata-lase，CAT)活性顯著升高且MDA含量顯著降低，其中白藜蘆醇高劑量組谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性顯著升高；腎臟組織細(xì)胞凋亡狀況明顯改善、白藜蘆醇中、高劑量組凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)顯著降低；上述差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。 結(jié)論 白藜蘆醇能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡而對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠起到一定的保護(hù)作用。

白藜蘆醇； 腎臟缺血再灌注； 凋亡； 炎癥； 氧化應(yīng)激

腎缺血再灌注損傷是臨床上腎臟手術(shù)、失血、休克時(shí)常見(jiàn)并發(fā)癥，其病理機(jī)制非常復(fù)雜，其中氧化應(yīng)激損傷以及繼發(fā)性細(xì)胞凋亡是腎缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制[1]，這也為研究新型治療藥物提供了思路；既往研究發(fā)現(xiàn)，藥物抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡對(duì)腎缺血再灌注大鼠具有一定的保護(hù)作用[2-3]；白藜蘆醇(resveratrol，Res)是存在于多種植物中的天然多酚類化合物，具有抗氧化、抗凋亡等藥理學(xué)作用[4-5]。但白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠是否具有保護(hù)作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)夾閉雙側(cè)腎蒂血管45分鐘建立缺血再灌注腎損傷大鼠模型并給予不同劑量白藜蘆醇進(jìn)行干預(yù)治療，研究白藜蘆醇對(duì)缺血再灌注腎損傷大鼠的保護(hù)作用并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

白藜蘆醇(陜西慧科植物開發(fā)有限公司，純度≥98%，批號(hào)：140516)；銀杏葉提取物(湖南長(zhǎng)沙惠瑞生物科技有限公司，批號(hào)：1408712)；尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinin，SCr)、尿酸(uric acid，UA)試劑盒均購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司(批號(hào)：150917012、151205009、150825017)；HE試劑盒、TUNEL試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：160114、151128)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào)：20150719、20151008、20150524、20160113)。1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)雄性SD大鼠，120只，7周齡，體重180～220 g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003。

1.3 動(dòng)物模型的制備與分組

參照Chatterjee PK等[6]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法：通過(guò)剝離并用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂血管45分鐘后松夾的方法建立腎缺血再灌注損傷大鼠模型，夾閉雙側(cè)腎蒂血管后腎臟組織變?yōu)榘导t色而松夾后逐漸變回鮮紅色，即可認(rèn)定成功。選取100只模型大鼠隨機(jī)分為模型組、白藜蘆醇低、中、高劑量[10、20、40 mg/(kg·d)]組和銀杏葉提取物組[100 mg/(kg·d)][7]，每組各20只。另取20只同齡大鼠作為假手術(shù)組，假手術(shù)組大鼠行手術(shù)通路但不夾閉腎蒂血管。各治療組于再灌注后立即通過(guò)腹腔注射給藥，療程2周，模型組和假手術(shù)組分別同步給予等體積的生理鹽水。1.4 腎臟指數(shù)的計(jì)算

稱量體質(zhì)量，麻醉后取腎臟組織并稱量左側(cè)腎臟組織重量，腎臟指數(shù)計(jì)算公式：腎臟指數(shù)=左側(cè)腎臟重量/體重

1.5 血清腎功能指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)施麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并離心，1500 r/min，10分鐘，取上清，由生化分析儀測(cè)定各組大鼠血清BUN、SCr、UA含量。

1.6 腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變的觀察

取1.4稱量后的左腎，經(jīng)4%的多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片、展片和脫蠟水化處理后，行常規(guī)蘇木精—尹紅(HE)染色，然后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

1.7 腎臟組織中抗氧化酶活性及MDA含量測(cè)定

參照1.4方法取右側(cè)腎臟組織，經(jīng)研磨勻漿處理后離心，3000 r/min，10分鐘，取上清，按照各試劑盒操作方法步驟，采用比色法通過(guò)紫外—可見(jiàn)分光度計(jì)測(cè)定各組大鼠腎臟中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

1.8 腎細(xì)胞凋亡狀況的觀察

取1.6制備的腎臟組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟水化處理后按照TUNEL試劑盒操作方法步驟進(jìn)行染色處理，通過(guò)顯微鏡觀察腎細(xì)胞凋亡狀況并照相保存。每張染色切片在相同部位選取互不重疊的5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，然后計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)：AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟指數(shù)的影響

模型組大鼠腎臟指數(shù)較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)；而腎臟缺血再灌注損傷大鼠經(jīng)白藜蘆醇中劑量、白藜蘆醇高劑量治療14天后腎臟指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷 大鼠腎臟指數(shù)的影響 ±s)

注： 與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

2.2 白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎功能監(jiān)測(cè)指標(biāo)的影響

模型組大鼠血清BUN、SCr、UA含量較假手術(shù)組均顯著升高(P<0.01)；而腎臟缺血再灌注損傷大鼠經(jīng)白藜蘆醇中劑量、白藜蘆醇高劑量治療14天后血清BUN、SCr、UA含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表2。2.3 白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

假手術(shù)組大鼠腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常；模型組大鼠腎臟組織呈現(xiàn)：腎小球系膜增生、體積增大，細(xì)胞空泡變性，間質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等明顯的病變；而腎臟缺血再灌注損傷大鼠經(jīng)白藜蘆醇治療14天后腎臟組織病變情況明顯改善，以白藜蘆醇高劑量組效果最為顯著。見(jiàn)圖1。

注： A.假手術(shù)組；B.模型組；C.白藜蘆醇低劑量組； D.白藜蘆醇中劑量組；E.白藜蘆醇高劑量組； F.銀杏葉提取物組

圖1 白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(HE×200)

2.4 白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織中抗氧化酶活性和MDA含量的影響

模型組大鼠腎臟組織中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性較假手術(shù)組顯著降低，而MDA含量顯著升高(P<0.01)；腎臟缺血再灌注損傷大鼠經(jīng)白藜蘆醇中劑量、白藜蘆醇高劑量治療14天后腎臟組織中抗氧化酶SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，白藜蘆醇高劑量組抗氧化酶GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎功能監(jiān)測(cè)指標(biāo)的影響±s)

注： 與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表3 白藜蘆醇對(duì)模型大鼠腎臟組織中抗氧化酶活性和MDA含量的影響±s)

注： 與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

2.5 白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡狀況的影響

與假手術(shù)組比較發(fā)現(xiàn)模型組大鼠陽(yáng)性著色細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)數(shù)量明顯增多，而腎臟缺血再灌注損傷大鼠經(jīng)白藜蘆醇治療14天后腎臟組織凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少，以白藜蘆醇高劑量組效果最為顯著。見(jiàn)圖2。

注： A.假手術(shù)組；B.模型組；C.白藜蘆醇低劑量組； D.白藜蘆醇中劑量組；E.白藜蘆醇高劑量組； F.銀杏葉提取物組

圖2 白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡狀況的影響(TUNEL×400)

模型組大鼠腎臟組織細(xì)胞AI較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)，而腎臟缺血再灌注損傷大鼠經(jīng)白藜蘆醇中劑量、白藜蘆醇高劑量治療14天后腎臟組織細(xì)胞AI顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表4。

3 討論

近年來(lái)，病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激以及繼發(fā)性細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷重要的病理機(jī)制[2-3]，這也為藥物研發(fā)提供了新的思路。白藜蘆醇具有抗氧化、抗凋亡等多種藥理學(xué)作用[4-5]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)白藜蘆醇干預(yù)治療14天能夠有效降低缺血再灌注腎損傷大鼠腎臟指數(shù)，降低血清BUN、SCr、UA含量，改善腎臟組織病變，降低氧化應(yīng)激損傷，抑制腎臟組織細(xì)胞凋亡，提示白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與降低氧化應(yīng)激損傷和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

表4 白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷 大鼠腎臟組織細(xì)胞AI的影響±s)

注： 與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

體內(nèi)氧自由基(ROS)過(guò)剩是氧化應(yīng)激損傷的病理基礎(chǔ)，常態(tài)下ROS的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，其中抗氧化酶 (SOD、CAT、GSH-Px)對(duì)ROS的清除發(fā)揮著重要的催化作用[8-9]；當(dāng)缺血再灌注后隨著ROS過(guò)剩而攻擊細(xì)胞膜造成臟器脂質(zhì)過(guò)氧化而生產(chǎn)MDA，因此MDA含量間接反映氧化應(yīng)激損傷程度[10]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)白藜蘆醇(20～40 mg/kg)干預(yù)治療能夠顯著改善腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性并降低MDA含量，提示白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷具有一定抑制作用。

總之，白藜蘆醇對(duì)腎臟缺血再灌注損傷大鼠具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與白藜蘆醇改善抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性、降低氧化應(yīng)激損傷以及抑制腎臟組織細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Protective effects and mechanism of resveratrol on the rats with renal ischemic-reperfusion injury

YUANZheng.

SeconddepartmentofNephrology，HandanMunicipalCentralHospital，Handan056001，China

YUANZheng，E-mail：hdyuanzheng@163.com

Objective To investigate the protective effects and mechanism of resveratrol (Res) on the rats with renal ischemic-reperfusion injury.Methods The rat models with renal ischemic-reperfusion injury were induced by clipping bilateral renal pedicle vascular for 45min and the rats were treated with Res low-dose, medium-dose and high-dose [10, 20, 40 mg/(kg·d) ] and ginkgo biloba extract [EGb, 100 mg/(kg·d)] for 14d, and set model group and sham operation group. The renal index was calculated; the content of BUN, SCr, UA in serum were determined; the pathological changes of the renal tissue were observed by HE staining; the activity of antioxidase and the content of MDA in renal tissue were determined by colorimetry; the apoptosis of renal cells was observed by TUNEL staining.Results Compared with model group, the renal index in Res medium-dose and high-dose groups were significantly decreased; the content of BUN, SCr, UA in serum were significantly decreased; the pathological changes were significantly improved, especially the Res high-dose treated group; the activity of SOD, CAT in renal tissue were significantly increased and the content of MDA was significantly decreased, and the activity of GSH-Px in Res 40 mg/(kg·d) group was significantly increased; the apoptosis in Res groups were significantly improved, especially the apoptosis index in Res medium-dose and high-dose treated groups were significantly decreased; all of the difference above were significant(P<0.05,P<0.01).Conclusion Res has protective effects on the rats with renal ischemic-reperfusion injury, which perhaps related to its effects of inhibiting oxidative stress and apoptosis.

Resveratrol; Renal ischemic-reperfusion; Apoptosis; Inflammation; Oxidative stress

056001 邯鄲市中心醫(yī)院腎內(nèi)二科

袁錚(1981- )，女，本科，主治醫(yī)師。研究方向：腎疾病相關(guān)研究。E-mail：hdyuanzheng@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.06.008

2016-09-04)